Name: Ontwikkeling en karakterisering van In Vitro Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale Ca 2+ i En productie van stikstofoxide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer een microfluïdische methode voor endotheelbiologie met HUVEC-cellen onder fysiologische stroming. Dit model valideert in vitro microvaten en meet real-time calcium- en stikstofoxide-reacties op ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL56237, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 en EPS-1003907).

1. microfluïdische apparaat Fabrication <ol><li> Standard Fotolithografie Fabrication van een SU-8 50 Master Mold <ol><li> Reinig de siliciumwafel voor spin-coating. Gespoeld kale 2 inch silicium wafer met aceton gedurende 15 minuten gevolgd door isopropylalcohol (IPA) gedurende 15 min. Dehydrateer de wafer door het op een verwarmingsplaat bij 150 ° C gedurende 1 uur. Na dehydratatie Koel de wafer bij kamertemperatuur. </li><li> Spin-coat het silicium wafer met SU-8. Voeg 2 ml SU-8 op de wafer. Ramp de wafel 500 rpm en 100 rpm / sec versnelling gedurende 10 seconden, gevolgd door 1000 rpm bij 300 rpm / sec versnelling gedurende 30 sec. (Zie Aanvullende Video 1) </li><li> Pre-bak de wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10 min, vervolgens zacht bakken bij 95 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Met UV blootstelling aan de ontworpen patroon te vormen van een film masker op het roterend bedekken fotoresist. Druk de patroon op een dunne transparante film als een film masker. Plaats de film masker boven despin-beklede fotoresist en blootstellen aan UV met een dosis van 300 mJ / cm2. (Zie Aanvullende Video 2) Let op: In dit protocol, het microkanaal netwerk patroon (159 micrometer breed moeder kanalen vertakking in vier 100 micrometer breed dochter kanalen) is ontworpen met CAD-software. Het patroon op de film toont als ruim baan en de rest van de film wordt bedekt met zwarte inkt. Omdat SU-8 is een negatieve fotoresist, wordt het gedeelte van de fotoresist die is blootgesteld aan UV verknoopt en onoplosbaar oplosmiddel worden tijdens de ontwikkeling van schimmels (stap 1.1.6). Na de ontwikkeling wordt het onoplosbare gedeelte het ontworpen netwerkpatroon repliceren en dienen als meester mal. </li><li> Post-bak de belichte wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 1 min, vervolgens 95 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Ontwikkel de meester mal. Gebruik SU-8 developer als oplosmiddel om de niet-verknoopt fotoresist te verwijderen. Dompel de wafer in SU-8 developer gedurende 3 minuten en spoel af met IPAgedurende 1 min. </li><li> Herhaal deze ontwikkelen cyclus 2-3 keer totdat er geen witte streep vorming (residu van niet uitgeharde fotolak) na de IPA spoelen. Voorzichtig drogen van de wafel met stikstofgas en onderzoekt de kleine elementen van het patroon onder een microscoop. Herhaal dit extra ontwikkelen cycli indien nodig. </li><li> Hard bak de wafer op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol></li><li> Soft Lithography <ol><li> de twee delen (basis en verharder) van polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer handmatig te mengen in een gew. verhouding van 10: 1. </li><li> De gas de PDMS mengsel met een exsiccator verbonden met een vacuümbron voor 15 min. Werpt het PDMS oplossing op de fotolak meester mal. De dikte van de PDMS moet zijn dan 3 mm een ​​stabiele aanhouden van de inlaat / uitlaat slang verschaffen. De-gas de PDMS opnieuw voor 15 minuten, en verwijder de resterende luchtbellen met stikstofgas indien nodig. Hard de gegoten PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 3 uur. </li><li> Reinig het oppervlak vanhet glas dekglaasje met een plakband en een plasma-cleaner (30 sec plasma behandeling). Spin-coat-un uitgeharde PDMS (0,5 ml) op de glazen dekglaasje door verhoging tot 4000 rpm en 500 rpm / sec acceleratie voor 30 sec. Hard de PDMS roterend bedekken dekglaasje in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 30 min. </li><li> Knip en laat de uitgeharde PDMS van de master mal. Vervolgens maakt een inlaat en een uitlaat met een 1 mm diameter perforator bij het distale einde van de moeder kanalen. </li><li> Binden het apparaat naar de PDMS roterend bedekken dekglaasje. Oxideren van de oppervlakken van de PDMS en dekglaasje met een plasma reiniger voor 1 min. Na de zuurstof plasmabehandeling, plaats een druppel gedeïoniseerd water (DI water) aan het verbindingsoppervlak en plaats de twee delen samen. Bak de inrichting in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten om een ​​permanente verbinding te verkrijgen. </li></ol></li></ol><img alt="Aanvullende Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Aanvullende Video 1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a> <img alt="Aanvullende Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Aanvullende Video 2 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a> 2. endotheelcellen zaaien en Cultuur <ol><li> Sterilisatie-inrichting en fibronectine Coating <ol><li> Het behoud van de hydrofobe eigenschap van het PDMS oppervlak rond de inlaat / uitlaat van oxidatie. Bedek het PDMS oppervlak rond de inlaat en uitlaat met strookjes plakband om oxidatie te voorkomen. Deze procedure kan voorkomen DI water verspreiden over het bovenoppervlak van de inrichting tijdens het vullen stap (2.1.3). </li><li> Behandel de PDMS apparaat met zuurstof plasma for 5 min veranderen het oppervlak hydrofiel, waardoor vloeistofstroom door de microkanaal vergemakkelijken en te voorkomen dat de belletjesopsluitfilterdeel de vulprocedure (2.1.3). </li><li> Gebruik ofwel een spuit met een naald bevestigd of een pipet om het apparaat met DI-water te vullen van de inlaat. Blijven de vulling tot er een druppel DI water (30-50 ui) geaccumuleerd bij de uitlaat. Onderzoek van het apparaat onder een microscoop om te controleren of er luchtbellen gevangen in de microkanaal. Verwijder de buitensporige waterdruppeltje bij de inlaat en uitlaat met een tissue. </li><li> Steriliseer het apparaat in een petrischaal met UV gedurende minimaal 3 uur in een laminaire bioveiligheid kap. Om verdamping te voorkomen, hebben betrekking op de ingang / uitgang met een dun stukje PDMS, zet een natte papieren tissue binnen het gerecht, en wikkel het gerecht met Parafilm. </li><li> Coat het apparaat met fibronectine. Spoel het apparaat eerst met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), smeer met 100 ug / ml fibronectine overnacht in de koelkast (4 ° C). Plaats een druppel oplossing bij de inlaat, en vervolgens een negatieve druk bij de uitlaat met een huisvacuüm, een injectiespuit met een naald of een pipet. </li><li> Vul het apparaat met celkweek media. Spoel het apparaat met PBS handmatig 3 keer voordat de celkweek media. Warm-up van het apparaat in een incubator bij 37 ° C. </li></ol></li><li> EC Zaaien en lange termijn Perfusion Opmerking: In vergelijking met gebruikelijke statische 2D EG cultuur, de in vitro microvaatje netwerkmodel continue perfusie uit de celkweek omgeving dichter bij de in vivo omstandigheden. De in vitro microvaatje netwerk aangetoond in dit protocol kan maximaal twee weken gehandhaafd. De goed-gecontroleerde perfusie zal continu aan te vullen voedingsstoffen, te verwijderen afval, en te voorkomen dat over-samenvloeiing van de EC monolaag. Derhalve kan worden uitgebreid tot een langere termijn studies, nabootsen van de cellulaire en hemodynamische omgeving onder verschillende Physiological en pathologische omstandigheden. <ol><li> Meng primaire HUVECs in HUVEC cultuur media (MCDB 131) met 8% dextran (molecuulgewicht 70.000). Het dextran wordt gebruikt om de viscositeit van het afdrukmateriaal verhogen en bereiken een betere cel seeding resultaat. De aanbevolen celdichtheid ongeveer 2-4 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Zaad van de cellen in het apparaat. Plaats een 10-20 ul druppel van cellen via inlaat. Introduceer een zachte stroom door ofwel het kantelen van het apparaat, of de capillaire werking met een glazen Pasteur pipet bij de uitlaat. De sleutel voor een succesvolle cel laden moet de stroomsnelheid regelen minder dan 1 mm / sec in de kleinste kanalen. </li><li> Controleer de cel zaaien. Na de eerste enting, incubeer de inrichting voor 15-20 min (bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C) voor het controleren van de status van enten onder de microscoop. Voer eventueel aanvullende celbelading een gewenste celdichtheid bereikt. </li><li> Voorzichtig Spoel het apparaat met celkweekmedium (37° C) om het dextran te verwijderen. Cultuur de inrichting in afwezigheid van bereikte na 6 uur in een incubator (5% CO2 bij 37 ° C). </li><li> Stel de slangaansluiting voor langdurige perfusie. Tape het apparaat in een petrischaaltje om verplaatsing te voorkomen. Maak kleine gaatjes in het deksel van de petrischaal voor inlaat en uitlaat slang inserties. Sluit de inlaat slang aan op een injectiespuit met een naald voor de celkweek media perfusie. Sluit de uitlaat slang aan een inzamelaar van afvalstoffen. Opmerking: Plaats het apparaat en de afvalinzamelaar in een celkweek incubator, terwijl het plaatsen van een perfusie pomp buiten de couveuse en sluit deze met het apparaat door de lange inlaat slang. De perfusie wordt bepaald door het experimentele ontwerp. In de onderhavige inrichting gebruikt een perfusiesnelheid van 0,35 pl / min en een afschuifspanning bereik tussen 1-2 dyne / cm2. Op grond van deze perfusie toestand, de HUVEC&#39;s te bereiken samenvloeiing in ongeveer 3-4 dagen. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent kleuring <ol><li> Bevestig de EC in de inrichting door perfusie van 2% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij 4 ° C, gevolgd door spoelen 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min, en 1% BSA blokkering gedurende 30 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek. </li><li> Permeabilize vaste ECS antilichaam kleuring met 0,1% Triton X-100. Perfuseren het apparaat met Triton voor 5-7 min tot label VE-cadherine, en 3 min naar label F-actine. </li><li> Laad de antilichamen in het apparaat. Perfuseren het apparaat met 1x PBS gedurende 15 minuten te spoelen de vorige oplossingen. Handmatig te laden het primaire antilichaam tegen VE-cadherine (anti-geit) in het apparaat bij een concentratie van 2 ug / ml (totaal volume 20-50 ui). Houd het apparaat in een koelkast bij 4 ° C overnacht. Perfuseren het secundaire antilichaam (ezel anti-geit) van een injectiepomp bij een concentratie van 7 ug / ml gedurende 45-60 min. </li><li> Label EC F-actine met phalloidin. Perfuseren het apparaat met 1x PBS for 15 min voor handmatig laden phalloidin (10 ug / ml) gedurende 7-10 min. </li><li> Label EC kernen (zie Materials List). </li><li> Spoel het apparaat met 1x PBS en handhaven bij 4 ° C tot beeldvorming. </li></ol> 4. Fluorescentie Imaging van endotheliale [Ca 2+] i <ol><li> Perfuseren het apparaat met albumine (10 mg / ml) -Ringer&#39;s oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Gebruik dezelfde perfusie tarief als die wordt gebruikt voor celkweek. De concentraties van alle componenten van albumine-oplossing Ringer&#39;s zijn beschreven in de Materialen List. </li><li> Opgezet confocale systeem voor het EG [Ca 2+] i beeldvorming met fluo-04:00. Gebruik van een confocale microscopische voor Ca2 + imaging. Gebruik een argon laser (488 nm) voor excitatie en stel de uitstoot band als 510-530 nm. Verzamel de beelden met een 25X objectief (onderdompeling in water, NA: 0,95) bij 512 x 512 scan-formaat. Gebruik een z-stap van 2 urn en een scanning interval voor elke stapel images van 20 sec. </li><li> Perfuseren het apparaat met fluo-04:00 (5 uM) gedurende 40 min bij 37 ° C, dan was het lumen fluo-04:00 met een oplossing van albumine-Ringer&#39;s. </li><li> Acquire beelden van fluo-4 geladen microvaten. Verzamel de basislijn afbeeldingen voor 10 min. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en de veranderingen in fluorescentie-intensiteit (FI) opnemen 20 min. </li></ol> 5. Fluorescentie beeldvorming van productie van stikstofoxide <ol><li> Perfuseren het apparaat albumine-oplossing van Ringer gedurende 15 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek. </li><li> Stel de fluorescentie afbeeldingssysteem maat ATP-geïnduceerde productie van stikstofoxide. Gebruik een microscoop uitgerust met een 12-bit digitale CCD camera en een computergestuurde sluiter voor stikstofmonoxide meting. Gebruik een 75 W xenon lamp als lichtbron. Let op: Selecteer de excitatie en emissie golflengte voor DAF-2 DA door een interferentie filter (480/40 nm) en een dichroïsche spiegel(505 nm) met een band-pas barrière (535/50 nm). Gebruik een 20X objectief (NA: 0,75) om de beelden te verzamelen. Fotobleken te minimaliseren, plaatst een grijsfilter (0,5 N) voor het interferentiefilter en beperken de blootstellingstijd aan 0,12 sec. </li><li> Laad de cellen met DAF-2 DA (5 pm). Perfuseren het apparaat met DAF-2 DA gedurende ongeveer 35-40 minuten bij 37 ° C. Noteer de basislijn van DAF-2 fluorescentie-intensiteit (FI DAF) na de eerste belasting. Opmerking: DAF-2 DA continu aanwezig is in het perfusaat gedurende het experiment 7. </li><li> Verzamel DAF-2 beelden. Noteer de basislijn FI DAF 5 minuten. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en verzamel de afbeeldingen voor 30 min met 1 minuut intervallen. Verzamel alle van de beelden van dezelfde groep cellen op hetzelfde focal plane. </li></ol> 6. Data Analysis <ol><li> Selecteer handmatig de regio van belang (ROI) van de verzamelde beelden op individueel celniveau. ElkROI bestrijkt het gebied van een individuele cel die de fluorescentie lijnen worden aangegeven. </li><li> Aftrekken achtergrond fluorescentie en berekent het gemiddelde FI van elk ROI. </li><li> Meet ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i en NO productie. Kwantificeren ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i door het berekenen van de veranderingen in Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, waarbij FI 0 is de gemiddelde basislijn FI tijdens albumine-Ringer perfusie voor het toevoegen van ATP) minus de gemeten achtergrond. Kwantificeren NO productie snelheid door het uitvoeren van de eerste differentiële conversie van de FI DAF in de tijd. Opmerking: Het tijdsverloop van FI DAF is een cumulatieve productie van NO in de tijd. Daarom wordt de NO-productie berekend op basis van het profiel van FI DAF zowel onder basale en ATP gestimuleerde omstandigheden. Details van data-analyse en experimentele procedures zijn beschreven in een eerdere publicatie 7. </li></ol>

<ol><li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+modulation+at+the+cell%2C+microvessel%2C+or+whole+organ+level%3A+towards+closing+gaps+in+our+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li>
<li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li>
<li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li>
<li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response%2C+nitric+oxide+and+%5BCa2%2B%5DI%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797(2015).</li>
<li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4%2C5-diaminofluorescein+diacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li>
<li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li>
<li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+%5BCa2%2B%5Di+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li>
<li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-activating+factor+increases+endothelial+%5BCa2%2B%5D+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+%5BCa2%2B%5Di+and+venular+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li>
<li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li>
<li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li>
<li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated%2C+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly%28dimethylsiloxane%29-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li>
<li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li>
<li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li>
<li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioadaptation%3A+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li>
<li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li>
<li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+%3A+alters+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li>
<li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li>
<li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators%3A+diaminofluoresceins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28iBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).</li>
<li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li>
<li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li>
<li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of conflicterende belangen te onthullen.

<html> In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk, de karakterisering van EG kruispunten en F-actine cytoskelet distributie en de kwantitatieve metingen van EG [Ca2 +] i en NO-productie met behulp van een microfluïdische apparaat. Geperfundeerde microfluïdische apparaat verschaft een in vitro model dat een getrouwe simulatie van de in vivo microvasculaire geometrieën afschuiving stroomomstandigheden toelaat. Sinds...

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC&#39;s worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype 1,2. De microfluidics technologie maakt een nauwkeurig gecontroleerde vloeistof door een geometrisch beperkt microschaal (sub-millimeter) kanalen 3, dat de mogelijkheid voor gekweekte cellen voorziet, met name voor vasculaire EC, om te groeien onder de gewenste stroom omstandigheden. Deze eigenschappen maken de celkweekomstandigheden dichter bij in vivo dan de conventionele, statische 2D celkweken. Ze zijn zeer belangrijk bij de microfluïdische apparaten worden gebruikt om verschillende soorten vasculatures modelleren en EG reacties op mechanische en / of chemische prikkels bestuderen. Ondanks de voordelen aangetoond door de microkanaal-netwerk via een statisch celkweek, de aanpassing en de toepassing van microfluidics in de biomedische field blijven beperkt. Gemeld door een recent overzicht, het merendeel van de publicaties van dit gebied (85%) zijn nog in engineering journals 4. De prestaties van microfluïdische apparaten is niet overtuigend genoeg voor de meeste biologen over te stappen van de huidige technieken, zoals de Transwell test en de macro-schaal cultuur schotel / glasplaatje om dit geminiaturiseerde apparaat. Microfluidics is een multidisciplinair veld, dat interdisciplinaire samenwerking vereist dat dit gebied vooruitgang te boeken. Het doel van dit technische artikel is om de lacunes in de kennis te verminderen tussen disciplines en maken de fabricage procedures begrijpelijk door biologen, terwijl het verstrekken van biologische toepassingen en functionele validatie van de microfluïdische microvaatjes. De gevisualiseerde experimentele protocollen omvatten fabricage van zowel microfluïdische apparaten en hun biologische nutsbedrijven, die een nauwe samenwerking tussen ingenieurs en biologen vertegenwoordigt. We hebben onlangs melding gemaakt van enkelebiologische toepassingen die de in vitro microvaatje netwerk microfluïdische apparaat 5. Om op passende ontwerp van de afmetingen van het microkanaal netwerk en breng de gewenste schuifspanning werd een numeriek model gebouwd met numerieke stromingsleer software om het stromingsprofiel nauwkeurig schatten. Primaire humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) die werden gezaaid in de microkanalen confluentie bereikten, dat wil zeggen onder de volledige binnenoppervlakken van het microkanaal, 3-4 dagen continue perfusie. De barrièrevorming juiste bleek uit VE-cadherine kleuring en vergeleken met die gevormd in statische celkweekomstandigheden en in intacte microvaatjes. Door toepassing van de experimentele protocollen ontwikkeld individueel intacte geperfundeerde microvaatjes 6-8, we kwantitatief gemeten veranderingen in EG [Ca2 +] i en stikstofoxide (NO) in reactie op adenosine trifosfaat (ATP) met fluorescerende indicators en confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De door agonist geïnduceerde toenamen in EG [Ca2 +] i en NO productie gemeld noodzakelijk intracellulaire signalen voor inflammatoire mediator-geïnduceerde toenames in permeabiliteit microvaatjes 6-15. Hoewel sommige eerdere studies beelden van DAF-2 DA beladen microfluïdische apparaten 16,17 toonde, had juiste resolutie en data-analyse nog niet bereikt 18. Voor zover wij weten, deze studie toont de eerste kwantitatieve metingen van door agonist veroorzaakte dynamische verandering in endotheelcellen [Ca2 +] i en NO opstelling met microfluïdische systeem. Microproductietechnieken de flexibiliteit om microkanalen fabriceren tot een paar micrometer en maken de ontwikkeling mogelijk van complexe patronen op de geometrie van in vivo microvasculatuur nabootsen. Hier presenteerden we een typische microkanaal netwerk met drie niveaus van vertakking. Dezenetwerk wordt vervaardigd door de combinatie van fotolithografie die wordt uitgevoerd in een cleanroom microfabrication en zachte lithografie.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot;7H2O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>Name of Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>Name of Software</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; in vitro</em&gt; microvaatje netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; en productie van stikstofoxide

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC&#39;s worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype. Hoewel de ontwikkeling van microfluïdische apparaten is omarmd door ingenieurs meer dan twee decennia, hun biologische toepassingen blijven beperkt. Een fysiologisch relevant in vitro model microvaatje bevestigd met biologische toepassingen is het belangrijk om het veld bevorderen en overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro onderzoeken. Hier presenteren we gedetailleerde procedures voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk via een microfluïdische inrichting met een lange-termijn perfusie vermogen. We tonen ook aan haar verzoeken om kwantitatieve metingen van-agonist geïnduceerde veranderingen in EG [Ca 2+] i en stikstofmonoxide (NO) productie in real-time met behulp van confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De gevormde microvaatje nettowerken met continue perfusie toonde goed ontwikkelde verbindingen tussen EC. VE-cadherine distributie was dichter bij die waargenomen in intacte microvaatjes dan statisch gekweekte EC monolagen. ATP-geïnduceerde tijdelijke toename van EG [Ca2 +] i en NO productie werden kwantitatief gemeten op individueel celniveau, die de functionaliteit van de gekweekte microvaatjes gevalideerd. Deze microfluïdische apparaat kan ECs te groeien onder goed gecontroleerde, fysiologisch relevante stroom, waarbij de celkweek omgeving dichter bij in vivo dan die in de conventionele, statische 2D culturen maakt. Het microkanaal netwerk ontwerp is zeer veelzijdig, en het fabricageproces is eenvoudig en herhaalbaar. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in de confocale microscopische of conventionele systeem voor hoge resolutie beeldvorming. Belangrijker, omdat de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, zal deze benadering een nuttig instrument om te onderzoeken hoepathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters hebben voor de EC en geven inzicht in de klinische problemen. Het kan ook worden ontwikkeld als een platform voor drug discovery.

In dit gedeelte wordt een aantal van de resultaten verkregen met de gekweekte microvaatjes netwerk ontwikkeld met dit protocol resultaten. Het microkanaal patroon is een drie niveau vertakking netwerk (figuur 1A). In dit ontwerp, een 159 micrometer breed moeder kanaal takken in twee 126 micrometer brede kanalen, en takken weer in vier 100 micrometer breed dochter kanalen. Een 3D numerieke simulatie werd uitgevoerd om de schuifspanning verdeling schatten onder de stroomsn...

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een microfluïdisch apparaat dat endotheelcellen in staat stelt om te groeien onder fysiologisch relevante schuifspanning en het meten van de door agonisten geïnduceerde veranderingen in hun calcium- en stikstofoxideproductie. Deze methode kan bijdragen aan de verdere ontwikkeling van microvatonderzoek door het in vitro microvatmodel te valideren en de kloof tussen in vivo en in vitro studies te overbruggen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het veelzijdige ontwerp van de microkanalen om diverse vasculatuur na te bootsen en de verbeterde celculturomgeving, die dichter bij de in vivo situatie ligt dan de statische omstandigheden van oorspronkelijke culturen.Sulei en Xiang, beiden uit mijn laboratorium, zullen de procedures demonstreren. Gebruik voordat u begint standaard fotolithografie om een mastermold te maken en zachte lithografie om de PDMS-microkanaalapparaten te fabriceren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de microkanaalapparaten voor te bereiden, bedekt u eerst de in- en uitlaat met een dun stukje PDMS en plaatst u het apparaat in een Petrischaal met een nat tissue.Wikkel daarna de schaal in Parafilm en steriliseer het apparaat gedurende ten minste drie uur onder UV-licht. De volgende stap is het aanbrengen van het fibronectine. Plaats eerst een druppel van 30 tot 50 µL PBS bij de inlaat.Creëer een vacuüm bij de uitlaat om het apparaat te spoelen. Plaats vervolgens een druppel fibronectine van 100 µg/mL bij de inlaat. Creëer een vacuüm bij de uitlaat om de fibronectine-oplossing te laden.Dek vervolgens de inlaat en uitlaat af. Wikkel de schaal opnieuw in met Parafilm en incubeer het apparaat gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Spoel het apparaat de volgende dag handmatig drie keer met PBS.Vul het vervolgens met 30 tot 50 µL celkweekmedium en warm het apparaat minstens 15 minuten op in een incubator bij 37 °C. Begin met het mengen van HUVEC's in HUVEC-kweekmedium met acht procent Dextran bij een concentratie van twee tot vier miljoen cellen per milliliter. De Dextran is nodig om de viscositeit te verhogen en daarmee de celzaaiing te verbeteren.Plaats vervolgens 10 tot 20 µL cellen boven de inlaat en voer deze in via zwaikracht of door capillaire werking met een glazen Pasteurpipet bij de uitlaat. Incubeer het device daarna gedurende 15 tot 20 minuten. Controleer vervolgens de status van de seeding onder een microscoop.Voeg indien nodig meer cellen toe om de gewenste celdichtheid te bereiken. Zodra er voldoende cellen zijn geladen, spoel het apparaat voorzichtig om met normaal, warm celkweekmedium om de dextraan te verwijderen. Kweek het apparaat vervolgens gedurende zes uur zonder mediumperfusie.Stel vervolgens de slangverbindingen in voor de langetermijnperfusie. Plak het apparaat op een Petrischaal en verbind daarna de inlaatslang met een spuit met een naald. Plaats slangen in zowel de inlaat als de uitlaat van het apparaat.Sluit de uitlaatslang aan op een afvalopvangbak. Plaats vervolgens de schaal en de afvalcontainer in een incubator. Verbind de spuit met een lange inlaatslang met een externe perfusiepomp die door de deur van de incubator loopt.Stel vervolgens de perfusiesnelheid in volgens het experimentele ontwerp. Met een goed gecontroleerde perfusie kan de cultuur in het microvaatnetwerk tot twee weken in stand worden gehouden. Hierdoor kan het worden uitgebreid naar langetermijnstudies die de cellulaire en hemodynamische omgeving in verschillende fysiologische en pathologische condities nabootsen.Om te beginnen met de immunokleuring, zoals de labeling van VE-cadherine, fixeer de cellen eerst door te perfunderen met twee procent paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Houd na een reeks perfusies om te blokkeren, te permeabiliseren en te kleuren met antilichamen het apparaat op vier graden Celsius tot de cellen worden afgebeeld. Om de calciumconcentratie in de cellen af te beelden, perfundeer het apparaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met 10 milligram per milliliter albumine in Ringer-oplossing.Perfuseer het apparaat vervolgens gedurende 40 minuten met vijf micromolair Fluo-4 AM bij 37 °C. Spoel daarna het aan het lumen gebonden Fluo-4 AM gedurende 15 minuten uit met albumin Ringers bij 37 °C. Start vervolgens het confocale systeem op voor beeldvorming van de intercellulaire calciumgehaltes met Fluo-4 AM. Neem beelden op van de met Fluo-4 geladen microvaten.Verzamel gedurende 10 minuten de baseline-beelden. Perfuseer het apparaat vervolgens continu met 10 micromolar ATP en registreer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit gedurende 20 minuten. Om de productie van stikstofmonoxide in de cellen in beeld te brengen, wordt het apparaat 15 minuten lang geperfuseerd met albumine-Ringer bij 37 degrees Celsius.Perfuseer vervolgens de cellen met 5 µM DAF-2 DA gedurende ongeveer 35 tot 40 minuten bij 37 °C. Stel daarna het fluorescentie-beeldvormingssysteem in om de ATP-geïnduceerde productie van stikstofmonoxide te meten. Registreer de baseline gedurende 5 minuten, perfuseer het apparaat vervolgens met 10 µM ATP en verzamel de beelden gedurende 30 minuten met intervallen van één minuut.Voor de meting van stikstofmonoxide in cellen is het belangrijk om te begrijpen dat de detach-adapter voor het intensiteitsprofiel een cumulatieve productie van stikstofmonoxide over de tijd vertegenwoordigt en geen stikstofmonoxideconcentratie. Selecteer handmatig de regio's van interesse (ROI's) uit de verzamelde beelden op het niveau van individuele cellen. Elke ROI beslaat het gebied van één individuele cel, wat kan worden aangegeven door de fluorescentieomtrek.Kwantificeer de door ATP geïnduceerde veranderingen in endotheliaal calcium en stikstofmonoxide. Dit gebeurt door de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van Fluo-4 te berekenen, na aftrek van de weefselachtergrond. Kwantificeer de productiesnelheid van stikstofmonoxide door de eerste differentiële omzetting van de fluorescentie-intensiteit van DAF-2 over de tijd uit te voeren.Het microkanaalpatroon in het device heeft een vertakkingsnetwerk van drie niveaus. Er is een 3D-numerieke simulatie uitgevoerd om de schuifspanningsverdelingen te schatten bij een stroomsnelheid van 0,35 microliters per minuut. Endotheelcellen werden in het netwerk gezaaid zoals beschreven.Vervolgens werden F-actine en kernen gelabeld. Op dezelfde manier werd ook VE-cadherine gekleurd. De resultaten waren vergelijkbaar met de VE-cadherine-expressie in een intacte venule.Vervolgens werden de door ATP geïnduceerde stijgingen in intracellulair calcium en de productie van stikstofmonoxide onderzocht. Calciumgehaltes werden onderzocht met Fluo-4 AM, zoals beschreven in het protocolgedeelte. De productie van stikstofmonoxide werd gemonitord met DAF-2 DA, zoals beschreven in het protocolgedeelte.De resultaten waren vergelijkbaar met die verkregen uit individueel geperfundeerde intacte venulen. De opstelling was eenvoudig en strak regelbaar onder biologische condities en in dynamische vloeistofomgevingen, wat met conventionele microskill-technieken niet mogelijk zou zijn geweest. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het apparaat fabriceert en hoe u calcium- en stikstofoxidemetingen uitvoert.Nadat deze techniek de weg had vrijgemaakt voor onderzoekers, was het niet alleen mogelijk om onderliggende agonist-geïnduceerde processen te onderzoeken, maar werden er ook bredere toepassingen geopend voor biomedisch onderzoek.

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.

Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie Angiogenese

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Leer een microfluïdische methode voor endotheelbiologie met HUVEC-cellen onder fysiologische stroming. Dit model valideert in vitro microvaten en meet real-time calcium- en stikstofoxide-reacties op ATP.

Ontwikkeling en karakterisering van In Vitro Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale Ca 2+ i En productie van stikstofoxide (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling en karakterisering van

Meer video's verkennen