Name: In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van pancreas progenitorcellen uit volwassen muizen met methylcellulose medium. Deze methode onderzoekt zelfvernieuwing en differentiatiepotentieel van individuele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Lucy Brown en Alexander Spalla uit de Analytical Cytometry Core in het City of Hope voor hulp bij het sorteren. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie ​​NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie ​​RB5-07398 naar DAT Supports uit de Joseph J. Jacobs Institute for Molecular engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar dAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Financiering: Dit werk is gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie ​​NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie ​​RB5-07398 aan DAT Ondersteunt uit de Joseph J. JacobsInstitute for Molecular Engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar DAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Onderzoek gemeld in deze publicatie opgenomen werkzaamheden in de Analytical Cytometry Core and Light Microscopie Digital Imaging Core ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award nummer P30CA33572. Studie sponsor: De sponsor heeft niet deelgenomen aan de onderzoeksopzet, het verzamelen, analyseren, of de interpretatie van de gegevens.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De alvleesklier kolonie assays en enkele kolonie analyses die hier beschreven werden geïnspireerd door de methylcellulose-bevattend hematopoietische kolonie testen die belangrijke rollen in het ontcijferen van de biologie van hematopoietische stamcellen in de afgelopen decennia 23 hebben gespeeld. In deze assays (figuur 5), gescheiden pancreatische cellen uitgeplaat in methylcellulose bevattende halfvaste media met geschikte groeifactoren en ECM eiwitten die de vorming van Ring, Dense of endo...

De alvleesklier bestaat uit drie grote cellijnen; acinar cellen scheiden spijsverteringsenzymen, leidingen afscheiden mucine af te weren ziektekiemen en spijsverteringsenzymen vervoeren naar de darmen, en endocriene cellen scheiden hormonen, waaronder insuline en glucagon, die glucose homeostase te handhaven. Tijdens de embryonale ontwikkeling van de pancreas, de vroege ductale cellen zijn de bron van de tri-potente stamcellen kan leiden tot de drie lijnen in de pancreata van volwassen dieren 1,2. Omdat volwassen stamcellen en progenitor cellen, zoals beenmerg stamcellen, reeds met succes gebruikt om verschillende ziekten te behandelen 3, is er grote interesse in het vinden van de stamcellen en voorlopercellen in de volwassen pancreas. Als isolatie en manipulatie van volwassen pancreas stamcellen en progenitorcellen mogelijk was, konden deze cellen worden gebruikt om ziekten zoals type 1 diabetes, waarbij de insuline uitscheidende cellen vernietigd door autoimmuniteit. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Of tri-potente stamcellen bestaan ​​nog steeds in volwassen pancreas kabelgoten na de voltooiing van de embryonale ontwikkeling is een vraag die zwaar wordt gedebatteerd in de wetenschappelijke gemeenschap. In dit debat, en het gebruik van in vivo cre-lox lineage-tracing technieken, Inada en collega&#39;s toonden aan dat volwassen muizen ductaal cellen gelabeld met een marker, koolzuuranhydrase II, aanleiding kan geven tot alle drie de alvleesklier lijnen 4 geven. Het gebruik van andere ductale merkers, zoals HNF1b 5 en SOX9 2, werd geconcludeerd dat ductale cellen niet de belangrijkste bron van beta-cellen in volwassen muizen. Enkele jaren geleden stelden we voor dat de oorzaak van de bovengenoemde discussie door gebrek kan, in het gebied 6,7 van passende analytische instrumenten die kunnen worden gebruikt voor zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor meten definieert een stamcel. De in vivo cre-lox-lineage tracing techniek genoemdhierboven kan bewijs voor de voorlopercellen-nageslacht relatie op een bevolking niveau. Echter, deze lineage tracing techniek beperkt in haar vermogen om te onderscheiden of enkele stamcellen kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in meerdere lijnen. Eencellige analyse is belangrijk omdat wanneer verschillende mono-potente stamcellen elk met een verschillende afkomst potentieel, samen geanalyseerd, kunnen gezamenlijk lijken ze multi-lijn differentiatie capaciteiten. Bovendien stamcellen zijn meestal een kleine populatie van volwassen organen. De activiteiten van een kleine celpopulatie kan worden gemaskeerd door de grote bevolkingscentra. Daarom is een negatief resultaat van een studie populatie niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van stamcellen. Tenslotte wordt cre-lox lineage tracing niet toelaten dat de meting van zelfvernieuwing. Beginnen aanpakken van de technische gat in het gebied van pancreatische voorlopercellen celbiologie, kolonie 7-11 of 12-15 organoïde </sup&gt; assays met behulp van 3D kweeksystemen werden bedacht. Twee Testen van kolonies van pancreatische voorlopers ontwikkeld in ons laboratorium: één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrix (ECM) (zie werkwijzen en apparatuur Table), en de andere bevat laminine hydrogel, een gedefinieerde kunstmatige ECM eiwitten 7-11. Voorlopercellen worden gemengd in semi-vast medium dat methylcellulose. Methylcellulose is een biologisch inert en viskeus materiaal bereid uit houtvezels en werd routinematig gebruikt in hematopoietische Testen van kolonies 16. De methylcellulose bevattende halfvast medium beperkt de beweging van één progenitorcellen zodat ze niet opnieuw aggregaat. Toch is het medium is zacht genoeg om een ​​voorlopercel te groeien en differentiëren in een kolonie van cellen in de 3D-ruimte. Volgens de traditie van de hematologen, een pancreas voorlopercellen cellen die in staat zijn die aanleiding geven tot een kolonie van cellen was, was named een pancreas-kiemgetal (PCFU). PCFUs, wanneer ze groeien in het muizen-bevattende ECM kolonie assay, aanleiding geven tot cystic kolonies die de naam &quot;Ring&quot; kolonies 7. Na toevoeging van een Wnt-agonist, R-spondin1, in het muizen-ECM met cultuur, sommige Ring kolonies te zetten in &#39;Dense &quot;kolonies 7. In dit artikel worden deze twee soorten kolonies gegroeid in muizen ECM cultuur gezamenlijk aangeduid als &quot;Ring / Dense&quot; kolonies. Wanneer Ring / Dense kolonies kunnen worden gescheiden in enkele celsuspensie en opnieuw uitgeplaat in culturen die laminine hydrogel bevatten, &quot;Endocrine / Acinaire&quot; kolonies gevormd 7. Met behulp van een kolonie analyses bleek dat de meeste Ring / Dense en endocriene / Acinaire kolonies, hetzij uit volwassen (2-4 maanden oud) 7,11 of jong (1 week oud) 9 muizen pancreas, druk alledrie lineage markers. Dit suggereert dat de meeste PCFUs oorsprong zijn tri-potente. In het muizen-bevattende ECM kolonie assay, volwassen muizen PCFUs robuust zichzelf te vernieuwen en uit te breiden ongeveer 500.000 keer meer dan 11 weken in de cultuur 7. Murine ECM ondersteunt bij voorkeur de differentiatie van ductale cellen over endocriene en acinaire lineages, terwijl in de aanwezigheid van laminine hydrogel, murine PCFUs aangemoedigd om bij voorkeur differentiëren tot endocriene en acinaire cellen en in mindere mate aan de ductale lijn 7,9,11. Belangrijk is Insuline + Glucagon - mono-hormonale cellen worden gegenereerd in de laminine hydrogel cultuur en uitscheiden van insuline in reactie op stimulatie glucose in vitro 7,9, wat suggereert functionele volwassenheid. De tri-lineage differentiatie potentieel 7,9 en zelf-vernieuwing 11 van de individuele PCFUs worden bevestigd door eencellige Micromanipulatie, dat wil zeggen, het kweken van een cel per putje voor de vorming van kolonies. Samen vormen deze resultaten tonen dat er een zelf-vernieuwing, tri-potent, voorlopercellen-achtige cellen in de postnatale muizen alvleesklier die activiteiten in 3D cultuur te laten zien. De muizen PCFU assays beschreven in dit artikel worden afgeleid van een kolonie assay ontwikkeld voor progenitorcellen opzichte van muriene embryonale stamcellen (mESCs) 17. Dat protocol is vastgelegd in detail beschreven in een ander Jupiter publicatie 18. De cultuur componenten en technieken die nodig zijn om de murine-bevattende ECM kolonieproefmedium voor volwassen PCFUs voeren zijn dezelfde als voor mES afkomstige voorlopers 17,18. Daarom zijn deze aspecten van de bepaling hier niet worden herhaald; in plaats daarvan de volgende procedures aan de orde: 1) dissociatie van de volwassen pancreas en sorteren CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen, die PCFUs verrijken van volwassen muizen 7, 2) eencellige manipulatie van de gesorteerde cellen, 3) single-kolonie analyseert het gebruik van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van colonies in single-cell schorsing en re-plating in muizen ECM of laminine hydrogel kolonie assays.

<table><tbody><tr><td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Laminin Hydrogel</td><td>Verstrekt door David Tirrell (Pasadena, CA, USA)</td><td></td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>1.500 centipoise (dynamische viscositeits eenheid gelijk aan 15 g/cm/sec) (hoge viscositeit)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Conical vial</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Suspension culture dish</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td><td>11088831001</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>lage endotoxine, azide vrij</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Anti-mucin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td><td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td>Molecuul biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Filter Mesh</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m filter mesh</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 Well Suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (Previously 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Syringe</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Syringe</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &amp; Assay Loading Reagent Kit</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish</td><td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Petri dish met glazen bodem</td></tr><tr><td>Mouth Piece/Rubber Tubing</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor</td><td>R&amp;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Voorraad bewaard bij -80 &#176;C</td></tr><tr><td>Activin B</td><td>R&amp;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Voorraad bewaard bij -80 &#176;C</td></tr><tr><td>Extend

in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van tri-potente progenitor cellen geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stam en stamcellen uit volwassen pancreas zou een potentiële bron van therapeutische beta-achtige cellen voor de behandeling van patiënten met type 1 diabetes. Het is echter nog onbekend of stamcellen en voorlopercellen bestaan ​​in de volwassen pancreas. Onderzoekstrategieën gebruik cre-lox-lineage tracing bij volwassen muizen resultaten die hetzij bevestigd of weerlegd het idee dat beta-cellen kunnen worden gegenereerd uit de leidingen, de vermoedelijke plaats waar volwassen pancreas voorlopercellen mogen verblijven opgeleverd. Deze in vivo cre-lox-lineage tracing, echter niet de vragen van zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor een stamcel definiëren beantwoorden. Om te beginnen met het aanpakken van deze technische kloof, we bedacht 3-dimensionale kolonie assays voor alvleesklier voorlopers. Kort na onze eerste publicatie, andere laboratoria onafhankelijk ontwikkelde een vergelijkbaar, maar niet identiek, methode genaamd de organoïde test. Vergeleken met de organoïde assay onze werkwijze pastmethylcellulose, waarin viskeuze oplossingen die de opname van extracellulaire matrixeiwitten bij lage concentraties mogelijk maakt. De methylcellulose-bevattende assays kan vergemakkelijken detectie en analyse van progenitorcellen bij de enkele-celniveau, die kritisch zijn als voorlopers kleine subpopulatie vormen, zoals het geval is voor vele organen volwassen stamcellen. Samen resultaten van verschillende laboratoria aan in vitro zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie van pancreatische voorlopercellen-achtige cellen van muizen. De huidige protocollen beschrijven twee-methylcellulose gebaseerde kolonie assays om de muis alvleesklier voorlopercellen te karakteriseren; één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrixeiwitten en de andere een kunstmatige extracellulaire matrix eiwit bekend als laminine hydrogel. De hier getoonde technieken zijn 1) dissociatie van de pancreas en sorteren van CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen van volwassen muizen, 2) enkele cel manipulatie van de sorted cellen, 3) enkele kolonie geanalyseerd met behulp van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van primaire kolonies in single-cell schorsingen en re-plating in secundaire kolonie assays om zelfvernieuwing of differentiatie te beoordelen.

Volwassen pancreas progenitorcellen kunnen worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering (figuur 1). De SOX9 / EGFP transgene muizenlijn hier gebruikt werd eerst gegenereerd als gevolg van de GENSAT Breinwijzer Project 19 en het EGFP reporter onder de controle van een bacteriële kunstmatige chromosoom bevattende ~ 75 kb stroomopwaarts en ~ 150 kb stroomafwaarts sequenties van SOX9 20 . In deze muizen, EGFP etiketten ductus pancreaticu...

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Het algemene doel van deze protocollen is het karakteriseren van celkolonies die zijn gegroeid uit pancreatische progenitorcellen, geïsoleerd uit volwassen muizen, met behulp van kweekassays die gebruikmaken van een semi-solide medium met methylcellulose. Onze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de pancreatische progenitorcelbiologie, zoals: wat zijn de zelfvernieuwings- en differentiatiecapaciteiten van progenitorcellen in de pancreas van volwassenen? Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze de studie van individuele progenitorcellen mogelijk maken, wat essentieel is om hun werkelijke biologische potentieel vast te stellen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methoden toen we beseften dat de kolonievormingsassays die werden gebruikt voor het bestuderen van hematopoëtische stamcellen ook konden worden toegepast op pancreascelpopulaties. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Jacob Tremblay, een promovendus, Dr. Janine Quijano, een postdoc, en mejuffrouw Angela Luo, een technicus, allen afkomstig uit mijn laboratorium. Maak zo spoedig mogelijk na het offeren met een schaar een verticale incisie in de middellijn van de buikwand en open de buikholte.Til de milt voorzichtig op met een pincet en knip met een schaar het bindweefsel tussen de milt en de splenische lob van de pancreas door. Sever op dezelfde wijze het bindweefsel van de duodenale en gastrische lobben en plaats de pancreasweefsels in een Petrischaal met DPBS, aangevuld met 0,1% BSA en antibiotica, op ijs. Verwijder vervolgens onder een dissectiemicroscoop het vetweefsel met een fijnpuntig pincet.Breng de pancreasen nu over naar een weefselkweekkast en spoel het weefsel in drie opeenvolgende Petri-schalen van 100 millimeter die elk 10 milliliter koude PBS plus BSA bevatten. Plaats de pancreasen na de laatste wasbeurt in een steriele droge Petri-schaal om zoveel mogelijk PBS plus BSA te verwijderen, en breng de weefsels over naar een andere droge Petri-schaal op ijs. Gebruik vervolgens veerscharen om de pancreasen twee tot drie minuten fijn te hakken totdat er kleine weefselstukjes zijn ontstaan, en suspendeer de weefselfragmenten in twee tot drie milliliter vers bereide koude PBS BSA DNase I-oplossing.Overbreng de stukken met een pipet van 10 milliliter naar een conische buis van 50 milliliter en voeg voldoende PBS BSA DNase I toe om het totale volume aan te vullen tot 10 milliliter. Voeg vervolgens 350 tot 450 microliters collagenase B toe aan de weefsels. Plaats de buis gedurende acht minuten in een waterbad van 37 degree Celsius, waarbij elke drie tot vier minuten wordt gezwenkt.Gebruik aan het einde van de incubatie een spuit van 10 milliliter met een naald van 16,5 gauge om de weefseloplossing op te zuigen en vervolgens zeven keer langs de wand van de buis van 50 milliliter te spuiten bij kamertemperatuur. Plaats de weefsels daarna opnieuw in het waterbad voor nog eens acht minuten met af en toe zwenken, gevolgd door zeven cycli met de spuit zoals zojuist gedemonstreerd. Breng na de laatste mechanische disruptie een aliquot van 10 µL van de celsuspensie over op een droge Petrischaal en bevestig de aanwezigheid van enkelvoudige cellen en kleine celclusters onder een inverted fasecontrastlichtmicroscoop met een 10x objectief.Plaats de buis vervolgens op ijs en vul het totale volume aan tot 50 milliliters met PBS BSA DNase I. Centrifugeer de cellen en gebruik een P1000-pipet om de pellet opnieuw te suspenderen in vijf milliliters koude PBS BSA DNase I. Filter de cellen vervolgens door een nylon mesh-filter van 70 micron, gevolgd door een nylon mesh-filter van 40 micron, in een nieuwe conische polypropyleen buis van 50 milliliter. Stel het volume bij naar 5 milliliters PBS BSA DNase I en tel de cellen. Verdun daarna de enkelcel-suspensie op ijs in koude PBS BSA DNase I tot een uiteindelijke concentratie van twee keer 10 to the seven cellen per milliliter.Om pancreascolonieën die zijn gekweekt in semi-solide medium met methylcellulose via whole-mount immunokleuring te behandelen, dient u eerst een glazen Pasteurpipet met een fijne opening te vervaardigen met behulp van een Bunsenbrander. Bevestig vervolgens het smalle uiteinde van een pipetteertip van 1 mL aan één uiteinde van een dunwandige rubberen slang en een mondstuk aan het andere uiteinde. Bevestig de glazen Pasteurpipet aan het brede uiteinde van een pipetteertip.Zuig vervolgens 10 tot 50 µL DMEM/F12-medium met één procent methylcellulose op in de mondpipet. Plaats de schaal met kolonies nu op de tafel van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop en gebruik het 10x objectief om geschikte kolonies voor isolatie te vinden. Plaats vervolgens de opening van de pipet naast de gewenste kolonie en oefen langzaam zuigkracht uit met de mond om een enkele kolonie op te nemen.Voor een effectieve collectie is het belangrijk om te controleren of de betreffende kolonie scherp is gesteld voordat de opening van de glazen pipet naast de celcluster wordt geplaatst. Zodra de kolonie is geoogst, wordt de pipetpunt in een putje van een 96-wellplaat met 4%paraformaldehyde geplaatst en de kolonie in het putje gedeponeerd. Nadat alle koloniën zijn verzameld, worden de koloniën gedurende de nacht bij vier graden Celsius gefixeerd onder zachte schudding.Was de volgende ochtend de kolonies twee keer in PBS gedurende 10 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Vanaf dit punt worden kolonies opgepikt met een plastic P10-pipet met een gebogen tip. Bewaar de gefixeerde kolonies na de tweede wasbeurt overnacht in 1,5 milliliter buisjes gevuld met paraffine bij vier graden Celsius.Breng de kolonies vervolgens over naar individuele putjes van een zwarte 96-well plaat met een transparante bodem die 200 µL blokkeringsbuffer per putje bevat. Incubeer de plaat overnacht bij vier °C onder zachte schudding. Breng de kolonies de volgende ochtend over naar nieuwe putjes met 200 µL van het primaire antilichaam van belang voor een volgende overnacht-cultuur bij vier °C onder zachte schudding.Breng de volgende ochtend de kolonies over naar drie opeenvolgende wells met 200 µL PBS plus 0,1% Tween 20 voor wasstappen van 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de derde wasbeurt worden de kolonies overgebracht naar schone wells met 200 µL van het juiste secundaire antilichaam, waarna de plaat twee uur in het donker bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd. Na afloop van de incubatie worden de kolonies drie keer gewassen in PBS Tween, zoals zojuist gedemonstreerd, en vervolgens overgebracht naar nieuwe wells met DAPI voor vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens de immuungekleurde kolonies samen in een glazen Petri-schaal van 35 millimeter met een glazen bodem en dek ze af met een dekglas. Beeld de kolonies tot slot af met een confocale microscoop. Volwassen pancreatische progenitorcellen kunnen worden verrijkt door middel van fluorescence-activated cell sorting met behulp van de juiste gating-parameters, aangezien het vermogen om kolonies te vormen alleen is aangetroffen in CD133 Sox9/EGFP-positieve ductale cellen.De pancreaskolonies kunnen vervolgens op basis van hun morfologie worden geclassificeerd middels omgekeerde fasecontrastlichtmicroscopie. Na handmatige selectie kunnen de kolonies ook worden geanalyseerd via microfluïdische qRT-PCR-analyse voor genexpressie, of via whole mount immunokleuring voor eiwitexpressie. Veel individuele kolonies brengen inderdaad lijnmarkers voor ductale, endocriene en acinaire cellen tot expressie, wat aangeeft dat de meeste initiërende pancreaskolonie-vormende progenitorcellen voor deze kolonies tri-potent zijn.Zodra ze onder de knie zijn, kunnen de procedures voor dissectie, dissociatie, celkleuring en sortering, en het uitplaten van cellen in een semi-solide medium met methylcellulose in zes tot zeven uur worden voltooid als ze correct worden uitgevoerd. Na de kolonievorming kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve RT-PCR, western blot of assays voor insulinesecretie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de genexpressie of functionele vermogens van de kolonies te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een pancreas van een volwassen muis dissociateert en hoe u kolonies karakteriseert die zijn gegenereerd uit pancreatische progenitorcellen in semi-solide culturen met methylcellulose.

in-vitro-colony-assays-for-characterizing-tri-potent-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een drie-dimensionale Monogene assay die het mogelijk maakt de pancreas-achtige voorouders om te differentiëren in de insuline-expressie kolonies is beschreven. Deze methode maakt gebruik van semi-vaste media met methylcellulose, Matrigel en groeifactoren, waarin de afzonderlijke progenitors prolifereren en...

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

Een protocol te isoleren, cultuur en imago eilandje cel clusters (ICC), afkomstig van menselijke foetale pancreas cellen wordt beschreven. De methode beschrijft de stappen die nodig zijn om ICC te genereren uit weefsel, cultuur als monolagen of in suspensie als aggregaten, en voor markers van proliferatie en alvleesklier cel beslissingen over het lot.

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

Hier beschrijven we een 4-traps protocol om menselijke embryonale stamcellen te differentiëren naar NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen in vitro. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van humane pluripotente stamcellijnen.

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

De differentiatie van stamcellen in eilandjescellen biedt een alternatieve oplossing voor conventionele diabetesbehandeling en ziektemodellering. We beschrijven een gedetailleerd stamcelkweekprotocol dat een commerciële differentiatiekit combineert met een eerder gevalideerde methode om te helpen bij het produceren van insuline-afscheidende, van stamcellen afgeleide eilandjes in een schaaltje.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van pancreas progenitorcellen uit volwassen muizen met methylcellulose medium. Deze methode onderzoekt zelfvernieuwing en differentiatiepotentieel van individuele cellen.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier (Video) | JoVE Journal

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Meer video's verkennen