Name: Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer scanning electron microscopy van gemacereerde hartweefsel om de extracellulaire matrix te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers de structuur en organisatie van de matrix te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Beeldvorming en weefselverwerking (na NaOH maceratie) werden uitgevoerd met behulp van de Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (ondersteund door NIH-subsidies CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 en EY08126). We zijn vooral dankbaar aan de VUMC CISR kerndirecteuren (Dr. Sam Wells en Dr. W. Gray (Jay) Jerome) voor waardevolle technische adviezen en ook voor het verstrekken van kernruimte en -middelen voor het filmen van de in dit artikel beschreven techniek. 
We willen onze diepste waardering uitspreken voor Dr. Yan Ru Su en Ms. Kelsey Tomasek in het Cardiology Core Lab voor Translationele en Klinisch Onderzoek aan de Vanderbilt University voor het verstrekken van technische expertise en het verzamelen van menselijke weefselmonsters die in deze studie werden gebruikt.

Ethiek Verklaring: De protocollen voor de behandeling van dieren werden goedgekeurd door de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, protocollen nummer M / 10/117 (varkens) en M / 10/219 (muizen) en uitgevoerd volgens AAALAC-Internationale normen. het gebruik van opgespaarde menselijk hartweefsel werd goedgekeurd door de Vanderbilt University Medical Center IRB (protocol nummer 100887). 1. Monsterneming en opslag <ol><li> Voeg vers 4% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) oplossing. LET OP: Glutaaraldehyde is giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast. <ol><li> Maak een 0,2 M voorraad oplossing van PB, pH 7,4 met behulp van 21,8 g Na 2 HPO 4 en 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) tot 1000 ml dH 2 O. </li><li> Voeg 400 ul van 50% glutaaraldehyde tot 2,5 ml PB voorraadoplossing en 2,1 ml dH 2 O. </li></ol></li><li> Dompel een stuk (niet groter dan 2 cm 2) van weefsel in de 4% glutaaraldehyde oplossing. Opmerking: kleinere stukken kunnen ook worden gebruikt, maar van voldoende omvang (niet kleiner dan 5 mm 2) gemakkelijk worden gevisualiseerd door het oog om latere stappen van het protocol te vergemakkelijken moet worden. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, bewaar oneindig bij 4 ° C. </li></ol> 2. Decellularisatie van hartweefsel <ol><li> Voeg verse 10% NaOH waterige oplossing met 10 g NaOH pellets / 100 ml dH 2 O. LET OP: NaOH oplossingen zijn bijtend en kan alkali-brandwonden veroorzaken, draag handschoenen. </li><li> Spoel weefsel in dH 2 O. </li><li> Incubeer in 10% NaOH-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 6-10 dagen (tot weefselveranderingen van roodbruine tot gebroken wit of wit). </li><li> Spoel in dH 2 O tot weefsel transparant wordt. </li><li> Dompel weefsel in 1% looizuur gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik 1 ml 5% stamoplossing per 4 ml dH 2 O. LET OP: Looizuuris een sterk irriterend, handschoenen dragen. </li><li> Spoel in dH 2 O &#39;s nachts. </li></ol> 3. Osmication en uitdroging van hartweefsel (in de zuurkast voor de veiligheid) <ol><li> Voeg een 0,2 M voorraadoplossing van natrium cacodylaatbuffer middels 21,4 g natriumcacodylaat, 10,0 g calciumchloride en 450 ml dH 2 O. Mix, voeg zoutzuur als nodig om de pH op 7,4. Q tot 500 ml met dH 2 O. LET OP: natriumcacodylaat en zoutzuur zijn giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast. </li><li> Maak 2% waterige voorraad oplossing van osmiumtetroxide in zuurkast voor de veiligheid door het oplossen van 1 g osmiumtetroxide kristallen in 50 ml dH 2 O. LET OP: osmiumtetroxide is een ernstig gevaar bij inademing; damp fixatie van slijmvliezen of oogbollen mogelijk is, vandaar behandelen alleen in de zuurkast met handschoenen. Een spatscherm wordt aanbevolen. </li><li> Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix voorraad oplossing 1: 1 met dH <sub&gt; 2 O) gedurende 5 minuten op rotator (of zacht schudden). </li><li> Herhaal vorige stap tweemaal voor een totaal van drie spoelingen buffer. </li><li> Dompel weefsel in 1% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix stock natriumcacodylaat en stock osmiumtetroxide 1: 1) op rotator gedurende 1 uur. </li><li> Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer 3 keer per rotator op 5 min. </li><li> Spoel weefsel met behulp van toenemende concentraties aan ethanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, en tenslotte 100%) gedurende 15 min op elke rotator. </li></ol> 4. Dwarsdoorsnede Oppervlaktebehandeling voor SEM <ol><li> Transfer weefsel in 100% ethanol tot een ondiepe petrischaal ook met 100% ethanol. </li><li> Houd twee scherpe scheermesjes zodat de vlakke zijden van de zijden in contact met elkaar en de snijranden kruis twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het monster te vormen. Om dit te bereiken, gebruiken de linkerhand een mes te plaatsen aan de rechterkant van het monster encut naar links. Op hetzelfde moment, met de rechterhand op het tweede mes te plaatsen op de uiterst links van het monster en slice naar rechts. Zo zal de lamellen worden geschoven tegen elkaar uit tegengestelde richting een gladde snede te maken. </li><li> Schuif de platte zijkanten tegen elkaar om een ​​zeer zuivere snede van het monster met minimale vervorming of scheuren kracht te maken, bij voorkeur zo groot mogelijk oppervlak bloot mogelijk zonder beschadiging van het monster. </li><li> Herhaal dit voor elk monster aan de schoonst mogelijke dwarsdoorsnede oppervlakken bloot te leggen voor het onderzoek in de SEM. </li></ol> 5. Critical Point Drogen (CPD) van hartweefsel <ol><li> Gebruik een spatel of pincet om weefsel te dragen aan de monsterhouder van het kritische punt droger (CPD), zodat weefsel blijft 100% ethanol te allen tijde. Opdat de houder wordt ondergedompeld in ethanol en dat de overdracht voltooid met het weefsel blootgesteld aan lucht niet langer dan enkele seconden. </li><li> Bedien CPD per onshandleiding er zo op 3 purge-and-fill volledige cycli om ethanol te vervangen door vloeibare kooldioxide. </li><li> Bedien CPD per gebruikershandleiding om kritisch punt drogen van de monsters te bereiken en breng ze terug naar de atmosferische druk met gecontroleerde ontluchting van CO 2. </li></ol> 6. Montage van het Hart van weefselmonsters voor SEM <ol><li> Bereid een SEM monster stub voor elk monster, door het hechten van een tab koolstofkleefband op het bovenoppervlak van de aluminium strook. </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop, zorgvuldig houden het monster dat u de sticker met de doorsnede oppervlak van belang naar boven (weg van het tabblad, zichtbaar), en zo dicht mogelijk bij de parallel met het vlak van het monster stomp oppervlak. Niet sonde en raak het oppervlak van belang. </li><li> Breek een houten applicator stok om een ​​taps toelopende borstel, ideaal voor het aanbrengen van verf te bereiken. Solliciteer zilver of carbon verf op de bodem en zijkanten van het monster, om de naleving van de stomp te verbeteren. </li><li> Breiden een zeer dunne lijn van zilver of koolstof verf tot een rand van het oppervlak plaats, een lading weg van het oppervlak van belang aarding. </li><li> Toepassen 2 of 3 kleine dabs zilver of koolstof verf rond de omtrek van de lip koolstof, een geleidend pad van de tab kooloppervlak de metalen strook en aldus naar aarde. </li><li> Met geleidende verf drogen gedurende twee uur. </li><li> Bedien sputter coater per gebruikershandleiding om een ​​relatief zware coating (doelbereik van 30 - 40 nm) van toepassing zijn van goud-palladium legering of goud. Pomp specimen kamer tot ongeveer 0,1 mbar; Timer instellen op 40 sec. Open Set klep op de 8:00 positie (matig Argon gas flow). Druk op Start om sputter coating starten bij 30 mA. Paarse gloed lozing moet zichtbaar zijn in het monster kamer zijn. </li></ol> 7. SEM onderzoek van Hart weefselmonsters <ol><li> Voer aftastelektronenmicroscopie bij relatief lage versnellingsspanning beeldvormende p minimaliserenroblemen geassocieerd met een slechte lading dissipatie in de steekproef (opladen). Suggereerde aanvankelijk imaging aandoening zijn: 5 kV versnellende voltage, 10 mm werkafstand. </li><li> Met de hulp van een ervaren operator, in dienst verhoogd werkafstand om de scherptediepte te breiden in de beeldvorming als voorwaarde stellen dat de focus van de vezels in meerdere focale vliegtuigen, of vezels die zich uitstrekt voor aanzienlijke lengte in de z-dimensie. <ol><li> Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), bij de toegang gebruikersinterface de tab-navigatie rechtsboven. </li><li> Open het tabblad Coördinaten uit het werkgebied menu. Om werkafstand te verhogen, voert u een grotere waarde in millimeters voor de Z-coördinaat dan klikt u op Ga naar het tabblad om het monster etappe naar de ingevoerde werkafstand. </li></ol></li><li> Met behulp van een ervaren operator, gebruik model draaipunt en het oppervlak van belang orthogonaal positioneren de elektronenbundel. Extra helling van 10 tot 30 grees vanuit deze positie kunnen observatie en documentatie van de matrix structuur te verbeteren. <ol><li> Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), in de gebruikersinterface, klik en houd de rechter muisknop en schuif naar links of rechts om het monster in de buurt van de periferie van het voorbereide oppervlak vlak van belang richten, wijzend op de gerichte werkafstand . </li><li> Navigeren met de Manual User Interface joystick om te bewegen in de buurt van de tegenoverliggende rand van het oppervlak en herhaal focus. Als werkafstand is ongeveer gelijk aan de eerste positie, tilt specimen bij benadering akkoord op beide locaties via het tabblad Coördinaten van het werkgebied menu (zie 7.2) en voer een tilt waarde in de T-coördinaat te bereiken. </li><li> Draai specimen negentig graden (in te voeren waarde in R Coördineren veld) en herhaal het proces totdat alle posities zijn gericht op ongeveer dezelfde werkafstand. Opmerking: Variabele druk SEM kunnen worden toegepast om lading dissipatie verbeterenindien beschikbaar. Hoog vacuüm is de standaard modus voor het scannen elektronenmicroscopie. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dwarsdoorsnede voorbereiding van het oppervlak is de meest kritische fase in het protocol. Om fijne structuur te behouden, moeten gedroogde exemplaren in 100% ethanol blijven te allen tijde tot ingevoerd om het kritische punt droogproces. Daarom is het snijden van de monsters te bereiken oppervlakken voor EM-onderzoek moet worden gedaan, terwijl monsters worden ondergedompeld in ethanol in een ondiepe schaal. Het is ook belangrijk dat het blootgestelde oppervlak niet wordt aangeraakt of geprobed tijdens daaropvolgende b...

Fibrose verstoort het normale myocardium collageennetwerk, wat cruciaal is voor normale mechanistische functies van cardiomyocyten 1,2 en ook voor intercellulaire communicatie, intracellulair signaalgedrag en celoverleving 3. De ontwikkeling van fibrose is een belangrijke bepalende factor voor de hartfunctie, en fibrotisch remodelleren van het cardiale interstitium dat voortkomt uit verschillende etiologieën leidt tot verhoogde linksventriculaire stijfheid en diastolische disfunctie 4. Myocardfibrose kan ook leiden tot aritmieën, en of de progressie van fibrotisch remodelleren een algemeen of lokaal fenomeen is, het is sterk geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten met ischemische en niet-ischemische cardiomyopathie 5. Evenzo is de afwezigheid van myocardfibrose een sterke voorspeller van ventrikelfunctionele herstel en langetermijnoverleving 6. 
Het kenmerk van fibrose is de afzetting van overtollig collageen, dat de treksterkte van staal heeft 7 en de cardiomyocytefunctie op meerdere niveaus nadelig kan beïnvloeden. Mechanische krachten die voortkomen uit een overmatig collageenmatrix kunnen leiden tot cardiomyocyteatrofie 8,9, passieve weefselstijfheid 10, tonische contractie-geïnduceerde myocardiumstijfheid 11-13, en verminderde zuurstoftoevoer naar de resterende populatie cardiomyocyten. Gap junction koppeling van cardiomyocyten en myoFbs kan ook de elektrische eigenschappen van het hart beïnvloeden, waardoor een groter risico ontstaat voor de ontwikkeling van aritmieën 14-16. Perivasculaire fibrose verandert de vasomotorische reactiviteit van intramural coronaire arteriën en arteriolen 17 en draagt bij aan luminale vernauwing die de zuurstoftoevoer vermindert en dus de overleving van cardiomyocyten 17-22. Pathogene fibrotische en elektrische remodellering, afkomstig van een initiële site van ischemische schade of energieonbalans, vordert onvermijdelijk naar hartfalen. 
Cardiomyocytnecrose initieert het fibrotische antwoord, en daaropvolgende nadelige fibrotische remodellering kan optreden ongeacht de etiologie. Een manier vinden om cardiale fibrose te beheersen zou klinisch gunstig zijn voor de behandeling van ischemische en idiopathische cardiomyopathieën, hypertensieve hartziekte, hypertrofische cardiomyopathie, klephartziekte en dystrofopathieën 23-42. Ongeacht hoe het fibrotische ziekteproces begint, kunnen oplosbare, profbrotische factoren de interstitiële ruimte passeren en activering van interstitiële en adventitiële fibroblasten op locaties verwijderd van de initiële fibrotische litteken veroorzaken, waardoor een cascade-effect ontstaat dat uiteindelijk tot hartfalen leidt. Het optimale scenario zou zijn om het fibrillogene proces te benutten met behulp van een gerichte therapie die kan worden toegepast tijdens de compensatoire hypertrofische fase van cardiomyopathie voordat deze zich ontwikkelt tot systolisch pompfalen, diastolisch hartfalen of andere eindstadiums. Het uiteindelijke doel zou zijn om fibrose om te keren zodat dode cardiomyocyten kunnen worden vervangen en de hartfunctie volledig kan worden hersteld. 
De belangrijkheid van de matrix wordt algemeen begrepen, maar methoden om de matrix te bestuderen zijn voornamelijk beperkt tot kwantitatieve metingen van belangrijke structurele componenten, met name collageen, en relatieve niveaus van verschillende matrix- en matricellulaire eiwitten. Dit protocol benadrukt een zelden gebruikte techniek die nuttig is voor het beoordelen van kwalitatieve verschillen in de cardiale matrix. Deze techniek is onlangs gebruikt om fundamentele verschillen in hartmatrices van verschillende etiologieën van hartziekte (in menselijke explantaten) te vergelijken en te contrasteren, om harten van post-infarct varkens behandeld met de gliale groeifactor (GGF) isofom van neuregulin-1β te onderzoeken, in vergelijking met niet-behandelde dieren 43, en om verschillen in de matrices van cardiale weefsels van mdx muizen (een veel gebruikt dierenmodel van Duchenne Spierdystrofie) op verschillende leeftijden te onderzoeken en te vergelijken met wildtype controles. Deze techniek werd voor het eerst geïntroduceerd door Drs. Caulfield en Borg in 1979 44, maar weinig studies hebben deze krachtige techniek sindsdien toegepast 45-47, re-geïntroduceerd hier met slechts kleine aanpassingen. Deze methodologie is een waardevol onderzoeksinstrument, omdat het kwalitatieve informatie biedt over ultrastructuur van extracellulair matrix die anders over het hoofd zou kunnen worden gezien wanneer men simpelweg het matrixcomponentgehalte en/of niveau van fibrose meet.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Carbon Adhesive</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Carbon Adhesive Tabs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td>order to fit stubs</td></tr><tr><td>Double Edge Razor Blades Stainless Steel</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde, 50% Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16310</td><td>EM grade, distillation purified</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16760 of 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Monosodium Phosphate NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Silver Conductive Adhesive</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tannic Acid, 5% Aqueous&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trihydrate Sodium Cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Gold-palladium Alloy or Gold</td><td>Refining Systems, Inc.&nbsp;</td><td>varies</td><td>specific to the sputter coater make and model</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Plain Wooden Applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 Environmental SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Model 108</td><td></td></tr><tr><td>Alluminum SEM Sample Stubs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220-12</td><td>specific to the miscroscope</td></tr></tbody></table>

scanning electron microscopy van gemacereerde tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrose is een onderdeel van alle vormen van hartaandoeningen, ongeacht de etiologie, en hoewel er veel vooruitgang is geboekt op het gebied van cardiale matrixbiologie, zijn er nog steeds grote lacunes met betrekking tot hoe de matrix wordt gevormd, hoe fysiologisch en pathologisch hermodellering verschillen, en het belangrijkste hoe matrixdynamica kan worden gemanipuleerd om genezing te bevorderen en fibrose te remmen. Er is momenteel geen behandelingsoptie voor het beheersen, voorkomen of omkeren van cardiale fibrose. Een deel van de reden is waarschijnlijk de pure complexiteit van de vorming van cardiale littekens, zoals die optreedt na een hartinfarct om dode of stervende cardiomyocyten onmiddellijk te vervangen. De extracellulaire matrix zelf neemt deel aan hermodellering door residente cellen te activeren en ook door infiltrating cellen naar de niet-functionele laesie te leiden. De matrix is ook een soort opslagruimte voor matricellulare eiwitten die cruciaal zijn voor normale matrixomzet, evenals voor fibrotische signalering. De matrix heeft bovendien een elektromechanische rol gespeeld in cardiaal weefsel. De meeste technieken voor het beoordelen van fibrose zijn niet kwalitatief van aard, maar geven eerder kwantitatieve resultaten die nuttig zijn voor het vergelijken van twee groepen, maar die geen informatie geven over de onderliggende matrixstructuur. Hier wordt een techniek belicht voor het visualiseren van de ultrastructuur van de cardiale matrix. Rasterelektronenmicroscopie van decellulair hartweefsel onthult opvallende verschillen in structuur die anders gemist zouden kunnen worden met behulp van traditionele kwantitatieve onderzoeksmethoden.

De gemarkeerde techniek werd toegepast op hartweefsel van een ongebruikte menselijk hart transplantatie donor (figuur 1), geëxplanteerde weefsels transplantatie ontvangers, harten van wildtype en dystrofische muizen (figuur 3), en in post-myocardiaal infarct hart monsters van een varkens model van het hart schade (figuur 2). Zoals getoond in figuur 1, de menselijke cardiale matrix een ingewikkelde weefsel verknoopt eiwit...

Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Het algemene doel van deze methode is om de structuur van de cardiale matrix te visualiseren in afwezigheid van cellen of andere niet-matrixmaterialen. Deze methode kan kernvragen op het gebied van fibrose beantwoorden, in het bijzonder hoe verschillen in de samenstelling van de matrix de organisatie van de matrix kunnen beïnvloeden, en hoe deze veranderingen verschillende cardiomyopathieën of andere fibrotische aandoeningen kunnen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwalitatief beeld van de matrix biedt dat kan worden gebruikt om kwantitatieve metingen aan te vullen.Dr. Galindo en Dr. Sawyer kregen voor het eerst het idee om deze techniek te gebruiken nadat zij ontdekten dat regelmatige behandeling van varkens na een infarct leidde tot veranderingen in de genexpressie die vergelijkbaar waren met veranderingen in de matrixinhoud na behandeling. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen problemen ondervinden als zij geen eerdere ervaring hebben met SEM-monstervoorbereiding, vanwege de vereiste fijne motoriek. Het weefselmonster moet groot genoeg zijn om gemakkelijk zichtbaar te zijn en moet worden bewaard in een vier procent glutaraldehyde-oplossing bij vier graden Celsius.Haal het weefsel uit de koude opslag en spoel het af met gedestilleerd water. Dompel het weefsel vervolgens onder in een vers bereide oplossing van 10 procent natriumhydroxide, gemaakt van pellets in water. Neem daarbij de juiste voorzorgsmaatregelen.Bewaar het weefsel zes tot 10 dagen bij kamertemperatuur in de natriumhydroxidolossing. Ga verder wanneer de kleur van het weefsel gebroken wit of wit wordt. Spoel het weefsel vervolgens af met gedestilleerd water totdat het transparant wordt.Trek vervolgens handschoenen aan en dompel het weefsel vier uur lang bij kamertemperatuur onder in één procent tanninezuur. Spoel het weefsel na het tanninezuurbad een nacht lang in gedestilleerd water. Maak ter voorbereiding in een zuurkast, terwijl u handschoenen draagt, een 0,2 molaire voorraadoplossing van natriumcacodylaatbuffer en een twee procent waterige voorraadoplossing van osmiumtetroxide.Gebruik een spatbord, aangezien osmiumtetroxide een ernstig inhalatiegevaar vormt. Maak nu een 0,1 molaire verdunning van de natriumcacodylaatbuffer en incubeer het weefsel hierin gedurende vijf minuten onder zachte agitatie. Vervang de buffer twee keer om het weefsel in totaal drie keer te wassen met natriumcacodylaat.Maak vervolgens een één-op-één mengsel van de voorraadoplossing natriumcacodylaat en de voorraadoplossing osmiumtetroxide. Incubeer het weefsel in dit nieuwe mengsel op een rotator gedurende een uur. Plaats het weefsel daarna terug in 0,1 M natriumcacodylaat en incubeer het vijf minuten onder zachte agitatie.Vervang deze badoplossing twee keer gedurende 15 minuten. Dehydrateer het weefsel vervolgens met behulp van een reeks ethanolbaden met toenemende concentraties. Laat het weefsel 15 minuten in elk bad weken onder milde agitatie.Breng vervolgens het weefsel en de oplossing over naar een ondiepe Petrischaal gevuld met 100 procent ethanol. Houd daarna voorzichtig twee zeer scherpe scheermesjes vast zodanig dat de vlakke zijden elkaar raken en de snijkanten elkaar kruisen om twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het specimen te vormen. Gebruik nu uw dominante hand om het tweede mesje aan de uiterste linkerzijde van het monster te plaatsen en snijd naar rechts.Schuif de mesjes daarom vanuit tegenovergestelde richtingen tegen elkaar aan om in één vloeiende beweging te snijden, met minimale vervorming of scheurkracht. Het doel is om een zo groot mogelijk oppervlak bloot te leggen zonder het preparaat te beschadigen. Herhaal dit proces totdat er voldoende bevredigende dwarsdoorsneden zijn klaargemaakt voor onderzoek met SEM.Breng het weefsel met een spatel of pincet over naar de monsterhouder van de CPD, terwijl het weefsel ondergedompeld blijft in 100 percent ethanol. Het weefsel mag niet langer dan enkele seconden aan de lucht worden blootgesteld. Gebruik de CPD om de ethanol te vervangen door vloeibare koolstofdioxide en voer de droogcyclus uit zoals aangegeven door de fabrikant.Bereid vervolgens voor elk specimen een SEM-monsterhouder voor. Plak een koolstofkleefstrip op het bovenoppervlak van de aluminiumhouder. Bevestig het specimen onder een stereomicroscoop zorgvuldig aan de kleefstrip, waarbij het betreffende dwarsdoorsnedevlak naar boven is gericht, weg van de strip, en zo vlak mogelijk met het oppervlak van de houder ligt.Sondeer of raak het relevante oppervlak niet aan. Breek bij de kleinste en meest lastige specimens het houten applicatiestokje af om dit als spatel te gebruiken. Werk daarnaast op een groot stuk filterpapier om te voorkomen dat een gevallen specimen verloren gaat.Gebruik voor een betere hechting een afgebroken applicatiestaafje om een taps toelopende kwast te maken, en breng zilver- of koolstofverf aan op de basis en de zijkanten van het specimen. Trek een zeer dunne lijn verf door tot aan de rand van het betreffende oppervlak. Dit creëert een ontladingspad van het betreffende oppervlak naar de aarde.Breng vervolgens twee of drie kleine stipjes verf aan rond de omtrek van het koolstoftabblad om een geleidend pad te creëren van het oppervlak van het tabblad naar de metalen stub. Dit fungeert als de aarding. Zet het preparaat opzij en laat de geleidende verf twee uur drogen.Zodra het specimen droog is, gebruikt u een sputtercoater om een relatief dikke laag goud-palladiumlegering of goud aan te brengen. Een coatingdikte van 30 tot 40 nanometer is gewenst. Voer de scanning elektronenmicroscopie uit bij een relatief lage versnellingsspanning om problemen door gebrekkige ladingafvoer in het monster te minimaliseren.Gebruik de variabele drukmodus indien deze beschikbaar is. Verbeter eerst de werkafstand om voldoende scherptediepte te verkrijgen om op vezels in de Z-dimensie te focussen. Open hiervoor het navigatie-tabblad rechtsboven.Ga vervolgens naar het tabblad Coördinaten in het menu van de tafel. Voer daar een grotere waarde in voor de Z-coördinaat, bijvoorbeeld 20 millimeters. Druk ten slotte op het tabblad Ga Naar om de wijziging uit te voeren.Positioneer vervolgens het betreffende oppervlak loodrecht op de elektronenbundel. Klik en houd de rechtermuisknop ingedrukt en schuif deze naar links of rechts om het preparaat te focussen nabij de rand van het voorbereide vlak van belang. Noteer de gefocuste werkafstand.Beweeg vervolgens met de joystick van de handmatige gebruikersinterface het beeld naar de tegenovergestelde rand en herhaal de focusmethode. Als de werkafstand is gewijzigd, kantel het preparaat dan om een benaderende overeenkomst op beide locaties te bereiken. Gebruik het tabblad Coördinaten van het Stage-menu en voer een kantelwaarde in bij de T-coördinaat.Draai het preparaat nu 90 graden door deze waarde in het R-coördinaatveld in te voeren. Herhaal vervolgens het kantelen tot alle posities scherp zijn gesteld op ongeveer dezelfde werkafstand. De beschreven techniek is toegepast op hartweefsels van een ongebruikte menselijke harttransplantatiedonor.De menselijke hartmatrix is een ingewikkeld weefsel van cross-gelinkte eiwitten dat in doorsnede een honingraatachtig patroon vertoont. Elke honingraatstructuur is ongeveer 40 microns breed en omvat normaal gesproken een enkele myocyt. Wanneer ze via tussenstroomschijven verbonden zijn, kunnen meerdere cardiomyocyten worden gezien als een staaf die in de lengte door een tunnelachtige vorm loopt.Naast het verstrekken van structurele informatie kan een SEM van gedecellulariseerde weefsels een zinvolle kwalitatieve beoordeling mogelijk maken als reactie op letsel of niet-traumatische vormen van cardiomyopathie, zoals geïnfarceerde hartweefsels van een varken. In een afzonderlijke studie bleek de GGF2-isovorm van NRG-1 bèta een potentiële therapeutische behandeling te zijn voor hartfalen. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u weefsel, specifiek hartweefsel, moet prepareren voor de scanning elektronenmicroscoop, inclusief de techniek voor het blootleggen van het betreffende oppervlak en voor het monteren van het preparaat.Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals massaspectrometrie, RNA-sequencing en diverse andere assays, worden gebruikt om extracellulaire matrixeiwitten en andere eiwitten die verantwoordelijk zijn voor signalering en andere organisatorische observationele fenomenen te meten. Vergeet bovendien niet dat osmiumtetroxide een gevaarlijke chemische stof is, vanwege het risico op dampfixatie van de slijmvliezen. Denk er altijd aan om in een zuurkast met nitrilhandschoenen te werken, waarbij een spatwambord of het zuurkastscherm wordt gebruikt.

scanning-electron-microscopy-macerated-tissue-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Dit protocol beschrijft een procedure voor het verrijken van ECM-eiwitten uit weefsels of tumoren en het deglycosyleren en verteren van de ECM-verrijkte preparaten in peptiden om hun eiwitsamenstelling door middel van massaspectrometrie te analyseren.

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.

Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding

De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol bij het definiëren van de micro-omgeving van cellen en bij het moduleren van celgedrag en fenotype. We beschrijven een snelle methode voor de isolatie van cel-afgeleide extracellulaire matrix, die kan worden aangepast aan verschillende schalen voor microscopische, biochemische, proteomische of functionele studies.

Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Dit protocol presenteert een methode voor decellularisatie en daaropvolgende hydrogel vorming van muriene borst vetpads na ex vivo bestraling.

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

We beschrijven de voorbereiding van linten van seriële secties en hun verzameling op grote overdrachtsondersteuning voor gebruik als Array Tomography-monsters, samen met geautomatiseerde beeldvormingsprocedures in een scanning elektronenmicroscoop. Het protocol maakt screening, retrieval en gerichte beeldvorming van lokale, zeldzame gebeurtenissen en de verwerving van grote gegevensvolumes mogelijk.

Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

We stellen een protocol voor voor het beoordelen van botregeneratie op verschillende hiërarchische niveaus. Deze multimodale aanpak maakt structurele analyse mogelijk over verschillende lengteschalen, waardoor uitdagingen bij de monstervoorbereiding effectief worden aangepakt. Het biedt ook een betrouwbare workflow voor het evalueren van de effectiviteit van biomaterialen bij het bevorderen van botregeneratie.

Multimodale benadering om botregeneratie en steigerprestaties te beoordelen

Leer scanning electron microscopy van gemacereerde hartweefsel om de extracellulaire matrix te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers de structuur en organisatie van de matrix te bestuderen.

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Meer video's verkennen