Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID
30 juni 2016
Optische klaringstechnieken revolutioneren de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. In dit rapport beschrijven we aanpassingen van het oorspronkelijke Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol dat consistentere en goedkopere resultaten oplevert.
Het algemene doel van dit protocol is om modificaties aan het oorspronkelijke CLARITY-protocol te demonstreren, die consistentere en kosteneffectievere resultaten opleveren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen, zoals 3D-morfologie en connectiviteit in het centrale zenuwstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de consistentie van optische opheldering en microscopie in het centrale zenuwstelsel van de muis verbetert.
Op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Omdat de constructie van de beeldvormingskamer ingewikkeld is en niet direct duidelijk uit een schriftelijke beschrijving.
Verkrijg paraformaldehyde-gefixeerd hersen- en ruggenmergweefsel van muizen die fluorescente eiwitten tot expressie brengen. Hemisecteer de hersenen door deze in een plastic muis-hersenmatrix te plaatsen en langs de middellijn te snijden met een matrixmes. Voeg elk halfrond en ruggenmerg toe aan afzonderlijke 50 milliliter centrifugebuizen.
Elk bevat 40 milliliter hydrogeloplossing. Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluoroforen te beschermen. En incubeer de buizen met monsters en hydrogel gedurende zeven dagen op vier graden Celsius met zacht schudden.
Na de incubatieperiode gooit u 25 milliliter hydrogel weg en laat u het monster en ongeveer 25 milliliter hydrogel achter in de centrifugebuis. Vervolgens deoxygeneert u het monster door de dop te verwijderen, de centrifugebuis in een droogpot te plaatsen en de pot op een vacuüm aan te sluiten. Breng het vacuüm gedurende ten minste 10 minuten aan.
Schud voorzichtig om de bellen met uitgestoten zuurstof los te maken. Na 10 minuten vervangt u het vacuüm in de droogpot gedurende twee tot drie minuten door 100% stikstofgas. Zodra de druk gelijk is en de bovenkant van de droogpot kan worden geopend, sluit u de buis snel af om de herintroductie van zuurstof te voorkomen.
Vervolgens polymeriseert u het hydrogel door de buis met monster in een waterbad van 37 graden Celsius te plaatsen gedurende drie uur totdat de polymerisatie voltooid is. Na drie uur zal het gepolymeriseerde hydrogel een gel-achtige consistentie aannemen. Gebruik een spatel om het gepolymeriseerde monster uit de centrifugebuis te verwijderen en snijd vervolgens het overtollige hydrogel van het monster af.
Verwijder ten slotte het resterende hydrogel door het monster op een pluisvrij doekje te plaatsen en het weefsel er zachtjes overheen te wrijven en te rollen, waardoor alleen een dunne laag gepolymeriseerd hydrogel op het monster achterblijft. Om het proces van lipideverwijdering te starten, brengt u het gepolymeriseerde monster over naar een schone 50 milliliter centrifugebuis met 45 milliliter ophelderingsbuffer en incubeert u deze gedurende zeven dagen op 45 graden Celsius met zacht schudden. Ververs de buffer tijdens deze eerste periode van zeven dagen door de gebruikte ophelderingsbuffer in een chemisch afvalcontainer te gieten.
En voeg 45 milliliter verse ophelderingsbuffer toe. Zodra alle lipiden zijn gesolubiliseerd en het weefsel transparant wordt, brengt u het monster over naar een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis gevuld met 45 milliliter PBST en wast u het vier keer gedurende de volgende 24 uur bij 40 graden Celsius met zacht schudden om resterend SDS te verwijderen. Na de laatste PBST-wassing brengt u het monster over naar een schone 15 milliliter centrifugebuis gevuld met een microgram per milliliter DAPI en 1xPBST.
Wikt u in met folie en incubeert u gedurende 24 uur op kamertemperatuur. De volgende dag wast u drie keer in PBST bij kamertemperatuur gedurende minimaal zes uur per wasbeurt. En gaat u vervolgens verder met de brekingsindexaanpassing.
Om dit deel van de procedure te beginnen, brengt u het monster over naar een schone 15 milliliter centrifugebuis gevuld met 2-2 thiodiolethanol en 1xPBS bij PH 7,5 en incubeert u zoals op het scherm wordt getoond. Tegen het einde van de tweede incubatie, creëert u een beeldvormingskamer door een stuk herbruikbaar kleefmiddel tot een cilinder te rollen met een uniforme diameter die iets groter is dan de dikte van het monster. Legt u de cilinder in een cirkel met open uiteinde op een glazen bodem van 40 millimeter.
Gebruik vervolgens een P1000 pipettepunt om een afdichting te maken tussen het herbruikbare kleefmiddel en het glas door het rond de buitenrand van de cilinder te rollen. Pipetteer ongeveer 100 microliters van 63%TDE op de glazen schaal en spreidt u het rond om het glazen oppervlak binnen de cirkel van herbruikbaar kleefmiddel te bedekken. Gebruik vervolgens een spatel om het monster voorzichtig in het midden van de cirkel te plaatsen, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
Pipetteer vervolgens nog eens 100 microliters van 63%TDE direct op het monster en plaats onmiddellijk een 40 millimeter rond dekglas boven het herbruikbare kleefmiddel. Gebruik de index-, middel- en ringvinger van beide handen om voorzichtig rond de omtrek van de cirkel te drukken totdat het dekglas contact maakt met het monster. Breng nu langzaam de glazen bodemschaal in een rechtopstaande positie en laat het rusten tegen een oppervlak, voeg vervolgens 63%TDE toe met een pipette totdat de oplossing de kleine opening aan de bovenkant bereikt.
Gebruik een pluisvrij doekje om de pipettepunt droog te maken, zodat de oplossing niet op het glas druppelt. Voeg ten slotte siliconenelastomeer toe aan de kleine opening om de cirkel te omsluiten en een gesloten kamer te creëren. Wacht vijf minuten om te drogen en ga dan verder met beeldvorming.
Plaats de beeldvormingskamer met het monster erin op de trap van een laser scanning confocale microscoop. Open de beeldvormingssoftware om de argon-excitatielaser in te schakelen, klik op het configuratietabblad bovenaan het programma en vervolgens op het laserpictogram. Schakel het vakje aan naast argon om de laser van stroom te voorzien en beweeg de dia-schaal naar 30%. Keer terug naar het tabblad verkrijgen bovenaan.
In het vak
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit rapport bespreekt modificaties aan het oorspronkelijke CLARITY-protocol, waardoor de consistentie en kosteneffectiviteit van optische clearingtechnieken worden verbeterd. Deze verbeteringen zijn cruciaal voor het visualiseren van weefsels in neurowetenschappelijk onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Optische Beeldvorming
- Weefselverduนนigingstechnieken
Achtergrond
- Optische clearingtechnieken verbeteren de visualisatie van weefsels.
- Het CLARITY-protocol wordt veelvuldig gebruikt voor beeldvorming in de neurowetenschappen.
- Modificaties zijn erop gericht de reproduceerbaarheid te verhogen en de kosten te verlagen.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het begrijpen van complexe methoden.
Doel van de studie
- Om modificaties van het CLARITY-protocol te demonstreren.
- Om consistentere resultaten bij optische klaring te bereiken.
- Om een kosteneffectieve methode voor neurowetenschappelijk onderzoek te bieden.
Gebruikte methoden
- Modificaties van het oorspronkelijke CLARITY-protocol.
- Visuele demonstraties van de constructie van de beeldvormingskamer.
- Toepassing in het centrale zenuwstelsel van de muis.
- Focus op 3D-morfologie en connectiviteitsanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde consistentie bij optische klaring.
- Kosteneffectieve methodologie voor onderzoekers.
- Verbeterde beeldvormingsmogelijkheden in de neurowetenschappen.
- Visuele hulpmiddelen voor complexe procedures.
Conclusies
- Modificaties aan het CLARITY-protocol zijn gunstig.
- Consistente resultaten kunnen het neurowetenschappelijk onderzoek bevorderen.
- Visuele demonstraties helpen bij het begrijpen van complexe methoden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executives
Optische klaringstechnieken zoals passieve CLARITY maken 3D-visualisatie van intact neuraal weefsel mogelijk, waarmee een belangrijke knelpunt bij de validatie van targets in de neurowetenschappen wordt aangepakt, aangezien seriële secties artefacten introduceren die de morfologische analyse en de analyse van de connectiviteit compromitteren. Door de consistentie te verbeteren en de kosten te verlagen, ondersteunt deze methode betrouwbare preklinische modellering van CNS-stoornissen, wat het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen verhoogt. De benadering vergemakkelijkt mechanische risicoreductie door directe observatie van structurele fenotypes in ziekte-relevante systemen mogelijk te maken zonder artefacten door weefseldeformatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via intacte 3D-morfologie en connectiviteitsanalyse in het centrale zenuwstelsel van de muis.
- Operationele waarde: Biedt biologische risicoreductie door de weefselintegriteit te behouden terwijl lichtverstrooiende lipiden worden verwijderd voor heldere beeldvorming.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portefeuilleselectie door kwantitatieve structurele gegevens over neuronale netwerken te genereren voor targetvalidatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door weefsel transparant te maken en geschikt voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- Reproduceerbaarheid: Pakt de standaardisatie van de assay aan via passieve CLARITY-modificaties die de consistentie van de clearing-resultaten verbeteren.
- Hergebruik van platform: Maakt schaalbare evaluatie van verbindingen mogelijk door herbruikbare beeldvormingskamers te creëren die compatibel zijn met laser-scanning confocale microscopie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door longitudinale beeldvorming van structurele veranderingen in intacte modellen van het ruggenmerg en de hersenen mogelijk te maken.
- Preklinische Continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door 3D-structurele read-outs te bieden die toepasbaar zijn bij studies naar ziekteprogressie.
- Risico-geoptimaliseerde Beslissingen: Faciliteert beslissingen over verdere ontwikkeling door heldere data over axonale en dendritische morfologie te leveren voor mechanistisch risicobeheer.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking via lead-identificatie tot preklinisch werk, en ondersteunt specifiek hypothesetoetsing en padverduidelijking bij de validatie van CNS-targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door 3D-imaging van neuronale morfologie en connectiviteit in intact centraal zenuwstelsel (CZS)-weefsel van muizen mogelijk te maken.
- Screening: Beschrijft de gereedheid voor assays door weefseltransparantie te bereiken via lipiderverwijdering en het matchen van de brekingsindex met TDE.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve resultaten zoals 3D-reconstructie van YFP-positieve neuronen, dendritische arborisatie en axonale tracking voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door structurele biomarkers te leveren in ziekterelevante CZS-modellen zonder sectie-artefacten.
- Enterprise Reuse: Presenteert de techniek als een herbruikbare mogelijkheid door de constructie van een duurzame imagingkamer met gebruik van herbruikbare lijm en schaaltjes met een glazen bodem.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door verminderde mechanistische ambiguïteit bij de structurele analyse van het CZS.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via passieve aanpassingen aan het CLARITY-protocol die elektroforetische variabiliteit elimineren.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het leveren van betrouwbare 3D-structurele gegevens om biologische risico's in een late fase van CZS-programma's te verminderen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering via kwantitatieve beeldvorming van neuronale netwerken voor doelwitvalidatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, hydrogelpolymerisatie en lipid clearing-technieken.
- Vereist instrumentarium waaronder centrifugebuizen, waterbaden, vacuüm-desiccators en laser scanning confocale microscopen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor bufferuitwisseling, wasstappen en procedures voor het matchen van de brekingsindex.
- Omvat aanpassingen voor verschillende modelsystemen, aangezien de tijdsduur varieert van 2-4 weken voor ruggenmergen tot 4-6 weken voor hemisectie-hersenen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van fluorescent eiwitexpressie of immunokleuring voor visualisatie en zorgvuldige hantering om beluchtingsvorming tijdens de opstelling van de beeldvormingskamer te voorkomen.
