Name: De Ex Vivo Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer de ex vivo cultuur en stimulatie van muizenintestinale organoïden met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. Deze methode onderzoekt gastheer-pathogeen interacties en genexpressieanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel en Bettina Heid bedanken voor technische discussies. De auteurs danken Dr. Nanda Nanthakumar voor het verstrekken van de Caco-2 cellen. De auteurs danken ook het Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) aan Virginia Tech. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (aan I.C.A.). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Freshney, R. I., Freshney, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells.+2nd+edn%22">Culture of epithelial cells. 2nd edn</a>. , Wiley-Liss. (2002).</li>
<li>Vachon, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-selective+roles+of+p38+isoforms+in+human+intestinal+epithelial+cell+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis.</a> Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+shaping+the+gastrointestinal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment.</a> Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+influence+of+human+R-spondin1+on+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium.</a> Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRX1+protein+attenuates+inflammatory+responses+to+infection+by+interfering+with+the+RIG-I-MAVS+and+TRAF6-NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways.</a> Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).</li>
<li>Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiol Rep. 2 (9), (2014).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5, 1228(2014).</li>
<li>Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Succinate-Tetrazolium+Reductase+Systems.+Iii.+Points+of+Coupling+of+Four+Different+Tetrazolium+Salts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts.</a> Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).</li>
<li>Parry, M. F., Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetylcysteine+on+antibiotic+activity+and+bacterial+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro.</a> J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De cultuur en onderhoud van intestinale organoids is een procedure die kan worden beheerst door een persoon met voldoende weefselkweek. Er zijn nuances in passages in vergelijking met groeiende cellen in een meer conventionele monolaag, maar deze subtiele niet moeilijk te overwinnen. De kritische stappen van deze werkwijze omvatten de mogelijkheid om de organoids groeien tot een voldoende hoge dichtheid voor optimale zaaien. Experimenten Er moet worden opgeschaald organoids zo groot seeding dichtheden die vaak kan worde...

Het vermogen om te oogsten en cultuur primaire organoids zijn beschreven voor dunne darm, colon, pancreas, lever en hersenen en zijn spannende ontwikkelingen relevant voor het begrip van een fysiologisch representatieve verschijnselen weefselbiologie 1-5. De eerste methode beschrijft de cultuur en het onderhoud van de dunne darm organoids werd gemeld door Sato et al. Uit het lab van Hans Clevers 1. Voorafgaand aan deze methode, oogsten en kweek van primaire darmepitheelcellen bleek beperkt en ineffectief ondersteunen epitheliale celgroei. Werkwijzen onder dissociatie van weefsel via incubatie met enzymen, zoals collagenase en dispase, die uiteindelijk leiden tot de uitgroei van vermengd primaire fibroblastcellen 6. Deze omstandigheden zouden ook tijd worden beperkt bij het instandhouden van de epitheliale celkweek. Minimaal tot geen epitheelcellen niche zouden vormen als de epitheliale cellen apoptose zou treden wegenshet gebrek aan geschikte groeifactoren of verlies van contact integriteit, genaamd anokis 7. De komst van de 3D-organoïde kweeksysteem is een werkwijze cultuur primaire darmcellen die een spectrum van intestinale celtypen in langdurige kweek 1 ontvangen. Deze epitheliale organoids voordelen hebben ten opzichte cellijnen is dat ze bestaan ​​uit diverse gedifferentieerde cellen, en beter nabootsen het orgaan zij zijn afgeleid van in vivo 8. Het proces uiteindelijk &quot;groeien een mini darm in een schotel&quot; heeft bewezen een waardevol instrument voor het beoordelen van de respons van darmepitheel onder verschillende stimuli. Onderzoek naar de interactie van primaire darmcellen microbiële pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) is op het gebied van immunologie relevant deze moleculaire patronen diverse reacties van zowel gastheer als microbe 9 kan reguleren. Niet alleen kunnen de onderzoekers nu te verkennen deze interacties met de muis organoids, maar zekan gekweekt van mensen en 2 zijn. Deze technologie heeft de potentie om drastisch te veranderen gepersonaliseerde geneeskunde en het is verleidelijk om te speculeren over de vooruitgang die deze techniek in de nabije toekomst mogelijk te maken. Het algemene doel van deze methode is een protocol voor de kweek, groei, en behandeling van intestinale organoids een variëteit van stimuli. Dergelijke stimuli kan uiteindelijk variëren van vaccins, bacteriële PAMPs, live pathogenen, gastro-intestinale (GI) en kanker geneeswijze. De isolatie en de cultuur van de muis intestinale organoids is aangepast van Sato et al. Hoewel er lichte afwijkingen van de oorspronkelijke methode, het eindproduct wordt organoïde cultuur is nog steeds bereikt bij het ​​volgen van dit protocol. Deze methode is gericht op het beschrijven van een geschikte techniek voor een goede normalisatie bij het werken met niet-homogene celstructuur, waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van een assay op basis van cellen nomber.

<table><tbody><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td><td>(Section 1,3,6) Of equivalente merk</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td><td>(Section 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td><td>(Section 1,6) Voor Caco-2 en HEK293 Rspondin1 cellen</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 secreting cell line</td><td></td><td></td><td>(Section 1) Beschreven en gemodificeerd van Kim, K.A. et al. Lentivirale deeltjes bevatten RSPO1(NM_138683) ORF cDNA gekloond in een pReceiver-Lv105 backbone op maat besteld en gekocht bij GeneCopoeia.&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml conische buis</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>(Section 1) Of equivalente merk</td></tr><tr><td>T-175 Flessen</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(Section 1) Of equivalente merk&nbsp;</td></tr><tr><td>Protein Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Section 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(Section 2,3) Advanced DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 Well TC Plates</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>B27 without vitamin A 50x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Glutamine Supplement (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Section 2) Kan combineren met Advanced DMEM/ F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(Section 2) Kan combineren met Advanced DMEM/ F12&nbsp;</td></tr><tr><td>10ml Serologische Pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Section 2) Of equivalente merk</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Section 2) Stock = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Section 2) Stock = 1M</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Section 2) Stock = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>dissectie schaar</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>pincet</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>glasplaatjes</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>dissectie pincet</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>25 ml Serologische Pipet</td><td>Falcon</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(Section 3) 0.5M of alternatieve TC grade EDTA</td></tr><tr><td>Steriele Petri Schaal 100mm x 15mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>(Section 3) Of gelijke grootte TC schaal</td></tr><tr><td>1ml Spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>(Section 4)</td></tr><tr><td>Precision Glide Naald</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td><td>(Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)</td></tr><tr><td>Flagellin van Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Section 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Section 5,6)&nbsp;(Murray&nbsp;et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td>(Section 5,6)Of equivalente merk</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(section 6)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecuar Devices</td><td></td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>96 Well Assay Plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>(Section 6) Zwarte Plaat, Heldere Bodem TC behandeld</td></tr><tr><td>Nuclear Staining Dye</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>(section 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Flessen</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Section 6) Of equivalente merk</td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Section1,3) Of equivalente merk</td></tr><tr><td>1.7 ml polypropyleen buis</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Of equivalente merk</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Of equivalente merk</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman gene expressie assay kit</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman gene expressie assay kit</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman gene expressie assay kit</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman gene expressie assay kit</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman gene expressie assay kit</td></tr><tr><td>7500 Fast Real Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Fast Optical 96-Well Reactieplaat, 0.1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1 Proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

de<em&gt; ex vivo</em&gt; cultuur en pattern recognition receptor stimulatie van de muis intestinal organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primaire intestinale organoids zijn een waardevol modelsysteem dat het potentieel heeft om een ​​aanzienlijke invloed op het gebied van mucosale immunologie heeft. Echter, de complexiteit van de organoïde groei kenmerken dragen belangrijke kanttekeningen voor de onderzoeker. Met name de groeipatronen van elke afzonderlijke organoïde zijn zeer variabel en een heterogene populatie van epitheliale cellen in kweek. Met dergelijke restricties gemeenschappelijke weefselkweek praktijk niet zonder meer toegepast op de organoïde systeem vanwege de complexiteit van de celstructuur. Tellen en plating uitsluitend op basis van aantal cellen, hetgeen normaal is voor individueel gescheiden cellen, zoals cellijnen, geen betrouwbare methode om organoids tenzij een normalisering techniek toegepast. Normaliseren van het totale eiwitgehalte is complexer geworden als gevolg van de bewoner eiwit matrix. Deze kenmerken in termen van het aantal cellen, vorm en celtype moet rekening worden gehouden bij de evaluatie van uitgescheiden contenten uit de organoïde massa. Dit protocol is gegenereerd om een ​​eenvoudige procedure te schetsen om de cultuur en de behandeling van de dunne darm organoids met microbiële pathogenen en pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs). Het benadrukt ook de normalisatie technieken die moeten worden toegepast bij eiwitanalyse worden uitgevoerd na een dergelijke uitdaging.

Wanneer na dit protocol om intestinale organoids te cultiveren, zal karakteristieke bolvormige organoids aanwezig na het oogsten zijn. De toevoeging van R-spondin1 geconditioneerde media dag wordt de groei en ontluiken van de organoids initiëren. De groei van organoids wordt getoond in Figuur 1A - F en representeert intestinale organoids op dagen 1, 2, 4, 5, 6 en dag 14. Figuur 1F geeft de niet-homogene groeikenmerken va...

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de effecten van een pathogene challenge op organoïden van de dunne darm, met een nadruk op normalisatietechnieken ten opzichte van het totale aantal cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van de aangeboren en mucosale immunologie door een middel te bieden om gastheer-pathogeeninteracties van bacteriën met intestinale epitheelcellen in vitro te onderzoeken. Essentieel voor deze procedure is de methode voor normalisatie ten opzichte van het totale aantal cellen, een noodzaak bij het meten van door organoïden gesecreteerde eiwitten via technieken zoals ELISA. Om crypten uit de dunne darm van muizen te oogsten voor organoïdekweek, begint u met het voorzichtig wegschrapen van de villi van het luminale oppervlak van de dunne darm met een steriele glazen plaat. Gebruik vervolgens een dissectieschaar om het weefsel in stroken van 1-2 centimeter lengte te knippen. Plaats de stroken in een conische buis van 50 milliliter met 10 milliliter ijskoud PBS. Meng de inhoud door voorzichtig om te keren en laat de weefselinhoud naar de bodem van de buis zakken. Aspireer vervolgens het PBS en was de stroken nog drie keer in 10 milliliter vers PBS, telkens op dezelfde wijze. Na de laatste wasbeurt plaatst u de buis tien minuten op ijs. Vervang vervolgens het PBS door 25 milliliter PBS aangevuld met 2 millimolar EDTA, in een ijsbak op een schudplatform gedurende 45 minuten. Aan het einde van de incubatie laat u de weefselstroken naar de bodem van de buis zakken en vervangt u het PBS-EDTA door 10 milliliter PBS aangevuld met 10% FBS. Schud de buis tien keer krachtig met de hand. Laat het weefsel vervolgens naar de bodem van de buis zakken en breng het supernatant over naar een conische buis van 15 milliliter met het label Fractie 1. Agiteer de weefsels in PBS FBS nog vijf keer. Breng telkens het supernatant over naar een nieuwe fractiebuis. Centrifugeer na de laatste agitatie alle monsters en resuspendeer de pellets in vijf milliliter voorverwarmd DMEM/F12 zonder toegevoegde groeifactoren. Centrifugeer de monsters nu opnieuw en aspireer vier milliliter van het supernatant uit elke buis. Resuspendeer de pellets in de laatste milliliter resterend medium en gebruik aliquoten van 20 microliter van elke fractie om de crypten en het debris op glazen plaatjes te visualiseren. Nadat de juiste fracties zijn samengevoegd om de hoogste ratio van crypten ten opzichte van debris te bereiken, centrifugeert u de samengevoegde fracties en aspireert u al het supernatant, behalve de laatste 50-100 microliter. Voeg, terwijl de buizen op ijs blijven, 1 milliliter eiwitmatrix toe aan de samengevoegde fracties, waarbij u langzaam op en neer pipetteert om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Voeg vervolgens 50 microliters van de eiwitmatrix/crypt-suspensie toe in het midden van elke well van 37

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Dunne darm crypte organoids gekweekt ex vivo een weefselkweek systeem dat de groei van de crypten afhankelijk van stamcellen en hun niche recapituleert. We hebben een methode om het metabole profiel in real time in primaire muis crypte organoids assay. We vonden organoids behouden fysiologische eigenschappen gedefinieerd door hun bron.

Real Time Analyse van Metabool profiel in Ex Vivo Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

De ex vivo orgaankweek maakt onderzoek naar biologische processen mogelijk in de context van de intacte weefselarchitectuur. Hier introduceren we een methode van ex vivo kweek van de muizencolon, die kan worden gebruikt om aangeboren immuniteit en antimicrobiële gastheerverdediging in de darm te bestuderen.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Cultuur en het gebruik ervan in Antimicrobial Host Defensie Studies

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Leer de ex vivo cultuur en stimulatie van muizenintestinale organoïden met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. Deze methode onderzoekt gastheer-pathogeen interacties en genexpressieanalyse.

De

Meer video's verkennen