Ontwikkeling en karakterisering van In Vitro Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca 2+] i En productie van stikstofoxide
May 19th, 2016
Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.
Het algemene doel van deze procedure is om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen dat endotheelcellen toestaat om te groeien onder fysiologisch relevante schuringsstroming en om de agonist geïnduceerde veranderingen in hun calcium- en stikstofmonoxideproductie te meten. Deze boodschap kan het toekomstige onderzoek naar microvaten bevorderen, door het valideren van het in vitro microvatenmodel en het overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro studies. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de veelzijdige ontwerp van de microkanalen om verschillende vaatstructuren na te bootsen en ze verbeteren de celkweekomgeving die dichter bij in vivo staat dan de conditionele statische van de originele culturen.
De procedures zullen worden gedemonstreerd door Sulei en Xiang, de twee van mijn laboratorium. Voordat u begint, gebruikt u standaard fotolitografie om een mastermal te maken en zachte litografie om de PDMS microkanaalapparaten te fabriceren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de microkanaalapparaten voor te bereiden, bedekt u eerst de inlaat en uitlaat met een dunne laag PDMS en plaatst u het apparaat in een petrischaal met een vochtig weefsel.
Vervolgens wikkelt u de schaal in met Parafilm en steriliseert u het apparaat gedurende minimaal drie uur onder een UV-licht. De volgende stap is het aanbrengen van fibronectine. Plaats eerst een druppel van 30 tot 50 microliter PBS bij de inlaat.
Creëer een vacuüm bij de uitlaat om het apparaat te spoelen. Plaats vervolgens een druppel van 100 microgram per milliliter fibronectine bij de inlaat. Creëer een vacuüm bij de uitlaat om de fibronectine-oplossing te laden.
Bedek vervolgens de inlaat en uitlaat. Wikkel de schaal opnieuw in met Parafilm en incubeer het apparaat een nacht lang bij vier graden Celsius. De volgende dag spoelt u het apparaat handmatig drie keer met PBS.
Laad vervolgens het apparaat met 30 tot 50 microliter celkweekmedium en warm het apparaat op in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende minimaal 15 minuten. Begin door HUVECs te mengen met HUVEC kweekmedium met acht procent Dextran bij twee tot vier miljoen cellen per milliliter. Dextran is nodig om de viscositeit te verhogen en zo het zaaien van cellen te verbeteren.
Plaats vervolgens 10 tot 20 microliter cellen over de inlaat en breng ze aan met behulp van zwaartekracht of door capillaire actie vanuit een glazen Pasteurpipet bij de uitlaat. Incubeer vervolgens het apparaat gedurende 15 tot 20 minuten. Controleer vervolgens de zaaitondersteuning onder een microscoop.
Laad indien nodig meer cellen om een gewenste celdichtheid te bereiken. Zodra voldoende cellen zijn geladen, spoelt u het apparaat voorzichtig met normaal, warm celkweekmedium om het Dextran te verwijderen. Kweek vervolgens het apparaat zonder enige mediaperfusie gedurende zes uur.
Stel vervolgens de slangverbindingen in voor de langdurige perfusie. Plak het apparaat op een petrischaal en verbind vervolgens de inlaatslang met een spuit met een naald. Breng slangen in zowel de inlaat als de uitlaat van het apparaat.
Verbind de uitlaatslang met een afvalcollector. Plaats nu de schaal en het afvalcontainer in een incubator. Verbind de spuit met een lange inlaatslang naar een externe perfusiepomp die door de deur van de incubator loopt.
Stel vervolgens de perfusiesnelheid in volgens het experimentele ontwerp. Met een goed gecontroleerde perfusie kan de cultuur in het microvatennetwerk tot twee weken worden gehandhaafd. Daarom kan het worden uitgebreid tot langetermijnstudies die de cellulaire en hemodynamische omgeving onder de verschillende fysiologische en pathologische condities nabootsen.
Om te beginnen met immunokleuring, zoals VE-cadherin markering, fixeert u eerst de cellen door 30 minuten lang te perfunderen met twee procent paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Na een reeks perfusies om te blokkeren, te permeabiliseren en te kleuren met antilichamen, bewaart u het apparaat bij vier graden Celsius totdat de cellen worden afgebeeld. Om de calciumconcentratie in de cellen af te beelden, perfundeert u het apparaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met 10 milligram per milliliter albumine in Ringer-oplossing.
Perfundeer vervolgens het apparaat gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius met vijf micromolair Fluo-4 AM. Was vervolgens het lumengebonden Fluo-4 AM weg met albumine Ringers gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Start vervolgens het confocale systeem voor intercellulaire calciumniveaubeeldvorming met Fluo-4 AM.Verzamel beelden van de Fluo-4 geladen microvaten.
Verzamel de basislijnbeelden gedurende 10 minuten. Perfundeer vervolgens het apparaat continu met 10 micromolair ATP en neem de veranderingen in fluorescentie-intensiteit gedurende 20 minuten op. Om de stikstofmonoxideproductie in de cellen af te beelden, perfundeert u het apparaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met albumine Ringers.
Perfundeer vervolgens de cellen gedurende ongeveer 35 tot 40 minuten bij 37 graden Celsius met 5 micromolair DAF-2 DA. Stel vervolgens het fluorescentiebeeldvormingssysteem in om ATP-geïnduceerde stikstofmonoxideproductie te meten. Neem de basislijn gedurende 5 minuten op, perfundeer vervolgens het apparaat met 10 micromolair ATP en verzamel de beelden gedurende 30 minuten met tussenpozen van één minuut.
Voor de meting van stikstofmonoxide in cellen is het belangrijk om te begrijpen dat de loskoppeladapter voor het intensiteitsprofiel een cumulatieve stikstofmonoxideproductie met tijd vertegenwoordigt en niet een stikstofmonoxideconcentratie. Selecteer handmatig de interessegebieden van de verzamelde beelden op individueel celniveau. Elk ROI bedekt het gebied van een individuele cel dat kan worden aangegeven door de fluorescentieomtrek.
Kwantificeer de ATP-geïnduceerde veranderingen in endotheelcalcium en stikstofmonoxide. Door de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van Fluo-4 te berekenen, minder het weefsel achtergrond. Kwantificeer de stikstofmonoxideproductiesnelheid door de eerste differentiële conversie van de fluorescentie-intensiteit van DAF-2 in de tijd uit te vo
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat dat de groei van endotheelcellen onder fysiologisch relevante omstandigheden ondersteunt. Het meet veranderingen in calcium- en stikstofmonoxideproductie als reactie op ATP op enkelcellige niveau.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Endotheelcelbiologie
- Calciumsignalering
Achtergrond
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol in de vasculaire biologie.
- Microfluïdische apparaten kunnen in vivo-omgevingen nabootsen voor celkweek.
- Calcium en stikstofmonoxide zijn belangrijke signaalmoleculen in de endotheelfunctie.
- Traditionele statische culturen vertegenwoordigen de fysiologische omstandigheden niet nauwkeurig.
Doel van het onderzoek
- Om een in vitro microvatmodel te valideren.
- Om gaten tussen in vivo en in vitro studies te overbruggen.
- Om real-time cellulaire reacties op ATP te meten.
Gebruikte methoden
- Fotolitografie om een mastermal te maken.
- Zachte litografie voor het fabriceren van PDMS microkanaalapparaten.
- Celkweek van primaire humane navelstrenvene-endotheelcellen (HUVEC's).
- Real-time kwantificering van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle groei van HUVEC's in een microfluïdisch netwerk.
- Visualisatie van endotheelcelverbindingen en F-actine-verdelingen.
- Real-time meting van ATP-geïnduceerde veranderingen in calciumconcentratie.
- Kwantificering van stikstofmonoxideproductie als reactie op ATP.
Conclusies
- Het microfluïdische apparaat bootst effectief fysiologische omstandigheden na.
- Deze aanpak verbetert het begrip van endotheelcelsignalering.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor toekomstig onderzoek naar microvaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Physiologically relevant in vitro microvessel models are critical for bridging the translational gap between static cell culture and in vivo vascular biology. Quantitative measurement of endothelial calcium and nitric oxide responses under controlled flow conditions enhances predictive confidence in early vascular target validation. This platform supports robust mechanistic de-risking and informs portfolio decisions for vascular-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of endothelial signaling pathways under physiologically relevant flow.
- Supports functional validation of vascular targets through real-time calcium and nitric oxide readouts.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling dynamic vascular environments.
- Improves predictive confidence for vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Provides a validated microfluidic platform for quantitative, reproducible endothelial assays.
- Enables high-resolution, single-cell measurement of agonist-induced responses.
- Supports assay standardization and scalability for compound screening.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro endothelial responses with in vivo vascular phenotypes.
- Enables investigation of patient-derived blood components on human endothelial cells.
- Supports translational biomarker discovery for vascular function.
- Provides continuity from discovery through preclinical vascular validation.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic microvessel model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, assay development, and translational research for vascular biology programs.
- Discovery Biology: Quantitative calcium and nitric oxide measurements clarify endothelial signaling mechanisms.
- Screening: Platform readiness and reproducibility enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Real-time fluorescence imaging provides robust quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: Patient sample testing supports disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Versatile device design allows adaptation across vascular research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes endothelial assays with scalable, reproducible microfluidic platforms.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for vascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and endothelial cell culture.
- Needs access to confocal or fluorescence microscopy for quantitative imaging.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to primary human endothelial cells and patient-derived samples.
- Limited to in vitro modeling; physiological complexity may require further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Preparing the Microchannel Device for Cell Seeding
2:37
Endothelial Cell Seeding and Long-term Perfusion
4:38
Immunofluorescent Staining and Imaging Calcium Concentration or Nitric Oxide Production
6:39
Data Analysis
7:35
Results: Endothelial Cell Culture Under Shear Stress
8:39
Conclusion
