Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Het algemene doel van deze procedure is om de differentiatie van muizen embryonale stamcellen naar volwassen luchtweg-epitheelcellen te richten, met behulp van een 3D-kweekset opgezet met gedecellulariseerde longscaffolds.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van longontwikkeling, zoals de rol van celmatrixcontracties en groeifactorsignalering tijdens differentiatie van de longlijn.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een 3D-kweeksysteem gebruikt in een gedefinieerde serumvrije omgeving, en robuuste luchtweg-epitheeldifferentiatie bereikt met beperkte besmetting van andere endoderm-lijnen.Na het euthanaseren van een volwassen Wistar-rat, volgens het tekstprotocol, bevestig het dier aan een dissectieoppervlak door de voorpoten en achterpoten te fixeren, en gebruik 70%ethanol om de borst en buik te besproeien.Maak een incisie net onder de ribbenkast.Snij door de huid en leg het diafragma bloot.Maak vervolgens kleine incisies door het diafragma, om de longen te laten terugtrekken, waardoor de kans op punctie van de longen wordt verkleind.Maak vervolgens een verticale incisie langs het borstbeen en open de borstholte om toegang te krijgen tot het hart en de longen.Vervolgens, met een hechtdraad, ligeer de inferieure vena cava en gebruik kleine dissectie schaar om een kleine incisie in het linker atrium te plaatsen.Gebruik een voorbereide 10ml spuit met een 25 gauge naald gevuld met heparine Hank's Balance zout oplossing, start longperfusie door de naald in het rechter ventrikel te steken en de buffer door de longcirculatie te duwen.Ga door met perfusie totdat de longen wit worden en het vocht dat uit het linker atrium stroomt helder wordt.Na de perfusie, leg de luchtpijp bloot en maak een kleine incisie nabij de schildklierkraakbeen voor canulatie.Vervolgens, met een plastic katheter, canuleer de luchtpijp en gebruik een hechtdraad om het op zijn plaats te bevestigen.Stel nu een zwaartekrachtperfusiesysteem op door een 10ml spuit te bevestigen aan een retortstand en klem.Vervolgens, verwijder en gooi de spuitkolf weg.Bevestig het maximale vulpunt op de spuitbuis op 20 cm boven de longen, bevestig vervolgens een tweeweg stopkraan aan het uiteinde van de spuit en een lange plastic buis aan het andere uiteinde van de stopkraan.Trek voorzichtig de katheter uit de luchtpijp en bevestig deze aan het uiteinde van de plastic buis.Giet vervolgens de decellularisatieoplossing in de spuit en laat de oplossing volledig de bevestigde plastic buis en katheter vullen.Plaats de met oplossing gevulde katheter terug in de luchtpijp en spoel de longen door deze gedurende één minuut te vullen tot totale longcapaciteit.Verwijder vervolgens de katheter uit de luchtpijp om het vocht uit de longen te laten stromen.Herhaal het spoelen van de longen acht keer met decellularisatieoplossing, gevolgd door tien spoelingen met PBS.De longen zullen wit lijken na het voltooien van de spoelstappen.Dissecteer vervolgens de luchtpijp en longen uit de nek en borstholte.Verwijder overtollig weefsel van de gedissekteerde longen, inclusief de slokdarm en het hart, en breng de longen over in koude PBS tot voorbereiding voor vibratome sectie.Om dikke secties te bereiden, maak ongeveer 15ml van 2% en 4% laag smeltpunt agarose in PBS, en voldoende 6% agarose voor het inbedden van alle lobben in kleine rechthoekige blokken.Na het overbrengen van de agarose naar 15ml buizen, plaats de buizen op een verwarmingsblok en houd de temperatuur boven de 40 graden Celsius om gelling te voorkomen.Gebruik kleine schaar om het gedecellulariseerde longweefsel te dissecteren aan het uiteinde van elke lobar bronchus en los elke lob los.Gebruik vervolgens absorberende vellen om overtollig PBS te verwijderen en breng de lobben over naar 2% agarose op de verwarmde plaat gedurende vijf minuten om het weefsel te coaten.Na het overbrengen van elke lob naar een petrischaal, plaats de schaal op een koude plaat en laat het oppervlak gedurende één minuut geleren.Plaats de lobben voorzichtig in 4% agarose en na incubatie gedurende vijf minuten en afkoeling, herhaal de coating met 6% agarose.Na coating, gebruik metalen basisvormen om elke lob afzonderlijk in 6% agarose in te bedden, met minimaal 3ml agarose rond het weefsel vanaf de randen.Richt vervolgens met behulp van pincetten elke lob uit door de grootste platte kant van het weefsel op het oppervlak van de metalen mal te plaatsen, gericht naar de experimentator, en voltooi het inbedden met behulp van plastic cassettes.Laat de blokken minimaal 30 minuten op een koude plaat geleren voordat u doorgaat met vibratome sectie.Alternatief, bewaar de blokken in een bevochtigde kamer gedurende maximaal 12 uur bij vier graden Celsius voordat u doorgaat met vibratome sectie.Om secties voor te bereiden, zet de vibratome op door de sectiekamer te vullen met koude PBS.Stel een omringende ijsbad in om een koude temperatuur te handhaven tijdens het snijden.Verwijder nu de blokken uit de metalen mallen en gebruik een scheermes om het overtollige agarose rond de lobben weg te snijden, terwijl u ongeveer drie millimeter van de rand van het weefsel houdt.Bevestig het weefsel met lijm op het midden van de monsterschaal en dompel de schaal onder in de met PBS gevulde sectiekamer.Laad de sectieblad op de vibratome.Stel de sectiegrenzen in op de vibratome door de volgende snelheid, amplitude en dikte waarden respectievelijk te selecteren.Sectieer elke lob volledig en als secties zich niet volledig van elkaar scheiden, gebruik kleine schaar om de secties handmatig vrij te snijden.Verzamel vervolgens voorzichtig scaffold secties en breng ze over in koude PBS.Gebruik pincetten om elke sectie voorzichtig los te maken van de omringende agarose.Om scaffold secties te decontamineren, voeg na overbrengen van PBS naar microcentrifugebuizen 90 eenheden per milliliter nuclease toe in PBS en incubeer op een roterende shaker bij kamertemperatuur gedurende 12 tot 24 uur.Na overbrengen van secties naar nieuwe microcentrifugebuizen, voeg volgens het tekstprotocol onder steriele omstandigheden antimicrobiële oplossing toe en incubeer op een roterende shaker bij kamertemperatuur gedurende zes uur.Gebruik