Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe geheelcel-patch-clamp opnames in vers gedissekteerde hersenslices worden uitgevoerd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van de neurowetenschappen te beantwoorden, zoals hoe experimentele controle manipulaties de activiteit van specifieke neuronen in specifieke hersengebieden veranderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om in een X vivo-voorbereiding langdurige veranderingen in neuronfuncties te identificeren die zich hebben ontwikkeld bij intacte wakkere dieren.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in neuronale functies in hersenslices, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals cellen in cultuur en neuronen in vivo. Het demonstreren van de procedure zal Francisco Garcia-Oscos zijn, een student uit mijn lab. Om deze procedure te beginnen, trekt u met een plastic trim-tip transferpipet voorzichtig een hersenslice uit de herstelkamer.

Plaats de transferpipet in de opnamekamer en pers de slice voorzichtig uit de pipet op de dekglasbekleding aan de onderkant van de kamer. Gebruik vervolgens het 4x objectief van de microscoop om de slice zo te positioneren dat het gewenste gebied zich precies in het midden van de opnamekamer bevindt. Nadat de gewenste positie is bereikt, zet u de positie van de hersenslice vast met de slice-houder, ook wel harp genoemd.

Schakel vervolgens over naar het 40x objectief en laat het objectief voorzichtig zakken totdat het contact maakt met de ACSF in de kamer. Gebruik vervolgens het fijne afstelwiel om het weefsel scherp te stellen. Wanneer het focusniveau zich op weefselniveau bevindt, observeert u de cellen in het beoogde gebied.

Zoek nu een doelcel. Markeer deze op het computerscherm om de opnamemicropipet te kunnen leiden. Verhoog het objectief om voldoende ruimte te bieden voor de plaatsing van de opnamemicropipet.

Gebruik in deze stap een milliliter spuit, een niet-metalen microsyringe naald en een speciaal filter om een micropipet te vullen met de vooraf bereide interne oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipet zitten. Plaats vervolgens de micropipet in een elektrodehouder, zodat de oplossing in contact komt met de met zilverchloride beklede draadelektrode.

Draai de pipettenkap vast, zodat de kegelvormige pakking een afdichting rond de micropipet vormt. Breng vervolgens positieve druk aan met de met lucht gevulde spuit die op de pipettenhouder is aangesloten voordat u de micropipet in de ACSF dompelt om te voorkomen dat er vuil in komt. Gebruik de micro-manipulator om de pipet naar de kamer te leiden, zodat deze zich ongeveer onder het midden van het ondergedompelde objectief bevindt.

Terwijl u de micropipet met de micro-manipulator met gemiddelde tot hoge snelheid verplaatst, lokaliseert u de micropipet op het computerscherm en leidt u de micropipet naar de locatie van de cel op de XY-as. Meet intussen de weerstand van de micropipet door een spanningsstap toe te passen. Oefen positieve druk uit om eventuele luchtbellen of andere vreemde voorwerpen die de micropipet blokkeren te verwijderen.

Nadat de micropipet is opgeruimd, voert u een spanningsoffset uit om de pijpstroom naar nul te reduceren. Gebruik het fijne focuswiel van de microscoop om naar beneden te focussen terwijl u de micropipet geleidelijk laat zakken. Focus altijd eerst naar beneden en laat de micropipet vervolgens zakken naar het focusvlak om ervoor te zorgen dat de punt van de micropipet niet abrupt in de slice doordringt.

Wanneer de micropipet contact maakt met het oppervlak van de slice, verlaagt u de snelheid van de micro-manipulator naar medium-lage modus. Breng voorzichtig lichte positieve druk aan om eventueel vuil op het pad te verwijderen. Nader vervolgens de cel, hetzij door afwisselend met de XYZ-bedieningsknoppen te werken, hetzij door diagonaal te naderen waarbij beide XZ-assen worden gewijzigd door de Z-as-knop te draaien.

Wanneer de micropipet dicht genoeg bij de cel is, verschijnt er een kuiltje op het celoppervlak. Breng nu een zwakke en korte zuiging aan via de buis die is verbonden met de zuigingsbuis van de pipettenhouder om een afdichting te maken. Terwijl een giga-afdichting wordt gevormd, gebruikt u de computergestuurde versterkercommander om het houdpotentieel van de cel naar het fysiologische rustpotentieel te brengen om plotselinge veranderingen te voorkomen wanneer het membraan scheurt.

Nadat de giga-afdichting is gevormd, compenseert u voor de snelle of langzame capasitons. Hierbij is het erg belangrijk dat de toegepaste zuiging niet te sterk is. Anders kan het membraan scheuren voordat de afdichting wordt gevormd.

Als de afdichting stabiel blijft en boven de één gigaom ligt, brengt u een korte en sterke zuiging aan om het plasmamembraan te scheuren. De zuiging moet kort en sterker zijn dan de druk die wordt toegepast bij het vormen van een afdichting. Om het membraan goed te scheuren en een stabiele geheelcel-configuratie te bereiken.

Schakel over naar de celmodus in de membraantest en bekijk verschillende parameters van de cel, zoals ingangsweerstand, seriesweerstand en membraancapaciteiten. Na het bereiken van de geheelcel-configuratie, blijft u deze parameters tijdens de opname controleren. Hier wordt een voorbeeld getoond van de helling van de geëvokte EPSC's van een enkele nucleus accumbens shell MSN.

Het verhogen van de temperatuur van 24 tot 28 en tot 32 graden Celsius verhoogt de helling van de geëvokte EPSC's. Hier wordt de amplitude van de geëvokte EPSC's beoordeeld in de spanningsklemmodus bij min 80 millivolt. Wanneer de seriesweerstand toeneemt, neemt de amplitude van de geëvokte EPSC's af.

En hier is een voorbeeld van de sporen van twee neuronen die het effect van de ingangsweerstand op het vermogen van het neuron om spikes te genereren laten zien. Neuronen worden stroomgeklemd en op min 80 millivolt gehouden. Wanneer de ingangsweerstand toeneemt, neemt ook het aantal actie