Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Het algemene doel van deze methode is om de structuur van de hartmatrix te visualiseren in afwezigheid van cellen of andere niet-matrixmaterialen. Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden op het gebied van fibrose, vooral hoe verschillen in de inhoud van de matrix de organisatie van de matrix kunnen beïnvloeden, en hoe deze veranderingen verschillende cardiomyopathieën of andere fibrotische ziekten kunnen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een kwalitatief beeld van de matrix biedt dat kan worden gebruikt om kwantitatieve metingen te verbeteren.

Dr. Galindo en Dr. Sawyer hadden voor het eerst het idee om deze techniek te gebruiken nadat ze ontdekten dat reguliere behandeling van post-infarctvarkens veranderingen in genexpressie had die vergelijkbaar waren met veranderingen in matrixinhoud na behandeling. Personen die nieuw zijn met deze methode, kunnen worstelen als ze geen eerdere SEM-monstervoorbereidingservaring hebben, vanwege de fijne motorische vaardigheden die vereist zijn. Het weefselmonster moet groot genoeg zijn om gemakkelijk te zien en moet worden bewaard in een oplossing van vier procent glutaaraldehyde bij vier graden Celsius.

Haal het weefsel uit de koude opslag en spoel het af in gedistilleerd water. Dompel het weefsel vervolgens in een oplossing van 10 procent natriumhydroxide, vers gemaakt van pellets in water. Zorg ervoor dat u de juiste voorzorgsmaatregelen neemt.

Bewaar het weefsel in de natriumhydroxide-oplossing gedurende zes tot 10 dagen op kamertemperatuur. Ga verder wanneer de kleur van het weefsel verkleurd of wit wordt. Spoel vervolgens het weefsel af met gedistilleerd water tot het transparant wordt.

Trek vervolgens handschoenen aan en dompel het weefsel vier uur lang in een oplossing van één procent tanninezuur bij kamertemperatuur. Na het tanninezuurbad, spoel het weefsel overnacht in gedistilleerd water. Maak ter voorbereiding, in een afzuigkap en met handschoenen, een 0,2 molare stamoplossing van natriumcacodylaatbuffer en een twee procent waterige stamoplossing van osmiumtetraoxide.

Gebruik een spatbeschermer, omdat osmiumtetraoxide een ernstig inhalatiegevaar is. Maak nu een 0,1 molare verdunning van de natriumcacodylaatbuffer en incubeer het weefsel erin gedurende vijf minuten met zachte agitatie. Ververs de buffer twee keer om het weefsel in totaal drie keer met natriumcacodylaat te wassen.

Maak vervolgens een een-op-een mengsel van de natriumcacodylaat-stamoplossing en de osmiumtetraoxide-stamoplossing. Incubeer het weefsel in het nieuwe mengsel gedurende een uur op een rotator. Breng het weefsel later terug naar 0,1 molaire natriumcacodylaat en incubeer het gedurende vijf minuten met zachte agitatie.

Ververs deze badoplossing twee keer gedurende 15 minuten. Ontwater vervolgens het weefsel met behulp van een reeks ethanolbaden met toenemende concentraties. Laat het weefsel 15 minuten in elk bad weken met zachte agitatie.

Breng vervolgens weefsel en oplossing over naar een ondiepe petrischaal gevuld met 100 procent ethanol. Houd vervolgens zorgvuldig twee zeer scherpe scheermessen vast zodat de vlakke zijden elkaar raken en de snijkanten kruisen om twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het specimen te vormen. Gebruik uw dominante hand om het tweede mes ver naar links van het monster te plaatsen en snijd naar rechts.

Schuif de messen dus tegen elkaar vanuit tegenovergestelde richtingen om een enkele gladde snede te maken met minimale vervorming of scheurtrek. Het doel is om zoveel mogelijk oppervlakte te blootleggen zonder het specimen te beschadigen. Herhaal het proces totdat er voldoende bevredigende dwarsdoorsneden zijn voorbereid voor onderzoek door SEM.

Gebruik een spatel of pincet om het weefsel over te brengen naar de monsterhouder van de CPD, terwijl het weefsel in 100 procent ethanol gedrenkt blijft. Het weefsel mag niet langer dan een paar seconden aan de lucht worden blootgesteld. Gebruik de CPD om het ethanol te vervangen door vloeibaar koolstofdioxide en voer de droogcyclus uit zoals aangegeven door de fabrikant.

Bereid vervolgens een SEM-monsternaaf voor elk specimen. Hecht een koolstofkleeflabel aan het bovenoppervlak van de aluminium naaf. Plaats onder een stereoscoop het specimen voorzichtig op het kleeflabel met de dwarsdoorsnede van interesse naar boven, weg van het label en maximaal vlak met het naafoppervlak.

Probeer of raak niet de oppervlakte van interesse. Voor de kleinste, moeilijkste specimens, breek de houten applicatorstok om deze als spatel te gebruiken. Werk ook op een groot stuk filterpapier om te voorkomen dat een gevallen specimen verloren gaat.

Voor betere hechting, gebruik een gebroken applicatorstok om een taps toelopend penseel te maken en breng zilver of koolstofverf aan op de basis en zijden van het specimen. Breng een zeer dunne verflijn tot aan een rand van de oppervlakte van interesse. Dit zal een laadweg van de oppervlakte van interesse naar de grond maken.

Breng vervolgens twee of drie kleine stippen verf aan rond de omtrek van het koolstoflabel om een geleidende weg te bieden van het oppervlak van het label naar de metalen naaf. Dit functioneert als de grond. Zet het specimen opzij en laat de geleidende verf twee uur drogen.

Eenmaal gedroogd, gebruik een sputtercoater om een relatief zware laag goudpalladiumlegering of goud op het specimen aan te brengen. Een coating van 30 tot 40 nanometer dik is gewenst. Voer de rasterelektronenmicroscopie uit bij een relatief lage versnellingsspanning om problemen geassocieerd met slechte ladingsdissipatie in het monster te minimaliseren.

Gebruik de variabele drukmodus als deze beschikbaar is. Verbeter eerst de werkafstand om voldoende scherptediepte te bieden om te focussen op vezels in de Z-dimensie. Om dit te doen, opent u het tabblad Navigatie rechtsboven.

Ga vervolgens naar het tabblad Coördinaten vanuit het stagemenu. Voer daarin een grotere waarde in voor de Z-coördinaat, zoals 20 millimeter. Druk tenslotte op Ga naar om de wijziging uit te voeren