Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID
June 30th, 2016
Optische klaringstechnieken revolutioneren de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. In dit rapport beschrijven we aanpassingen van het oorspronkelijke Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol dat consistentere en goedkopere resultaten oplevert.
Het algemene doel van dit protocol is om modificaties aan het oorspronkelijke CLARITY-protocol te demonstreren, die consistentere en kosteneffectievere resultaten opleveren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen, zoals 3D-morfologie en connectiviteit in het centrale zenuwstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de consistentie van optische opheldering en microscopie in het centrale zenuwstelsel van de muis verbetert.
Op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Omdat de constructie van de beeldvormingskamer ingewikkeld is en niet direct duidelijk uit een schriftelijke beschrijving.
Verkrijg paraformaldehyde-gefixeerd hersen- en ruggenmergweefsel van muizen die fluorescente eiwitten tot expressie brengen. Hemisecteer de hersenen door deze in een plastic muis-hersenmatrix te plaatsen en langs de middellijn te snijden met een matrixmes. Voeg elk halfrond en ruggenmerg toe aan afzonderlijke 50 milliliter centrifugebuizen.
Elk bevat 40 milliliter hydrogeloplossing. Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluoroforen te beschermen. En incubeer de buizen met monsters en hydrogel gedurende zeven dagen op vier graden Celsius met zacht schudden.
Na de incubatieperiode gooit u 25 milliliter hydrogel weg en laat u het monster en ongeveer 25 milliliter hydrogel achter in de centrifugebuis. Vervolgens deoxygeneert u het monster door de dop te verwijderen, de centrifugebuis in een droogpot te plaatsen en de pot op een vacuüm aan te sluiten. Breng het vacuüm gedurende ten minste 10 minuten aan.
Schud voorzichtig om de bellen met uitgestoten zuurstof los te maken. Na 10 minuten vervangt u het vacuüm in de droogpot gedurende twee tot drie minuten door 100% stikstofgas. Zodra de druk gelijk is en de bovenkant van de droogpot kan worden geopend, sluit u de buis snel af om de herintroductie van zuurstof te voorkomen.
Vervolgens polymeriseert u het hydrogel door de buis met monster in een waterbad van 37 graden Celsius te plaatsen gedurende drie uur totdat de polymerisatie voltooid is. Na drie uur zal het gepolymeriseerde hydrogel een gel-achtige consistentie aannemen. Gebruik een spatel om het gepolymeriseerde monster uit de centrifugebuis te verwijderen en snijd vervolgens het overtollige hydrogel van het monster af.
Verwijder ten slotte het resterende hydrogel door het monster op een pluisvrij doekje te plaatsen en het weefsel er zachtjes overheen te wrijven en te rollen, waardoor alleen een dunne laag gepolymeriseerd hydrogel op het monster achterblijft. Om het proces van lipideverwijdering te starten, brengt u het gepolymeriseerde monster over naar een schone 50 milliliter centrifugebuis met 45 milliliter ophelderingsbuffer en incubeert u deze gedurende zeven dagen op 45 graden Celsius met zacht schudden. Ververs de buffer tijdens deze eerste periode van zeven dagen door de gebruikte ophelderingsbuffer in een chemisch afvalcontainer te gieten.
En voeg 45 milliliter verse ophelderingsbuffer toe. Zodra alle lipiden zijn gesolubiliseerd en het weefsel transparant wordt, brengt u het monster over naar een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis gevuld met 45 milliliter PBST en wast u het vier keer gedurende de volgende 24 uur bij 40 graden Celsius met zacht schudden om resterend SDS te verwijderen. Na de laatste PBST-wassing brengt u het monster over naar een schone 15 milliliter centrifugebuis gevuld met een microgram per milliliter DAPI en 1xPBST.
Wikt u in met folie en incubeert u gedurende 24 uur op kamertemperatuur. De volgende dag wast u drie keer in PBST bij kamertemperatuur gedurende minimaal zes uur per wasbeurt. En gaat u vervolgens verder met de brekingsindexaanpassing.
Om dit deel van de procedure te beginnen, brengt u het monster over naar een schone 15 milliliter centrifugebuis gevuld met 2-2 thiodiolethanol en 1xPBS bij PH 7,5 en incubeert u zoals op het scherm wordt getoond. Tegen het einde van de tweede incubatie, creëert u een beeldvormingskamer door een stuk herbruikbaar kleefmiddel tot een cilinder te rollen met een uniforme diameter die iets groter is dan de dikte van het monster. Legt u de cilinder in een cirkel met open uiteinde op een glazen bodem van 40 millimeter.
Gebruik vervolgens een P1000 pipettepunt om een afdichting te maken tussen het herbruikbare kleefmiddel en het glas door het rond de buitenrand van de cilinder te rollen. Pipetteer ongeveer 100 microliters van 63%TDE op de glazen schaal en spreidt u het rond om het glazen oppervlak binnen de cirkel van herbruikbaar kleefmiddel te bedekken. Gebruik vervolgens een spatel om het monster voorzichtig in het midden van de cirkel te plaatsen, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
Pipetteer vervolgens nog eens 100 microliters van 63%TDE direct op het monster en plaats onmiddellijk een 40 millimeter rond dekglas boven het herbruikbare kleefmiddel. Gebruik de index-, middel- en ringvinger van beide handen om voorzichtig rond de omtrek van de cirkel te drukken totdat het dekglas contact maakt met het monster. Breng nu langzaam de glazen bodemschaal in een rechtopstaande positie en laat het rusten tegen een oppervlak, voeg vervolgens 63%TDE toe met een pipette totdat de oplossing de kleine opening aan de bovenkant bereikt.
Gebruik een pluisvrij doekje om de pipettepunt droog te maken, zodat de oplossing niet op het glas druppelt. Voeg ten slotte siliconenelastomeer toe aan de kleine opening om de cirkel te omsluiten en een gesloten kamer te creëren. Wacht vijf minuten om te drogen en ga dan verder met beeldvorming.
Plaats de beeldvormingskamer met het monster erin op de trap van een laser scanning confocale microscoop. Open de beeldvormingssoftware om de argon-excitatielaser in te schakelen, klik op het configuratietabblad bovenaan het programma en vervolgens op het laserpictogram. Schakel het vakje aan naast argon om de laser van stroom te voorzien en beweeg de dia-schaal naar 30%. Keer terug naar het tabblad verkrijgen bovenaan.
In het vak
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit rapport bespreekt aanpassingen aan het oorspronkelijke CLARITY-protocol, die de consistentie en kosteneffectiviteit van optische clearing-technieken verbeteren. Deze ontwikkelingen zijn cruciaal voor het visualiseren van weefsels in neurowetenschappelijk onderzoek.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Optische Beeldvorming
- Weefsel Clearing-technieken
Achtergrond
- Optische clearing-technieken verbeteren de weefselvisualisatie.
- CLARITY-protocol wordt veel gebruikt voor beeldvorming in neurowetenschappen.
- Aanpassingen zijn gericht op het verbeteren van reproduceerbaarheid en het verlagen van kosten.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het begrijpen van complexe methoden.
Doel van Studie
- Om aanpassingen aan het CLARITY-protocol te demonstreren.
- Om meer consistente resultaten in optische clearing te bereiken.
- Om een kosteneffectieve methode voor neurowetenschappelijk onderzoek te bieden.
Gebruikte Methoden
- Aanpassingen aan het oorspronkelijke CLARITY-protocol.
- Visuele demonstraties van de constructie van de beeldvormingskamer.
- Toepassing in het centrale zenuwstelsel van muizen.
- Focus op 3D-morfologie en connectiviteitsanalyse.
Belangrijkste Resultaten
- Verbeterde consistentie in optische clearing.
- Kosteneffectieve methodologie voor onderzoekers.
- Verbeterde beeldvormingscapaciteiten in neurowetenschappen.
- Visuele hulpmiddelen voor complexe procedures.
Conclusies
- Aanpassingen aan het CLARITY-protocol zijn gunstig.
- Consistente resultaten kunnen neurowetenschappelijk onderzoek bevorderen.
- Visuele demonstraties helpen bij het begrijpen van complexe methoden.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Optical clearing techniques like passive CLARITY enable 3D visualization of intact neural tissue, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where serial sectioning introduces artifacts that compromise morphological and connectivity analysis. By improving consistency and reducing cost, this method supports reliable preclinical modeling of CNS disorders, enhancing predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of structural phenotypes in disease-relevant systems without tissue deformation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through intact 3D morphology and connectivity analysis in the mouse CNS.
- Operational Value: Provides biological de-risking by preserving tissue integrity while removing light-scattering lipids for clear imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative structural data on neuronal networks for target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by rendering tissue transparent and amenable to high-resolution imaging.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through passive CLARITY modifications that improve consistency in clearing outcomes.
- Platform Reuse: Enables scalable compound evaluation by creating reusable imaging chambers compatible with laser scanning confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by allowing longitudinal imaging of structural changes in intact spinal cord and brain models.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing 3D structural readouts applicable to disease progression studies.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates advancement decisions by delivering clear axonal and dendritic morphology data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, specifically supporting hypothesis testing and pathway clarification in CNS target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D imaging of neuronal morphology and connectivity in intact mouse CNS tissue.
- Screening: Describes assay readiness through tissue transparency achieved via lipid removal and refractive index matching with TDE.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as 3D reconstruction of YFP-positive neurons, dendritic arborization, and axonal tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing structural biomarkers in disease-relevant CNS models without sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Frames the technique as a reusable capability through the construction of a durable imaging chamber using reusable adhesive and glass-bottom dishes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity in CNS structural analysis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via passive CLARITY protocol modifications that eliminate electrophoretic variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing reliable 3D structural data to reduce late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative imaging of neuronal networks for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, hydrogel polymerization, and lipid clearing techniques.
- Needs instrumentation including centrifuge tubes, water baths, vacuum desiccators, and laser scanning confocal microscopes.
- Demands cross-team standardization for buffer exchange, washing steps, and refractive index matching procedures.
- Involves adaptation considerations across model systems, as timing varies from 2-4 weeks for spinal cords to 4-6 weeks for hemisected brains.
- Includes practical limitations such as the need for fluorescent protein expression or immunostaining for visualization and careful handling to avoid bubble formation during imaging chamber setup.
