Name: Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer bioluminescentie imaging voor het volgen van Trypanosoma brucei-infectie van bloed naar hersenen bij muizen. Deze methode versnelt geneesmiddelonderzoek naar slaapziekte aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken John Kelly en Martin Taylor (London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine) voor het leveren van T. b. brucei GVR35-VSL-2 en Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) om advies over de in vivo beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation Global Health Program (subsidie ​​nummer OPPGH5337).

Ethiek Al het werk werd uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 en de London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine Dierenwelzijn en Ethiek Review Board uitgevoerd. KOMEN leidraad worden gevolgd in dit rapport. 1. In vivo Passage van Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei <ol><li> Verwijderen van een gecryopreserveerde voorraad (genoemd stabilaat) van T. b. brucei stam GVR35-VSL-2 (verkrijgbaar bij Professor John Kelly aan de London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine door de MTA) 9 van vloeibare stikstof om de temperatuur tot kamertemperatuur. Verdun stabilaat tot 2 x 10 4 trypanosomen / ml in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing glucose (PBS-G) pH 8,0 (PBS + 1 L 15 g glucose) 10. Opmerking: T. b. brucei GVR35-VSL-2 is niet besmettelijk voor de mens en vereist SAPO in licentie faciliteiten om experimenten uit te voeren. </li><li> inject een 20-25 g vrouwelijke CD1 muis met 0,2 ml verdunde trypanosomen via de intraperitoneale route (ip) met een 25 G naald. Dit is de &quot;donor muis&quot;. Plaats de besmette muis in een specifiek pathogeenvrije (SPF) -cage en diervoeders ad libitum. Opmerking: CD1 muizen zijn een gekruiste stam en T. b. brucei GVR35 infecties zijn goed gekarakteriseerd in deze stam. Echter, dit protocol ook voor inteelt of genetisch gemodificeerde stammen, maar het is belangrijk op te merken dat vachtkleur invloed kan hebben op de gevoeligheid van beeldvormende 6,9. </li><li> Monitor perifere parasitemie door bloedafname. Plaats de muis in een plastic restrainer en neemt 5 pl bloed uit de staart door venapunctie met 21 G naald of venesectie en meng 1/10 met 0,85% steriele ammoniumchloride om rode bloedcellen te lyseren en vergemakkelijken de telling. </li><li> Tel de verwaterde Bloed in een Neubauer hemocytometer. <ol><li> Laad het verdunde bloed in beide kamers. Tel de gehele centrale grid van de ene kamer naar n trypanosomen geven. Concentratie van trypanosomen in bloed = n x 10 4 trypanosomen / ml, afgesteld naar verdunningsfactor en bereken het gemiddelde van de twee kamers. Opmerking: Na ongeveer 5-7 dagen na de infectie, moet perifere parasitemie voldoende stijgen infectie uit te voeren bij een concentratie van 2 x 10 4 trypanosomen / ml. </li></ol></li><li> Wanneer trypanosoom niveaus hoog genoeg om het aantal muizen vereist, verder naar stap 1,6. Een parasitemie niveau van 6 x 10 4 trypanosomen / ml in een donor muis volstaat infectie van 10 muizen. Opmerking: Voor statistisch significant groepsgrootte, n = 6 voor elke behandeling groep muizen nodig zijn 8. Voor andere modellen van infectie zou powerberekeningen moeten worden toegepast op geschikte groepsgrootte bepalen. </li><li> Plaats muizen in een warmte box (bij 28-30 ° C gedurende ongeveer 5-10 minuten) om de staart aderen verwijden.Om terminal anesthesie, toedienen 20 mg / kg pentobarbital iv met een 25 G naald. Bevestig muis is verdoofd door zachtjes te drukken op de voetzolen te zorgen dat er geen terugtrekking reflex. </li><li> Heparinize een 21 G naald door aliquoting 5 ml heparine in 5000 USP eenheden / ml in een Bijou buis en zuigen twee keer in en uit de naald bevestigd aan een 1 ml spuit. </li><li> Neem de gehepariniseerde 21 G naald en 1 ml spuit en voer hartpunctie op de verdoofde passage muis door de naald centraal onder de ribbenkast (een strook bloed bundelen in de basis van de naald) en trek aan de zuigerstang om te voorkomen dat de kamer van het hart instorten. Verzamel minste 0,7 ml bloed. </li><li> Verdun besmet bloed aan een inoculum van 2 x 10 4 trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als stap 1.1 hierboven te produceren. Opmerking: op dit punt, het resterende bloed kan worden gecryoconserveerd voor stabilaat produceren door mengen met 8% glycerol, 20% door warmte geïnactiveerd foetaal caAls serum (hi-FCS) en 72% besmet bloed. Langzaam invriezen bij -80 ° C met een langzame-freezing container een koelsnelheid van -1 ° C / min bereikt, alvorens naar vloeibare stikstof. </li></ol> 2. Infectie van Experimental Muizen <ol><li> Plaats CD1 vrouwelijke muizen (~ 21-25 g) in een verwarming doos om voorzichtig te warm om aderen te verwijden. Plaats de verwarmde muizen in een plastic beperking en injecteer 0,2 ml verdund inoculum intraveneus met een 25 G naald in de staartader, gelijk aan 4000 trypanosomen per muis. Plaats druk op de injectieplaats daarna aan het bloeden te stoppen. Opmerking: Intraperitoneale infectie geldig infectieroute en is gebruikt in eerdere studies 10, maar we hebben deze minder reproduceerbaar dan de intraveneuze weg gevonden. </li><li> Willekeurig geïnfecteerde muizen en kooi groepen van 3 in SPF-geventileerde kooien. Als controle injecteren CD1 vrouwelijke muizen met wildtype niet-bioluminescente parasiet, T. b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Bewaken van de besmetting via bloed Film Microscopy <ol><li> Spot 5 pl bloed uit venapunctie of venesectie op een glasplaatje en het uitvoeren van een bloeduitstrijkje (met behulp van een tweede glasplaatje duw de druppel bloed over de dia om een ​​dunne film te produceren). Laat dia&#39;s aan de lucht drogen. </li><li> Bevestig het bloed uitstrijkjes met 100% methanol en vlek met Giemsa gedurende 10 minuten voor het spoelen met dH 2 O en laat aan de lucht drogen. Onder 100X doelstelling tel het aantal trypanosomen in 10 gebieden (FOV). Opmerking: Blood filmen wordt uitgevoerd samen met hele dier niet-invasieve beeldvorming zo vroeg een dag na infectie uitgevoerd. Bij het verwerken van een aantal dieren, is deze wijze van trypanosoom kwantificering voorkeur boven hemocytometer geteld als monsters bij kamertemperatuur kunnen worden bewaard en later geteld. </li></ol></li></ol> 3. Bioluminescentie Imaging Infectie Track Opmerking: Om de infectie te controleren, geheel Animal non-invasieve beeldvorming kan worden gebruikt. <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van D-luciferine, de vuurvlieg luciferase substraat in Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en 30 mg / ml. Filter steriliseren en bevriezen in aliquots bij -20 ° C. Opmerking: D-Luciferine is licht gevoelig, dus beschermen tegen licht door het wikkelen van monsters in folie. Niet herhaaldelijk vries-dooi luciferine als het activiteit 11 kan beïnvloeden. </li><li> Warm een ​​hoeveelheid van D-luciferine tot kamertemperatuur. Verwijder elke muis van de kooi (inclusief controle muizen geïnfecteerd met nonbioluminescent wildtype stam parasiet) en injecteer 150 mg / kg van het opgewarmde D-luciferine (verdund in DPBS) intraperitoneaal met een 25 G naald. Plaats de muizen in een kamer isofluorane ongeveer 5 minuten anesthesie met 2% isofluorane / O2 mengsel induceren bij 2,5 l / min. Opmerking: Muizen worden immobiel als ze onder narcose. Voor de imager hier gebruikt, kunnen 3 muizen worden tegelijk verwerkt. Als muizen zijn anesthetized langer dan 30 minuten, kan oftalmische kunsttranen zalf worden toegepast om te voorkomen dat de ogen van de muizen uitdrogen. </li><li> Voor de hier beschreven imager, opent de software en initialiseer de machine met de software instructies van de fabrikant. Acquire beelden zodra de camera en verwarmde plaat temperatuur hebben bereikt. Let op: Dit instrument is meestal niet uitgeschakeld, waardoor de machine op de achtergrond kalibraties &#39;s nachts uit te voeren. Indien het moet herstarten, moet het een kalibratiecontrole eerste run. </li><li> Plaats de verdoofde muizen in de imager (zie 3.5). Gebruik grote zwarte separatoren tussen de muizen te minimaliseren bloeden door middel van elke heldere lichtgevende signaal. Afbeelding muizen met behulp van een set van de blootstelling tijden; 1, 3, 10, 30, 60 en 180 seconden, met een gemiddelde binning, 1 f / stop en een open filter en gezichtsveld E (12,5 x 12,5 cm 2). Opmerking: De controle muizen geïnfecteerd met het wild type nonbioluminescent GVR35 parasieten te background bioluminescentie waarde. Vanuit een luciferine kinetiek experiment (Figuur 6) met dit model, hebben we ontdekt dat bioluminescentie signaal pieken op 10 minuten na toediening en imaging duurt ongeveer 5 minuten voor 3 muizen. Neem deze termijn te houden bij verlamming en beeldvorming van de muizen. </li><li> Voor een grondige beeldvorming van de muizen te garanderen, draaien om een ​​ventrale, rug- en zijaanzicht verkrijgen. Behoud consistentie in de orde van oriëntatie voor de beeldvorming tussen opeenvolgende dieren. </li><li> Na beeldvorming, laat muizen uit narcose te herstellen onder observatie alvorens terug te keren naar SPF-kooi. </li><li> Doorgaan beeldvorming muizen om de 7 dagen tot 21 dagen na de infectie. Er moet een gestage toename van bioluminescentie signaal over het gehele dier. </li><li> Bij D21, beeld en bloedfilm de muizen zoals hierboven beschreven, en dosis muizen met 40 mg / kg intraperitoneaal diminazene aceturate. Dit medicijn zal de perifere parasitemie te wissen, maar zal de bloed-brai niet overstekenn barrière kan dan beter visualisatie van de CNS infectie. Opmerking: Diminazene aceturate is een gevestigde geneesmiddel dat gebruikt wordt voor de behandeling van een vroeg stadium van dierlijke trypanosomiasis. </li><li> Doorgaan beeldvorming en controle bij D28 en D35. </li></ol> 4. Bevestiging van CNS Infection <ol><li> Bij D35, beeld muizen zoals hierboven beschreven (stappen 3,1-3,4). </li><li> Na de belichting, zodat muizen te herstellen van de anesthesie en exsanguinate muizen zoals beschreven in stap 1,6-1,8, bloedverzamelzak voor verdere analyse. </li><li> Naar aanleiding van cardiale punctie, perfuseren muizen met 20 ml PBS (optioneel: voeg 3 mg / ml luciferine tot perfusie oplossing) via het hart om bloed te verwijderen uit de organen en luciferine label dat zou hebben gewist uit het hersengebied over de tijdsinterval opnieuw van stap 4,1. </li><li> Verwijder voorzichtig de hersenen, met gebogen schaar, snijden van de basis rond de omtrek van de schedel en tillen uit het bovenste gedeelte van de schedel naar de hersenen toezachtjes worden opgeheven met gebogen pincet. </li><li> Plaats de uitgesneden hersenen op een deel van zwarte kunststof pipet en 50 ui 15 mg / ml luciferine via orgaan voorafgaand aan beeldvorming om adequate luciferine werd toegevoegd aan de hersenen uitgesneden. Afbeelding met de instellingen als hierboven. Dit zal plaats van de infectie tonen aan de hersenhelften. Opmerking: Downstream kwantificering van parasitemie op het uitgesneden hersenen kan door qPCR worden uitgevoerd zoals eerder beschreven 8. Andere alternatieve downstream-toepassingen kunnen zijn histologie of immunohistochemie om parasieten te identificeren in het hersenweefsel na fixatie. </li></ol> 5. kwantificering van bioluminescentie Imaging Opmerking: Bioluminescentie kan worden gekwantificeerd middels het gebied van belang (ROI) van de beeldverwerkingssoftware en gecorrigeerd voor achtergrond bioluminescentie. <ol><li> Met behulp van de ROI tool, maakt u een rechthoekige ROI voor het hele dier een kwantificeringnd te positioneren afbeelding met de muis over te puntje van de neus te dekken naar de basis van de staart van de muis. Gebruik dezelfde grootte doos voor elk dier en elk tijdstip. Als we de ROI van de hersenen, gebruiken een cirkelvormige ROI op dezelfde manier, de positionering via muis kopgebied in het beeld. </li><li> Desgewenst afbeeldingen zo op hetzelfde spectrum weergegeven voor een visuele weergave van infectie. Opmerking: De software gebruikt hier genereert een kleur kaart voor elk beeld automatisch aangepast voor de minimale en maximale foton telt. Om visuele vergelijking tussen een reeks beelden mogelijk te maken, moet de kleur schaal worden ingesteld op dezelfde waarden voor alle beelden. <ol><li> Het gebruik van de afbeelding met de tab &#39;Afbeelding aanpassen&#39; op het palet gereedschap de hoogste bioluminescentie en selecteer een logaritmische schaal en een passende kleur schaal minimum en maximum (empirisch te bepalen). Pas deze schaal om alle afbeeldingen gedurende het experiment. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).</li>
<li>Rodgers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosomiasis+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosomiasis and the brain.</a> Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).</li>
<li>Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+pharmacological+re-engagement+with+a+neglected+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease.</a> Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).</li>
<li>Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in human African trypanosomiasis.</a> Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).</li>
<li>Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+duration+of+infection+with+Trypanosoma+brucei+in+mice+and+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy.</a> Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).</li>
<li>Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+studies+of+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).</li>
<li>Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+reproducible+in+vivo+imaging+mouse+model+for+evaluation+of+drugs+against+late-stage+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis.</a> J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%27red-shifted%27+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).</li>
<li>Jennings, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+potential+therapeutic+benefits+of+an+alternative+suramin+and+melarsoprol+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen.</a> Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+chemotherapy+with+a+substance+P+receptor+antagonist+%28aprepitant%29+and+melarsoprol+in+a+mouse+model+of+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis.</a> Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Kamerkar, S., Davis, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+on+the+brain%3A+understanding+host-pathogen+interactions+in+chronic+CNS+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection.</a> J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).</li>
<li>Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+Toxoplasma+gondii+to+immunoprivileged+organs+and+role+of+Toll%2Finterleukin-1+receptor+signalling+for+host+resistance+assessed+by+in+vivo+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging.</a> Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontwikkeling van een bioluminescente T. b. brucei GVR35 stam maakt de visualisatie van een trypanosoom besmetting van de vroege tot de late stadium. Vorige infectie modellen waren niet in staat om het late stadium op te sporen, als parasieten in de hersenen, in real-time uit het bloed film microscopie, en vereist het ruimen en het verwijderen van de hersenen van de geïnfecteerde muizen parasiet last 12 te bepalen. De bioluminescentie vermindert inter-muis variabiliteit één muis gedurende het gehee...

Humane Afrikaanse trypanosomiasis (HAT), of slaapziekte, wordt veroorzaakt door de vector-overdraagbare protozoaire parasieten van de Trypanosoma brucei soorten1. Geschat wordt dat er minder dan 7 duizend gevallen per jaar zijn met bijna 70 miljoen mensen die binnen het Afrikaanse continent blootgesteld zijn aan het risico van de parasietinfectie. De ziekte, die meestal dodelijk is als ze niet wordt behandeld, omvat een vroege hemolymfatische fase waarbij parasieten in het bloed aanwezig zijn, en vordert naar de late fase wanneer parasieten het centrale zenuwstelsel (CZS) binnendringen en niet langer gevoelig zijn voor behandeling met trypanosoma-geneesmiddelen uit het vroege stadium2. De huidige medicamenteuze behandelingen voor HAT in het late stadium hebben zowel complexe, langdurige behandelingsschema's als ernstige bijwerkingen, evenals gerapporteerde resistentie, daarom is onderzoek naar nieuwe medicamenteuze behandelingen noodzakelijk3,4. 
Het onderzoek naar humane Afrikaanse trypanosomiasis (HAT) in het late stadium binnen traditionele muismodellen is lang en complex, waarbij de verwijdering van hersenweefsel vereist is om de parasitaire belasting te controleren5. De voor dieren besmettelijke stam T. b. brucei wordt gebruikt als het onderzoeksmodel voor trypanosomiasis, waarbij het late stadium 21 dagen na infectie (dpi) optreedt. Om de infectie van het wildtype niet-bioluminescente parasiet in het muismodel te monitoren, zijn perifere bloedfilms of kwantitatieve PCR de enige methoden om de parasitaire belasting te bepalen. Voor de parasitaire belasting in de hersenen moet de muis worden gedood, wordt de hersenen verwijderd en wordt qPCR uitgevoerd op weefsels, waardoor het onmogelijk wordt om parasieten door meerdere tijdstippen in de late fase infectie te volgen. Dit resulteert in het onvermogen om real-time infecties in het centrale zenuwstelsel (CZS) te volgen. 
In vivo bioluminescentie-beeldvorming (BLI) kan zeer gevoelige, niet-invasieve detectie van parasitaire verspreiding en ziekteprogressie in een muismodel bieden, die in een enkel dier gedurende de hele duur van het experiment kan worden gevolgd6. BLI is gebaseerd op de emissie van licht in het zichtbare spectrum dat wordt geproduceerd door een door luciferase gekatalyseerde reactie. De uitgezonden fotonen worden vervolgens gedetecteerd door een beeldsensorcamera7. Voor dit doel wordt het pathogeen genetisch gemodificeerd om een luciferine-eiwit tot expressie te brengen en wordt het substraat, luciferine, op interessante tijdstippen via injectie geïntroduceerd. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om longitudinale studies uit te voeren, waarbij het zelfde dier meerdere keren kan worden geïmagerd met minimale bijwerkingen. Het verkregen bioluminescentie-signaal kan worden gekwantificeerd, waardoor het de pathogene belasting aangeeft.
De optimalisatie en validatie van een roodverschoven bioluminescente T. b. brucei heeft de onderzoeking van de late fase infectie mogelijk gemaakt door niet-invasieve procedures, waarbij parasieten eerder worden gedetecteerd dan door bloedfilmmicroscopie en waardoor de tijd, kosten en het aantal dieren die nodig zijn om CZS infectie en medicijnscreening in het late stadium van trypanosomiasis te bestuderen aanzienlijk worden verminderd8,9. In dit protocol demonstreren we de infectie van muizen met bioluminescente trypanosomen en hoe deze vervolgens in vivo kunnen worden gevisualiseerd voor kwantificering van ziekteprogressie en CZS-penetratie.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, UK</td><td>P4417</td><td>tablets pH 7.4</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma, UK</td><td>G8270</td><td>99.5% (moleculair) grade</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma, UK</td><td>A9434</td><td>99.5% (moleculair) grade</td></tr><tr><td>Heparine (lithiumzout)</td><td>Sigma, UK</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, UK</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, UK</td><td>D4031</td><td>Sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, UK</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferine</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma, UK</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diminazene aceturate</td><td>Sigma, UK</td><td>D7770</td><td>Analytische kwaliteit</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td>andere bio-imagers beschikbaar bv. van Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td>gepatenteerde software voor Perkin Elmer IVIS instrumenten; andere instrumenten kunnen de hunne hebben</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>25 G Needles</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G Needles</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Twin-frosted microscoopglaasje</td><td>VWR, UK</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Microcentrifugebuis</td><td>StarLab, UK</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Bijoubuis</td><td>StarLab, UK</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Muisbegrenzer</td><td>Sigma, UK</td><td>Z756903</td><td>onze begrenzer werd in huis gemaakt, dit is een soortgelijk model</td></tr></tbody></table>

bioluminescentie imaging te laat stadium infectie van afrikaanse trypanosomiasis detect

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Humane Afrikaanse trypanosomiasis (HAT) is een ziekte in meerdere stadia die zich manifesteert in twee stadia; een vroeg bloedstadium en een laat stadium wanneer de parasiet het centrale zenuwstelsel (CZS) binnendringt. In vivo onderzoek van het late stadium is beperkt geweest omdat traditionele methodologieën de verwijdering van de hersenen vereisen om de aanwezigheid van de parasieten te bepalen.
Bioluminescentie beeldvorming is een niet-invasieve, zeer gevoelige vorm van optische beeldvorming die het mogelijk maakt om een luciferase-getransfecteerde ziekteverwekker in real-time te visualiseren. Door gebruik te maken van een getransfecteerde trypanosoomstam die in staat is om een laat stadium van de ziekte bij muizen te produceren, kunnen we de kinetiek van een CZS-infectie in één enkel dier gedurende het beloop van de infectie bestuderen, evenals de beweging en verspreiding van een systemische infectie observeren.
Hier beschrijven we een robuust protocol om CZS-infecties te bestuderen met behulp van een bioluminescentiemodel van Afrikaanse trypanosomiasis, waarbij real-time niet-invasieve observaties worden geleverd die verder kunnen worden geanalyseerd met optionele downstream benaderingen.

Dit protocol laat zien hoe progressie van de ziekte na infectie van muizen met T. volgen b. brucei, een model voor humane Afrikaanse trypanosomiasis. Figuur 1 toont de tijdlijn van het experimentele protocol, waaruit het tijdschema voor de behandeling en beeldvorming stappen. Figuur 2 toont een typisch gezichtsveld in vaste Giemsa gekleurd bloed uitstrijkjes gebruikt om perifere parasitemie kwantificeren met trypanosomen en rode bloedce...

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Het algemene doel van dit protocol is om in vivo live imaging te gebruiken om een trypanosome-infectie in realtime te volgen, waarbij de vroege bloedstadia tot de late herseninfectiestadia in de muis worden gevisualiseerd, wat de klinische progressie van de slaapziekte nabootst. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de trypanosome-biologie, het identificeren van potentiële nieuwe therapeutische behandelingen en het evalueren van de werkzaamheid tegen de infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de evaluatie van geneesmiddelen in 90 dagen kan worden voltooid, in tegenstelling tot de 180 dagen die vereist waren voor het vorige modeltype.Dit protocol kan inzicht bieden in de menselijke Afrikaanse trypanosomiasis, maar is ook toepasbaar op andere modellen van infectieziekten, zoals tuberculose of de ziekte van Chagas. Begin met het plaatsen van vrouwelijke CD1-muizen van 21 tot 25 gram in een warmtebox om de staartvenen te dilateren. Plaats vervolgens de opgewarmde muizen individueel in een plastic fixatieapparaat en gebruik een naald van 25 gauge om 0,2 milliliters van een verdund inoculum van trypanosome brucei GVR35VSL2 i

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt om kwantitatieve metingen te genereren van muisinfecties met de Trypanosomatide protozoa Leishmania. Dit is een niet-invasieve en niet-lethale methode voor het detecteren van parasieten die luciferase tot expressie brengen in diverse weefsels gedurende het verloop van een chronische Leishmania spp. infectie.

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte...

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

De dynamica van glycosomen in Afrikaanse trypanosomen is moeilijk te bestuderen met traditionele celbiologietechnieken zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie. Als middel om dynamisch orgaangedrag waar te nemen, is een fluorescentie-orgaanrapportagesysteem gebruikt in combinatie met flowcytometrie om de glycosoomdynamica in real-time in levende parasieten te monitoren.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.

Dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumor progressie en angiogenese

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

Hier presenteren we een longitudinale evaluatie van goudhamsters die intraperitoneaal (IP) of via intragingivaal (IG) zijn geïnfecteerd met L. infantum-Luc door middel van bioluminescente beeldvorming en door PCR. Hamsters werden 1 dag na infectie (1 dpi), 1 week na infectie (8 dpi) en 3 weken na infectie (22 dpi) geëvalueerd en geëuthanaseerd op de 50edpi en 8 maanden na infectie.

In vivo Beeldvorming van met Leishmania infantum geïnfecteerde hamsters door gingiva-inoculatie van axenische amastigoten die luciferase tot expressie brengen

Anti-retrovirale therapie van HIV / aids te behandelen wordt bewaakt in Zuid-Afrika op grote schaal. Flowcytometrie is gecombineerd voor hematologie (CD45), immunologie (CD4) en virale-load verbonden CD38 test. Opgenomen in NHLs-SA laboratoria, Johannesburg, deze moderne methoden zijn kostenefficiënt met een verhoogde lokale interne kwaliteitszorg, die als rolmodellen voor de resource-beperkte diagnostiek.

Uitgebreide &amp; Rendabele laboratorium controle van HIV / AIDS: een Afrikaanse Role Model

NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

Leer bioluminescentie imaging voor het volgen van Trypanosoma brucei-infectie van bloed naar hersenen bij muizen. Deze methode versnelt geneesmiddelonderzoek naar slaapziekte aanzienlijk.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Meer video's verkennen