Ontwikkeling en karakterisering van

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een microfluïdisch apparaat dat endotheelcellen in staat stelt om te groeien onder fysiologisch relevante schuifspanning en het meten van de door agonisten geïnduceerde veranderingen in hun calcium- en stikstofoxideproductie. Deze methode kan bijdragen aan de verdere ontwikkeling van microvatonderzoek door het in vitro microvatmodel te valideren en de kloof tussen in vivo en in vitro studies te overbruggen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het veelzijdige ontwerp van de microkanalen om diverse vasculatuur na te bootsen en de verbeterde celculturomgeving, die dichter bij de in vivo situatie ligt dan de statische omstandigheden van oorspronkelijke culturen.

Sulei en Xiang, beiden uit mijn laboratorium, zullen de procedures demonstreren. Gebruik voordat u begint standaard fotolithografie om een mastermold te maken en zachte lithografie om de PDMS-microkanaalapparaten te fabriceren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de microkanaalapparaten voor te bereiden, bedekt u eerst de in- en uitlaat met een dun stukje PDMS en plaatst u het apparaat in een Petrischaal met een nat tissue.

Wikkel daarna de schaal in Parafilm en steriliseer het apparaat gedurende ten minste drie uur onder UV-licht. De volgende stap is het aanbrengen van het fibronectine. Plaats eerst een druppel van 30 tot 50 µL PBS bij de inlaat.

Creëer een vacuüm bij de uitlaat om het apparaat te spoelen. Plaats vervolgens een druppel fibronectine van 100 µg/mL bij de inlaat. Creëer een vacuüm bij de uitlaat om de fibronectine-oplossing te laden.

Dek vervolgens de inlaat en uitlaat af. Wikkel de schaal opnieuw in met Parafilm en incubeer het apparaat gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Spoel het apparaat de volgende dag handmatig drie keer met PBS.

Vul het vervolgens met 30 tot 50 µL celkweekmedium en warm het apparaat minstens 15 minuten op in een incubator bij 37 °C. Begin met het mengen van HUVEC's in HUVEC-kweekmedium met acht procent Dextran bij een concentratie van twee tot vier miljoen cellen per milliliter. De Dextran is nodig om de viscositeit te verhogen en daarmee de celzaaiing te verbeteren.

Plaats vervolgens 10 tot 20 µL cellen boven de inlaat en voer deze in via zwaikracht of door capillaire werking met een glazen Pasteurpipet bij de uitlaat. Incubeer het device daarna gedurende 15 tot 20 minuten. Controleer vervolgens de status van de seeding onder een microscoop.

Voeg indien nodig meer cellen toe om de gewenste celdichtheid te bereiken. Zodra er voldoende cellen zijn geladen, spoel het apparaat voorzichtig om met normaal, warm celkweekmedium om de dextraan te verwijderen. Kweek het apparaat vervolgens gedurende zes uur zonder mediumperfusie.

Stel vervolgens de slangverbindingen in voor de langetermijnperfusie. Plak het apparaat op een Petrischaal en verbind daarna de inlaatslang met een spuit met een naald. Plaats slangen in zowel de inlaat als de uitlaat van het apparaat.

Sluit de uitlaatslang aan op een afvalopvangbak. Plaats vervolgens de schaal en de afvalcontainer in een incubator. Verbind de spuit met een lange inlaatslang met een externe perfusiepomp die door de deur van de incubator loopt.

Stel vervolgens de perfusiesnelheid in volgens het experimentele ontwerp. Met een goed gecontroleerde perfusie kan de cultuur in het microvaatnetwerk tot twee weken in stand worden gehouden. Hierdoor kan het worden uitgebreid naar langetermijnstudies die de cellulaire en hemodynamische omgeving in verschillende fysiologische en pathologische condities nabootsen.

Om te beginnen met de immunokleuring, zoals de labeling van VE-cadherine, fixeer de cellen eerst door te perfunderen met twee procent paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Houd na een reeks perfusies om te blokkeren, te permeabiliseren en te kleuren met antilichamen het apparaat op vier graden Celsius tot de cellen worden afgebeeld. Om de calciumconcentratie in de cellen af te beelden, perfundeer het apparaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met 10 milligram per milliliter albumine in Ringer-oplossing.

Perfuseer het apparaat vervolgens gedurende 40 minuten met vijf micromolair Fluo-4 AM bij 37 °C. Spoel daarna het aan het lumen gebonden Fluo-4 AM gedurende 15 minuten uit met albumin Ringers bij 37 °C. Start vervolgens het confocale systeem op voor beeldvorming van de intercellulaire calciumgehaltes met Fluo-4 AM. Neem beelden op van de met Fluo-4 geladen microvaten.

Verzamel gedurende 10 minuten de baseline-beelden. Perfuseer het apparaat vervolgens continu met 10 micromolar ATP en registreer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit gedurende 20 minuten. Om de productie van stikstofmonoxide in de cellen in beeld te brengen, wordt het apparaat 15 minuten lang geperfuseerd met albumine-Ringer bij 37 degrees Celsius.

Perfuseer vervolgens de cellen met 5 µM DAF-2 DA gedurende ongeveer 35 tot 40 minuten bij 37 °C. Stel daarna het fluorescentie-beeldvormingssysteem in om de ATP-geïnduceerde productie van stikstofmonoxide te meten. Registreer de baseline gedurende 5 minuten, perfuseer het apparaat vervolgens met 10 µM ATP en verzamel de beelden gedurende 30 minuten met intervallen van één minuut.

Voor de meting van stikstofmonoxide in cellen is het belangrijk om te begrijpen dat de detach-adapter voor het intensiteitsprofiel een cumulatieve productie van stikstofmonoxide over de tijd vertegenwoordigt en geen stikstofmonoxideconcentratie. Selecteer handmatig de regio's van interesse (ROI's) uit de verzamelde beelden op het niveau van individuele cellen. Elke ROI beslaat het gebied van één individuele cel, wat kan worden aangegeven door de fluorescentieomtrek.

Kwantificeer de door ATP geïnduceerde veranderingen in endotheliaal calcium en stikstofmonoxide. Dit gebeurt door de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van Fluo-4 te berekenen, na aftrek van de weefselachtergrond. Kwantificeer de productiesnelheid van stikstofmonoxide door de eerste differentiële omzetting van de fluorescentie-intensiteit van DAF-2 over de tijd uit te voeren.

Het microkanaalpatroon in het device heeft een vertakkingsnetwerk van drie niveaus. Er is een 3D-numerieke simulatie uitgevoerd om de schuifspanningsverdelingen te schatten bij een stroomsnelheid van 0,35 microliters per minuut. Endotheelcellen werden in het netwerk gezaaid zoals beschreven.

Vervolgens werden F-actine en kernen gelabeld. Op dezelfde manier werd ook VE-cadherine gekleurd. De resultaten waren vergelijkbaar met de VE-cadherine-expressie in een intacte venule.

Vervolgens werden de door ATP geïnduceerde stijgingen in intracellulair calcium en de productie van stikstofmonoxide onderzocht. Calciumgehaltes werden onderzocht met Fluo-4 AM, zoals beschreven in het protocolgedeelte. De productie van stikstofmonoxide werd gemonitord met DAF-2 DA, zoals beschreven in het protocolgedeelte.

De resultaten waren vergelijkbaar met die verkregen uit individueel geperfundeerde intacte venulen. De opstelling was eenvoudig en strak regelbaar onder biologische condities en in dynamische vloeistofomgevingen, wat met conventionele microskill-technieken niet mogelijk zou zijn geweest. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het apparaat fabriceert en hoe u calcium- en stikstofoxidemetingen uitvoert.

Nadat deze techniek de weg had vrijgemaakt voor onderzoekers, was het niet alleen mogelijk om onderliggende agonist-geïnduceerde processen te onderzoeken, maar werden er ook bredere toepassingen geopend voor biomedisch onderzoek.