Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Het algemene doel van deze methode is om exosomen te isoleren uit menselijk gal voor verdere analyses, waaronder microRNA-profilering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van leverziekten, zoals de detectie van een specifieke galmarker voor cholangiocarcinomen of andere galwegziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust en reproduceerbaar is.

Om een endoscopische retrograde cholangiopancreatografie, of ERCP, uit te voeren, begint u door de patiënt in rugligging te plaatsen. Nadat u de patiënt heeft geïntubeerd en een duodenoscoop via de mond van de patiënt heeft ingebracht, voert u deze door naar het tweede deel van het duodenum en identificeert u de papilla major. Cannuleer selectief de galweg door een triple lumen sfincterotoom in te brengen, vooraf geladen met een 0,35-inch of een 0,9-millimeter hydrofiele geleidingsdraad.

Bevorder onder fluoroscopische begeleiding de geleidingsdraad naar de linkerlevertraject en breng vervolgens de sfinctrotome vijf centimeter in de galgang om een stabiele positie te verkrijgen. Verwijder de geleidingsdraad, bevestig een spuit van 10 milliliter aan de poort voor de geleidingsdraad via de onderste vergrendeling en gebruik 10 milliliter negatieve druk om de gal te aspireren. Verwijder de spuit met de gal en injecteer, na het opnieuw inbrengen van de geleidingsdraad, contrastmiddel via de injectiepoort om de galwegen op te weken.

Breng vervolgens het verzamelde gal over in een buis van 15 milliliter op ijs en, indien bewaard voor later gebruik, centrifugeer het monster bij 500 ×g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten voordat het wordt ingevroren bij minus 80 graden Celsius. Om direct over te gaan tot exosoomisolatie, breng dan 400 µL gal over in een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 300 ×g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om cellen en celresten te pelletteren. Om het supernatant verder te klaren, breng de oplossing over naar nieuwe microcentrifugebuizen en centrifugeer de monsters bij 16.500 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Verzamel vervolgens in een veiligheidskast de supernatant in een spuit en filtreer deze door een 0,2-micrometer polyethersulfon-membraanfilter om alle resterende deeltjes groter dan 200 nanometer te verwijderen. Overbreng de gefiltreerde supernatant naar ultracentrifugebuisjes en voeg PBS toe tot de buisjes voor ten minste tweederde vol zijn, om te voorkomen dat de buisjes inklappen tijdens het centrifugeren. Pelleteer de exosomen door middel van ultracentrifugatie bij 120.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 70 minuten.

Een klein, geel pellet bevat de exosomen. Verwijder het supernatant door voorzichtig af te gieten en desinfecteer het afval door bleekmiddel toe te voegen tot een eindconcentratie van 10% volume per volume. Laat dit vervolgens 20 minuten staan.

Voor downstream-experimenten kunnen de pellets worden verwerkt in een klein volume van een geschikte oplossing of opnieuw worden gesuspendeerd in 50 tot 100 µL PBS en bewaard worden bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Na het bereiden van grids van contrastgekleurde extracellulaire vesicles, of EV's, volgens het tekstprotocol, worden afbeeldingen vastgelegd met een elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 80 kV, beginnend bij vergrotingen van 20.000 X en oplopend tot 100.000 X voor het bepalen van de grootte van de deeltjes. Exosomen zijn te klein om te worden gedetecteerd met reguliere microscopie of flowcytometrie; deze figuur toont echter de resultaten van een typische nanoparticle tracking analysis, of NTA, van exosomen, waarbij de concentratie en de grootteverdeling zijn gemeten, welke in dit geïsoleerde menselijke galmonster gemiddeld 97 nm bedroegen.

Elektronenmicroscopie kan ook worden gebruikt om de grootte van de geïsoleerde deeltjes in menselijk gal te bevestigen en deze figuur toont een typisch resultaat van transmissie-EM. Deze western blots werden onderzocht op eiwitten die verrijkt zijn in exosomen, zoals de tetraspanine CD63 en Tsg101. Deze real-time amplificatieplot toont een verscheidenheid aan microRNA-soorten geëxtraheerd uit exosomen van menselijk gal.

Omdat exosomen geen betrouwbare standaarden hebben zoals 18S of 28S ribosomaal RNA of housekeeping-genen, is het toevoegen van een synthetisch microRNA belangrijk voor de normalisatie. De isolatietechniek voor exosomen kan in drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe gal van patiënten of dieren wordt verkregen en verwerkt om extracellulaire vesicles te isoleren en te analyseren.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het monster op 500 G en vier graden gecentrifugeerd moet worden voordat het bij min 80 wordt ingevroren, indien ultracentrifugatie niet mogelijk is. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals microRNA-studies, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals microRNA-profielen. Vergeet niet dat werken met gal extreem gevaarlijk kan zijn aangezien het hepatitis kan bevatten, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril moeten altijd worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Na de ontwikkeling maakte de techniek de weg vrij voor onderzoek in het veld van cholangiocarcinoomonderzoek om extracellulaire blaasjes te verkennen als potentiële biomarker in gal van patiënten met galwegproblemen, zoals een obstructie van de PSA.