Name: In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van pancreas progenitorcellen uit volwassen muizen met methylcellulose medium. Deze methode onderzoekt zelfvernieuwing en differentiatiepotentieel van individuele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Lucy Brown en Alexander Spalla uit de Analytical Cytometry Core in het City of Hope voor hulp bij het sorteren. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie ​​NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie ​​RB5-07398 naar DAT Supports uit de Joseph J. Jacobs Institute for Molecular engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar dAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Financiering: Dit werk is gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie ​​NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie ​​RB5-07398 aan DAT Ondersteunt uit de Joseph J. JacobsInstitute for Molecular Engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar DAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Onderzoek gemeld in deze publicatie opgenomen werkzaamheden in de Analytical Cytometry Core and Light Microscopie Digital Imaging Core ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award nummer P30CA33572. Studie sponsor: De sponsor heeft niet deelgenomen aan de onderzoeksopzet, het verzamelen, analyseren, of de interpretatie van de gegevens.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De alvleesklier kolonie assays en enkele kolonie analyses die hier beschreven werden geïnspireerd door de methylcellulose-bevattend hematopoietische kolonie testen die belangrijke rollen in het ontcijferen van de biologie van hematopoietische stamcellen in de afgelopen decennia 23 hebben gespeeld. In deze assays (figuur 5), gescheiden pancreatische cellen uitgeplaat in methylcellulose bevattende halfvaste media met geschikte groeifactoren en ECM eiwitten die de vorming van Ring, Dense of endo...

De alvleesklier bestaat uit drie grote cellijnen; acinar cellen scheiden spijsverteringsenzymen, leidingen afscheiden mucine af te weren ziektekiemen en spijsverteringsenzymen vervoeren naar de darmen, en endocriene cellen scheiden hormonen, waaronder insuline en glucagon, die glucose homeostase te handhaven. Tijdens de embryonale ontwikkeling van de pancreas, de vroege ductale cellen zijn de bron van de tri-potente stamcellen kan leiden tot de drie lijnen in de pancreata van volwassen dieren 1,2. Omdat volwassen stamcellen en progenitor cellen, zoals beenmerg stamcellen, reeds met succes gebruikt om verschillende ziekten te behandelen 3, is er grote interesse in het vinden van de stamcellen en voorlopercellen in de volwassen pancreas. Als isolatie en manipulatie van volwassen pancreas stamcellen en progenitorcellen mogelijk was, konden deze cellen worden gebruikt om ziekten zoals type 1 diabetes, waarbij de insuline uitscheidende cellen vernietigd door autoimmuniteit. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Of tri-potente stamcellen bestaan ​​nog steeds in volwassen pancreas kabelgoten na de voltooiing van de embryonale ontwikkeling is een vraag die zwaar wordt gedebatteerd in de wetenschappelijke gemeenschap. In dit debat, en het gebruik van in vivo cre-lox lineage-tracing technieken, Inada en collega&#39;s toonden aan dat volwassen muizen ductaal cellen gelabeld met een marker, koolzuuranhydrase II, aanleiding kan geven tot alle drie de alvleesklier lijnen 4 geven. Het gebruik van andere ductale merkers, zoals HNF1b 5 en SOX9 2, werd geconcludeerd dat ductale cellen niet de belangrijkste bron van beta-cellen in volwassen muizen. Enkele jaren geleden stelden we voor dat de oorzaak van de bovengenoemde discussie door gebrek kan, in het gebied 6,7 van passende analytische instrumenten die kunnen worden gebruikt voor zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor meten definieert een stamcel. De in vivo cre-lox-lineage tracing techniek genoemdhierboven kan bewijs voor de voorlopercellen-nageslacht relatie op een bevolking niveau. Echter, deze lineage tracing techniek beperkt in haar vermogen om te onderscheiden of enkele stamcellen kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in meerdere lijnen. Eencellige analyse is belangrijk omdat wanneer verschillende mono-potente stamcellen elk met een verschillende afkomst potentieel, samen geanalyseerd, kunnen gezamenlijk lijken ze multi-lijn differentiatie capaciteiten. Bovendien stamcellen zijn meestal een kleine populatie van volwassen organen. De activiteiten van een kleine celpopulatie kan worden gemaskeerd door de grote bevolkingscentra. Daarom is een negatief resultaat van een studie populatie niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van stamcellen. Tenslotte wordt cre-lox lineage tracing niet toelaten dat de meting van zelfvernieuwing. Beginnen aanpakken van de technische gat in het gebied van pancreatische voorlopercellen celbiologie, kolonie 7-11 of 12-15 organoïde </sup&gt; assays met behulp van 3D kweeksystemen werden bedacht. Twee Testen van kolonies van pancreatische voorlopers ontwikkeld in ons laboratorium: één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrix (ECM) (zie werkwijzen en apparatuur Table), en de andere bevat laminine hydrogel, een gedefinieerde kunstmatige ECM eiwitten 7-11. Voorlopercellen worden gemengd in semi-vast medium dat methylcellulose. Methylcellulose is een biologisch inert en viskeus materiaal bereid uit houtvezels en werd routinematig gebruikt in hematopoietische Testen van kolonies 16. De methylcellulose bevattende halfvast medium beperkt de beweging van één progenitorcellen zodat ze niet opnieuw aggregaat. Toch is het medium is zacht genoeg om een ​​voorlopercel te groeien en differentiëren in een kolonie van cellen in de 3D-ruimte. Volgens de traditie van de hematologen, een pancreas voorlopercellen cellen die in staat zijn die aanleiding geven tot een kolonie van cellen was, was named een pancreas-kiemgetal (PCFU). PCFUs, wanneer ze groeien in het muizen-bevattende ECM kolonie assay, aanleiding geven tot cystic kolonies die de naam &quot;Ring&quot; kolonies 7. Na toevoeging van een Wnt-agonist, R-spondin1, in het muizen-ECM met cultuur, sommige Ring kolonies te zetten in &#39;Dense &quot;kolonies 7. In dit artikel worden deze twee soorten kolonies gegroeid in muizen ECM cultuur gezamenlijk aangeduid als &quot;Ring / Dense&quot; kolonies. Wanneer Ring / Dense kolonies kunnen worden gescheiden in enkele celsuspensie en opnieuw uitgeplaat in culturen die laminine hydrogel bevatten, &quot;Endocrine / Acinaire&quot; kolonies gevormd 7. Met behulp van een kolonie analyses bleek dat de meeste Ring / Dense en endocriene / Acinaire kolonies, hetzij uit volwassen (2-4 maanden oud) 7,11 of jong (1 week oud) 9 muizen pancreas, druk alledrie lineage markers. Dit suggereert dat de meeste PCFUs oorsprong zijn tri-potente. In het muizen-bevattende ECM kolonie assay, volwassen muizen PCFUs robuust zichzelf te vernieuwen en uit te breiden ongeveer 500.000 keer meer dan 11 weken in de cultuur 7. Murine ECM ondersteunt bij voorkeur de differentiatie van ductale cellen over endocriene en acinaire lineages, terwijl in de aanwezigheid van laminine hydrogel, murine PCFUs aangemoedigd om bij voorkeur differentiëren tot endocriene en acinaire cellen en in mindere mate aan de ductale lijn 7,9,11. Belangrijk is Insuline + Glucagon - mono-hormonale cellen worden gegenereerd in de laminine hydrogel cultuur en uitscheiden van insuline in reactie op stimulatie glucose in vitro 7,9, wat suggereert functionele volwassenheid. De tri-lineage differentiatie potentieel 7,9 en zelf-vernieuwing 11 van de individuele PCFUs worden bevestigd door eencellige Micromanipulatie, dat wil zeggen, het kweken van een cel per putje voor de vorming van kolonies. Samen vormen deze resultaten tonen dat er een zelf-vernieuwing, tri-potent, voorlopercellen-achtige cellen in de postnatale muizen alvleesklier die activiteiten in 3D cultuur te laten zien. De muizen PCFU assays beschreven in dit artikel worden afgeleid van een kolonie assay ontwikkeld voor progenitorcellen opzichte van muriene embryonale stamcellen (mESCs) 17. Dat protocol is vastgelegd in detail beschreven in een ander Jupiter publicatie 18. De cultuur componenten en technieken die nodig zijn om de murine-bevattende ECM kolonieproefmedium voor volwassen PCFUs voeren zijn dezelfde als voor mES afkomstige voorlopers 17,18. Daarom zijn deze aspecten van de bepaling hier niet worden herhaald; in plaats daarvan de volgende procedures aan de orde: 1) dissociatie van de volwassen pancreas en sorteren CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen, die PCFUs verrijken van volwassen muizen 7, 2) eencellige manipulatie van de gesorteerde cellen, 3) single-kolonie analyseert het gebruik van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van colonies in single-cell schorsing en re-plating in muizen ECM of laminine hydrogel kolonie assays.

<table><tbody><tr><td>Murine ECM proteins (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Laminin Hydrogel</td><td>Verstrekt door David Tirrell (Pasadena, CA, USA)</td><td></td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>1.500 centipoise (dynamische viscositeits eenheid gelijk aan 15 g/cm/sec) (hoge viscositeit)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Conical vial</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Suspension culture dish</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td><td>11088831001</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>lage endotoxine, azide vrij</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Anti-mucin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td><td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td>Molecuul biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Filter Mesh</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m filter mesh</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 Well Suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (Previously 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Syringe</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Syringe</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample &amp; Assay Loading Reagent Kit</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish</td><td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Petri dish met glazen bodem</td></tr><tr><td>Mouth Piece/Rubber Tubing</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Voorraad bewaard bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor</td><td>R&amp;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Voorraad bewaard bij -80 &#176;C</td></tr><tr><td>Activin B</td><td>R&amp;D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Voorraad bewaard bij -80 &#176;C</td></tr><tr><td>Extend

in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van tri-potente progenitor cellen geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stam en stamcellen uit volwassen pancreas zou een potentiële bron van therapeutische beta-achtige cellen voor de behandeling van patiënten met type 1 diabetes. Het is echter nog onbekend of stamcellen en voorlopercellen bestaan ​​in de volwassen pancreas. Onderzoekstrategieën gebruik cre-lox-lineage tracing bij volwassen muizen resultaten die hetzij bevestigd of weerlegd het idee dat beta-cellen kunnen worden gegenereerd uit de leidingen, de vermoedelijke plaats waar volwassen pancreas voorlopercellen mogen verblijven opgeleverd. Deze in vivo cre-lox-lineage tracing, echter niet de vragen van zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor een stamcel definiëren beantwoorden. Om te beginnen met het aanpakken van deze technische kloof, we bedacht 3-dimensionale kolonie assays voor alvleesklier voorlopers. Kort na onze eerste publicatie, andere laboratoria onafhankelijk ontwikkelde een vergelijkbaar, maar niet identiek, methode genaamd de organoïde test. Vergeleken met de organoïde assay onze werkwijze pastmethylcellulose, waarin viskeuze oplossingen die de opname van extracellulaire matrixeiwitten bij lage concentraties mogelijk maakt. De methylcellulose-bevattende assays kan vergemakkelijken detectie en analyse van progenitorcellen bij de enkele-celniveau, die kritisch zijn als voorlopers kleine subpopulatie vormen, zoals het geval is voor vele organen volwassen stamcellen. Samen resultaten van verschillende laboratoria aan in vitro zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie van pancreatische voorlopercellen-achtige cellen van muizen. De huidige protocollen beschrijven twee-methylcellulose gebaseerde kolonie assays om de muis alvleesklier voorlopercellen te karakteriseren; één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrixeiwitten en de andere een kunstmatige extracellulaire matrix eiwit bekend als laminine hydrogel. De hier getoonde technieken zijn 1) dissociatie van de pancreas en sorteren van CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen van volwassen muizen, 2) enkele cel manipulatie van de sorted cellen, 3) enkele kolonie geanalyseerd met behulp van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van primaire kolonies in single-cell schorsingen en re-plating in secundaire kolonie assays om zelfvernieuwing of differentiatie te beoordelen.

Volwassen pancreas progenitorcellen kunnen worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering (figuur 1). De SOX9 / EGFP transgene muizenlijn hier gebruikt werd eerst gegenereerd als gevolg van de GENSAT Breinwijzer Project 19 en het EGFP reporter onder de controle van een bacteriële kunstmatige chromosoom bevattende ~ 75 kb stroomopwaarts en ~ 150 kb stroomafwaarts sequenties van SOX9 20 . In deze muizen, EGFP etiketten ductus pancreaticu...

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Het algemene doel van deze protocollen is het karakteriseren van celkolonies die zijn gegroeid uit pancreatische progenitorcellen, geïsoleerd uit volwassen muizen, met behulp van kweekassays die gebruikmaken van een semi-solide medium met methylcellulose. Onze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de pancreatische progenitorcelbiologie, zoals: wat zijn de zelfvernieuwings- en differentiatiecapaciteiten van progenitorcellen in de pancreas van volwassenen? Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze de studie van individuele progenitorcellen mogelijk maken, wat essentieel is om hun werkelijke biologische potentieel vast te stellen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methoden toen we beseften dat de kolonievormingsassays die werden gebruikt voor het bestuderen van hematopoëtische stamcellen ook konden worden toegepast op pancreascelpopulaties. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Jacob Tremblay, een promovendus, Dr. Janine Quijano, een postdoc, en mejuffrouw Angela Luo, een technicus, allen afkomstig uit mijn laboratorium. Maak zo spoedig mogelijk na het offeren met een schaar een verticale incisie in de mid

in-vitro-colony-assays-for-characterizing-tri-potent-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Kankerstamcellen (CSCs) zijn geïdentificeerd in een aantal maligniteiten. In dit protocol beschrijven we een flowcytometrische methode waarbij aldehyde dehydrogenase activiteit en CD44 en CD24 expressie CSCs isoleren van menselijke pancreas adenocarcinoom xenotransplantaten. Deze levensvatbare cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in functionele en analytische studies.

Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

Een drie-dimensionale Monogene assay die het mogelijk maakt de pancreas-achtige voorouders om te differentiëren in de insuline-expressie kolonies is beschreven. Deze methode maakt gebruik van semi-vaste media met methylcellulose, Matrigel en groeifactoren, waarin de afzonderlijke progenitors prolifereren en...

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een...

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer in vitro kolonie assays voor het karakteriseren van pancreas progenitorcellen uit volwassen muizen met methylcellulose medium. Deze methode onderzoekt zelfvernieuwing en differentiatiepotentieel van individuele cellen.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier (Video) | JoVE Journal

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Meer video's verkennen