Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix
June 14th, 2016
Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.
Het algemene doel van deze methode is om de structuur van de hartmatrix te visualiseren in afwezigheid van cellen of andere niet-matrixmaterialen. Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden op het gebied van fibrose, vooral hoe verschillen in de inhoud van de matrix de organisatie van de matrix kunnen beïnvloeden, en hoe deze veranderingen verschillende cardiomyopathieën of andere fibrotische ziekten kunnen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een kwalitatief beeld van de matrix biedt dat kan worden gebruikt om kwantitatieve metingen te verbeteren.
Dr. Galindo en Dr. Sawyer hadden voor het eerst het idee om deze techniek te gebruiken nadat ze ontdekten dat reguliere behandeling van post-infarctvarkens veranderingen in genexpressie had die vergelijkbaar waren met veranderingen in matrixinhoud na behandeling. Personen die nieuw zijn met deze methode, kunnen worstelen als ze geen eerdere SEM-monstervoorbereidingservaring hebben, vanwege de fijne motorische vaardigheden die vereist zijn. Het weefselmonster moet groot genoeg zijn om gemakkelijk te zien en moet worden bewaard in een oplossing van vier procent glutaaraldehyde bij vier graden Celsius.
Haal het weefsel uit de koude opslag en spoel het af in gedistilleerd water. Dompel het weefsel vervolgens in een oplossing van 10 procent natriumhydroxide, vers gemaakt van pellets in water. Zorg ervoor dat u de juiste voorzorgsmaatregelen neemt.
Bewaar het weefsel in de natriumhydroxide-oplossing gedurende zes tot 10 dagen op kamertemperatuur. Ga verder wanneer de kleur van het weefsel verkleurd of wit wordt. Spoel vervolgens het weefsel af met gedistilleerd water tot het transparant wordt.
Trek vervolgens handschoenen aan en dompel het weefsel vier uur lang in een oplossing van één procent tanninezuur bij kamertemperatuur. Na het tanninezuurbad, spoel het weefsel overnacht in gedistilleerd water. Maak ter voorbereiding, in een afzuigkap en met handschoenen, een 0,2 molare stamoplossing van natriumcacodylaatbuffer en een twee procent waterige stamoplossing van osmiumtetraoxide.
Gebruik een spatbeschermer, omdat osmiumtetraoxide een ernstig inhalatiegevaar is. Maak nu een 0,1 molare verdunning van de natriumcacodylaatbuffer en incubeer het weefsel erin gedurende vijf minuten met zachte agitatie. Ververs de buffer twee keer om het weefsel in totaal drie keer met natriumcacodylaat te wassen.
Maak vervolgens een een-op-een mengsel van de natriumcacodylaat-stamoplossing en de osmiumtetraoxide-stamoplossing. Incubeer het weefsel in het nieuwe mengsel gedurende een uur op een rotator. Breng het weefsel later terug naar 0,1 molaire natriumcacodylaat en incubeer het gedurende vijf minuten met zachte agitatie.
Ververs deze badoplossing twee keer gedurende 15 minuten. Ontwater vervolgens het weefsel met behulp van een reeks ethanolbaden met toenemende concentraties. Laat het weefsel 15 minuten in elk bad weken met zachte agitatie.
Breng vervolgens weefsel en oplossing over naar een ondiepe petrischaal gevuld met 100 procent ethanol. Houd vervolgens zorgvuldig twee zeer scherpe scheermessen vast zodat de vlakke zijden elkaar raken en de snijkanten kruisen om twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het specimen te vormen. Gebruik uw dominante hand om het tweede mes ver naar links van het monster te plaatsen en snijd naar rechts.
Schuif de messen dus tegen elkaar vanuit tegenovergestelde richtingen om een enkele gladde snede te maken met minimale vervorming of scheurtrek. Het doel is om zoveel mogelijk oppervlakte te blootleggen zonder het specimen te beschadigen. Herhaal het proces totdat er voldoende bevredigende dwarsdoorsneden zijn voorbereid voor onderzoek door SEM.
Gebruik een spatel of pincet om het weefsel over te brengen naar de monsterhouder van de CPD, terwijl het weefsel in 100 procent ethanol gedrenkt blijft. Het weefsel mag niet langer dan een paar seconden aan de lucht worden blootgesteld. Gebruik de CPD om het ethanol te vervangen door vloeibaar koolstofdioxide en voer de droogcyclus uit zoals aangegeven door de fabrikant.
Bereid vervolgens een SEM-monsternaaf voor elk specimen. Hecht een koolstofkleeflabel aan het bovenoppervlak van de aluminium naaf. Plaats onder een stereoscoop het specimen voorzichtig op het kleeflabel met de dwarsdoorsnede van interesse naar boven, weg van het label en maximaal vlak met het naafoppervlak.
Probeer of raak niet de oppervlakte van interesse. Voor de kleinste, moeilijkste specimens, breek de houten applicatorstok om deze als spatel te gebruiken. Werk ook op een groot stuk filterpapier om te voorkomen dat een gevallen specimen verloren gaat.
Voor betere hechting, gebruik een gebroken applicatorstok om een taps toelopend penseel te maken en breng zilver of koolstofverf aan op de basis en zijden van het specimen. Breng een zeer dunne verflijn tot aan een rand van de oppervlakte van interesse. Dit zal een laadweg van de oppervlakte van interesse naar de grond maken.
Breng vervolgens twee of drie kleine stippen verf aan rond de omtrek van het koolstoflabel om een geleidende weg te bieden van het oppervlak van het label naar de metalen naaf. Dit functioneert als de grond. Zet het specimen opzij en laat de geleidende verf twee uur drogen.
Eenmaal gedroogd, gebruik een sputtercoater om een relatief zware laag goudpalladiumlegering of goud op het specimen aan te brengen. Een coating van 30 tot 40 nanometer dik is gewenst. Voer de rasterelektronenmicroscopie uit bij een relatief lage versnellingsspanning om problemen geassocieerd met slechte ladingsdissipatie in het monster te minimaliseren.
Gebruik de variabele drukmodus als deze beschikbaar is. Verbeter eerst de werkafstand om voldoende scherptediepte te bieden om te focussen op vezels in de Z-dimensie. Om dit te doen, opent u het tabblad Navigatie rechtsboven.
Ga vervolgens naar het tabblad Coördinaten vanuit het stagemenu. Voer daarin een grotere waarde in voor de Z-coördinaat, zoals 20 millimeter. Druk tenslotte op Ga naar om de wijziging uit te voeren
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerd hartweefsel. De techniek heeft tot doel het begrip van de matrixorganisatie en de implicaties ervan in verschillende fibrotische aandoeningen te verbeteren.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Hartweefselanalyse
- Visualisatie van de extracellulaire matrix
- Fibroseonderzoek
Achtergrond
- De methode richt zich op de hartmatrix zonder cellulaire componenten.
- Het behandelt vragen met betrekking tot matrixinhoud en -organisatie.
- Inzichten die worden opgedaan, kunnen de kennis over cardiomyopathieën verbeteren.
- Eerder onderzoek wees op genexpressieveranderingen die verband houden met matrixinhoud.
Doel van de studie
- Om de structuur van de hartmatrix in een gedecellulariseerde omgeving te visualiseren.
- Om de relatie tussen matrixsamenstelling en fibrotische ziekten te onderzoeken.
- Om kwalitatieve inzichten te bieden die kwantitatieve gegevens aanvullen.
Gebruikte methoden
- Decellularisatie van hartweefsels
- Scanning elektronenmicroscopie (SEM) voor visualisatie
- Bemonsteringsvoorbereiding met glutaraldehyde-fixatie
- Opslag van monsters bij gecontroleerde temperaturen
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de structuur van de extracellulaire matrix.
- Identificatie van variaties in matrixorganisatie.
- Correlatie van matrixinhoud met kenmerken van fibrotische ziekten.
- De methode toonde potentieel voor verdere onderzoekstoepassingen.
Conclusies
- De techniek biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hartfibrose.
- Het verbetert het begrip van matrixgerelateerde pathologieën.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische wegen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding extracellular matrix ultrastructure is critical for de-risking cardiac fibrosis targets in early discovery. This method provides qualitative structural insights that complement quantitative fibrosis assays, enabling mechanistic validation of matrix-targeted hypotheses. It supports predictive confidence in lead identification by revealing how matrix organization influences disease progression and therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of matrix architecture to interrogate therapeutic hypotheses about fibrosis mechanisms.
- Operational Value: Provides a qualitative benchmark for assessing matrix-targeted compound effects on tissue ultrastructure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ultrastructural reference standards for assay validation and compound screening in fibrosis models.
- Operational Value: Supports development of reproducible, matrix-focused readouts for high-content imaging platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation of matrix remodeling with disease phenotypes across preclinical models.
- Operational Value: Enables cross-species comparison of matrix structure to improve translational relevance of fibrosis studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, providing structural context for matrix-modulating interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how matrix composition influences organization in fibrotic versus healthy tissue.
- Screening: Delivers qualitative outputs that help triage compounds based on their impact on matrix architecture.
- Analytics: Yields structural metrics (e.g., fiber spacing, pore size) that inform quantitative structure-function relationships.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by allowing direct comparison of matrix ultrastructure across species and disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for matrix characterization across multiple fibrosis indications and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibrosis research by providing direct visualization of extracellular matrix organization.
- Operational Value: Standardizes matrix evaluation through reproducible decellularization and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound effects to observable changes in matrix ultrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of matrix-targeted therapeutics based on structural validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, electron microscopy, and hazardous chemical handling (e.g., osmium tetroxide, sodium hydroxide).
- Dependent on access to SEM, critical point dryer, sputter coater, and fume hood infrastructure.
- Necessitates standardized SOPs for tissue decellularization, staining, and mounting to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for different tissue types (e.g., cardiac, hepatic, pulmonary) due to varying matrix density and cross-linking.
- Limited by the destructive nature of the process, precluding longitudinal analysis of the same sample.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Decellularization of Heart Tissue Specimen
2:20
Osmication, Dehydration and Cross-sectioning for SEM
4:32
Critical Point Drying (CPD) and Mounting for SEM
6:33
SEM Examination of Heart Tissue Specimens
8:18
Results: Structural and Quantitative Analyses
9:22
Conclusion
