Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Het algemene doel van deze methode is het isoleren van exosomen uit menselijke gal voor verdere analyses, inclusief microRNA-profilering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van leverziekten, zoals de detectie van een specifieke galmarker voor cholangiocarcinomen of andere galwegaandoeningen. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze robuust en herhaalbaar is.

Om endoscopische retrograde cholangiopancreatografie, of ERCP, uit te voeren, begint u door de patiënt in een rugligging te plaatsen. Nadat u de patiënt hebt geïntubeerd en een duodenoscoop door de mond van de patiënt hebt doorgevoerd, steekt u deze in het tweede deel van de twaalfvingerige darm en identificeert u de papilla major. Canuleer selectief de ductus choledochus door een triple lumen sphincterotoom in te brengen die is voorgeladen met een 0,35-inch of 0,9 millimeter hydrofiele draadgeleider.

Onder fluoroscopische begeleiding brengt u de draadgeleider naar de linker leverductus en brengt u de sphincterotoom vervolgens vijf centimeter in de galgang om een stabiele positie te verkrijgen. Nadat u de draadgeleider hebt verwijderd, bevestigt u een 10-millimeter spuit aan de draadgeleiderpoort via de onderste vergrendeling en gebruikt u 10 milliliter negatieve druk om de gal af te zuigen. Verwijder de spuit met de gal erin en na het opnieuw inbrengen van de draadgeleider, injecteert u contrastmiddel via de injectiepoort om de galwegen te opacificeren.

Breng vervolgens de verzamelde gal over in een buisje van 15 milliliter op ijs en als u deze later wilt opslaan, centrifugeert u het monster gedurende 10 minuten bij 500 keer g en vier graden Celsius voordat u het invriest bij min 80 graden Celsius. Om onmiddellijk door te gaan met het isoleren van exosomen, brengt u 400 microliter gal over in een microcentrifugebuisje en centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 300 keer g en vier graden Celsius om cellen en cellulaire resten te verzamelen. Om het supernatant verder op te ruimen, brengt u de oplossing over in verse microcentrifugebuisjes en centrifugeert u de monsters gedurende 20 minuten bij 16.500 keer g en vier graden Celsius.

Verzamel vervolgens in een bioveiligheidskast het supernatant in een spuit en filter het door een polyethersulfone-membraanfilter van 0,2 micrometer om eventuele resterende deeltjes groter dan 200 nanometer te verwijderen. Breng het gefilterde supernatant over in ultracentrifugebuisjes en gebruik PBS om de buisjes op te vullen tot ten minste tweederde om te voorkomen dat de buisjes tijdens centrifugatie inklappen. Pelet de exosomen door ultracentrifugering gedurende 70 minuten bij 120.000 keer g en vier graden Celsius.

Een klein, geel pellet zal de exosomen bevatten. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig af te gieten en desinfecteer het afval door bleekmiddel toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 10% volume per volume. Laat het vervolgens 20 minuten staan.

Voor downstream-experimenten verwerkt u de pellets in een klein volume van een geschikte oplossing of suspendeert u ze opnieuw in 50 tot 100 microliter PBS en bewaart u ze bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Nadat u rasters van contrastgeverfde extracellulaire vezels, of EV's, hebt bereid volgens het tekstprotocol, maakt u met een elektronenmicroscoop beelden met een versnellingsspanning van 80 kilovolt, beginnend bij vergroting van 20.000 X en toenemend tot 100.000 X, bij het bepalen van de grootte van de deeltjes. Exosomen zijn te klein om te worden gedetecteerd door regulaire microscopie of flowcytometrie; deze figuur toont echter de resultaten van een typische nanoparticle tracking analyse, of NTA, van exosomen die de concentratie en grootteverdeling meten, die in dit geïsoleerde menselijke galmonster gemiddeld 97 nanometer waren.

Elektronenmicroscopie kan ook worden gebruikt om de grootte van de geïsoleerde deeltjes in menselijke gal te bevestigen en deze figuur toont een typisch transmissie-EM-resultaat. Deze western blots werden getest op eiwitten verrijkt in exosomen zoals de tetraspanine CD63 en Tsg101. Dit real-time amplificatieplot toont een verscheidenheid aan microRNA-soorten geëxtraheerd uit exosomen van menselijke gal.

Aangezien exosomen geen betrouwbare standaarden hebben zoals 18S of 28S ribosomaal RNA of huishoudelijke genen, is het spiken van een synthetisch microRNA belangrijk voor normalisatie. de exos-isolatietechniek kan in drie uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gal van patiënten of dieren kunt verkrijgen en verwerken om extracellulaire vezels te isoleren en te analyseren.

Bij het terugdraaien van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u het monster bij 500 G en vier graden moet centrifugeren voordat u het invriest bij min 80, als u niet kunt doorgaan met ultracentrifugering. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals microRNA-studies worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals microRNA-profielen. Vergeet niet dat het werken met gal extreem gevaarlijk kan zijn omdat het hepatitis kan bevatten, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en veiligheidsbrillen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Na de ontwikkeling ervan heeft de techniek de weg gebaand voor onderzoek op het gebied van cholangiocarcinoma-onderzoek om extracellulaire vezels te onderzoeken als potentiële biomarker in gal van patiënten met galwegproblemen, zoals obstructie van PSA.