Name: Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer hoe je organ-geconditioneerde media genereert uit lymfeklieren, botten, longen en hersenen van muizen om borstkankermetastase te bestuderen. Deze ex vivo methode helpt onderzoekers organ-specifieke oplosbare factoren identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, de Canada Foundation for Innovation (nr. 13199) en donaties van John en Donna Bristol via de London Health Sciences Foundation (aan A.L.A.). Beurzen en fellowships werden verstrekt door het Ontario Graduate Scholarship-programma (Provincie van Ontario, aan G.M.P. en J.E.C.), het Canada Graduate Scholarship-Master's programma (aan M.M.P), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (aan M.M.P., G.M.P. en J.E.C.) en de Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit bij het London Regional Cancer Program (aan M.M.P., G.M.P., J.E.C. en Y.X.). A.L.A. wordt ondersteund door een CIHR New Investigator Award en een Early Researcher Award van het Ontario Ministry of Research and Innovation.

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care, in het kader van protocollen door de Western University Animal Gebruik Subcommissie goedgekeurd. 1. Organ Isolation (Lung, hersenen, botten, lymfkliertest) <ol><li> Neem vier steriele 50 ml conische buizen (een voor elk orgaan te isoleren) die ongeveer 30 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pre-wegen elk buisje PBS met behulp van een elektronische weegschaal. </li><li> Euthanaseren 6-12 week oude muis door CO 2 inhalatie. Muizen moet worden overgelaten in de CO 2 kamer voor ongeveer 1-2 min of tot de muis niet meer beweegt en ademhaling. Succesvol euthanasie kan verder worden bevestigd door het ontbreken van hartslag bij het handmatig gecontroleerd met een vinger. Voorkomen cervicale dislocatie omdat deze methode bloedvaten van de nek leidt tot problemen verwijderen axillaire lymfeklieren kunnen scheuren. Let op: Eerder werk heeft specifiek gebruiktgezond vrouwelijk naakt muizen, Hsd: Athymische nude- Foxn1 nu 13. </li><li> In een steriele weefselkweek kap, plaatst u de muis op zijn rug op een piepschuim pad, verspreid de ledematen en gebruiken pinnen om ze op hun plaats te houden. </li><li> Met behulp van een steriel pincet en een schaar, knip de abdominale huid op de middenlijn aan de genitaliën en snijd omhoog naar de mond. Trek de rug van de buikhuid van de buikspieren en speld op zijn plaats op het piepschuim pad. </li><li> Zoek de oksel, arm en lies lymfeklieren. Opmerking: lymfeklieren zijn meestal omringd door vetweefsel. De inguinale lymfeknopen zijn het makkelijkst te lokaliseren omdat ze oppervlakkig op de kruising van twee bloedvaten op de teruggetrokken buikhuid gevonden. Oksel en arm lymfeklieren bevinden zich dieper in het weefsel en vereisen zachte manoeuvreren van weefsel. <ol><li> Nadat u de lymfeklieren hebben gelegen, gebruik dan de schaar om zachtjes en voorzichtig snijd de lymfe geendes ze weg van de huid, vet en vaten en uit de muis. Om een ​​goede dissectie te bevestigen, rol de tang op het verwijderde weefsel. Als een harde knobbel bestaat wanneer het rollen van de tang over het weefsel, dan is een lymfeklier is waarschijnlijk met succes verwijderd. </li><li> Bewaar verwijderde lymfeklieren in ijskoude PBS. </li></ol></li><li> Behulp van de tang en schaar, open de buikholte door snijden door de blootgestelde buikwand boven te bewegen naar de borst. Knip voorzichtig door het borstbeen, het blootstellen van de borstholte. </li><li> Zoek het middenrif onder de longen en snijd het middenrif. Het moet trekken aan de ribben door spanning. </li><li> Til de longen van onderaf en snijd het onderliggende weefsel in de richting van de luchtpijp. Hierdoor kan de longen vrij van de borstholte verwijderd. Verwijder het hart en de longen en bloc en plaats in ijskoud PBS. Het hart kan uit de longen hier of vlak voor het wegen in stap 2 worden verwijderd. </li><li> Verwijder depennen, waarbij de muis op zijn plaats op het polystyreenschuim pad. Draai de muis over en snijd de huid van de onderrug helemaal over van flank naar flank. </li><li> Met behulp van een steriel gaasje op de romp van de muis te houden, schil de rug huid van de muis over de benen en voeten van de muis. </li><li> Het gebruik van hetzelfde stuk steriel gaasje, houdt het onderbeen in plaats zorgvuldig te breken het enkelgewricht van de muis voet en schil de huid over het gewricht proximaal in de richting van het kniegewricht. </li><li> Met een schaar, verwijder de tibia vrij van het kniegewricht en plaats in ijskoud PBS. </li><li> Herhaal stap 1.11) tot 1.12) met tegengestelde ledematen. </li><li> Met behulp van een tang, houdt het dijbeen op zijn plaats, weggesneden omliggende spierweefsel met behulp van de schaar en verwijder het dijbeen, waardoor het in ijskoud PBS. </li><li> Herhaal stap 1.14) met tegengestelde ledematen. </li><li> Met behulp van een nieuw stuk van steriel gaas, houdt het hoofd van de muis op zijn plaats. Met behulp van een tang en schaar, verwijder voorzichtig de huid aan de s blootKull. Met een schaar, knip voorzichtig het achterhoofd schedel uit de top midden in een rechte lijn naar beneden en naar de achterste hersenen bloot te leggen. </li><li> Met behulp van een tang, schep onder de hersenen in de richting van de voorste en verwijder de gehele hersenen. Plaats de hersenen in ijskoud PBS. </li><li> Herhaal 1,1) tot 1,17) stappen gedurende ten minste vier muizen. </li></ol> 2. Organ Weighing <ol><li> Na orgel isolatie, wegen elk PBS buis met long- en hersenweefsel met behulp van een elektronische weegschaal. </li><li> Bereken het gewichtsverschil door het aftrekken van de pre-isolatie gewicht (alleen PBS) van het gewicht van de buis PBS + organen (longen en hersenen). </li><li> Bepaal de hoeveelheid media nodig weefselfragmenten resuspenderen van de berekende gewichtsverschil. Opmerking: Lung en hersenweefsel gewichtspercentages genormaliseerd door resuspensie in een 4: 1 media: weefsel verhouding (vol / gew). </li></ol> 3. Productie van long- en hersen- geconditioneerde media <ol><li> Steriel tkwestie cultuur kap, omkeren PBS buizen die de longen of de hersenen drie keer om de resterende bloed uit de organen en zuig PBS met bloed te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt. </li><li> Plaats de longen en hersenen in afzonderlijke 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt longen of hersenen door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot weefsel fragmenten zijn ongeveer ~ 1 mm 3 in grootte. </li><li> Resuspendeer weefsel fragmenten in geschikte volume (eerder bepaald in stap 2,3) of Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM): F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml). </li><li> Voeg geresuspendeerde longen of hersenweefsel fragmenten één putje van een 6-wells plaat. </li><li> Incubeer weefselfragmenten in media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verzamel geconditioneerde media voor elk weefsel en ferdere verdunnen door toevoeging van drie gelijke hoeveelheden vers medium in een 50 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg in verdunde geconditioneerde media voor elk orgaan bij 4 ° C gedurende 15 min om grote weefselafval te verwijderen. Verzamel media supernatant en te filteren door middel van een 0,22 pm spuitfilter. </li><li> Pool geconditioneerde media uit elk orgaan (bijv., Long met long en hersenen met de hersenen) van meerdere muizen vertegenwoordigen muis tot muis variabiliteit. Aliquot en bewaar geconditioneerde medium bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 4. Genereren van Bone Marrow-conditioning Media <ol><li> In een steriele weefselkweek kap, trimmen overtollige weefsel uit het bot en verwijder epifysen (eindstukken) uit de botten met een schaar. </li><li> Met behulp van een 27 G naald ½ spoelen mergholte van beenderen door op 1 ml PBS door het midden van elk been. Dit zal u toelaten om stromale beenmergcellen (BMSC) verzamelen in een nieuwe buis met PBS. </li><li> Centrifugeer bij 1,000 g gedurende 5 min bij 4 ° C en wassen BMSC tweemaal met PBS. Resuspendeer beenmerg stromale cellen in 20 ml bot stromale cel kweekmedium (DMEM: F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen supplement, penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) en 10% foetaal boven serum (FBS) ). </li><li> Plaat 10 ml geresuspendeerd beenmerg stromale cellen in een T75 fles. Opmerking: Combineer en plaat cellen van elk 2 muizen in elke T75 kolf; vier muizen zijn twee T75 kolven nodig (ca. 1 x 10 7 cellen / fles). </li><li> Incubeer beenmerg stromale cellen in bot stromale celgroei media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verwijder media uit zowel T75 kolven en in gebruik genomen nieuwe T75 fles, etiket deze kolf als &quot;Floater Fles&quot;. Voeg frisse bot stromale celgroei media vorige 2 kolven en incubeer alle 3 kolven bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na de cellen te bereiken ongeveer 70% samenvloeiing (ongeveer 5-7dagen) passage cellen. Om dit te doen, verwijder medium en was de cellen tweemaal met PBS (3 ml per wasbeurt). Verwijderen PBS en voeg 3 ml trypsine / EDTA-oplossing, zodat trypsine bedekt het gehele oppervlak van de kolf. Na de cellen til de kolf (~ 2 - 3 min), halte trypsine reactie door toevoeging van 3 ml bot stromale celgroei media). Centrifuge 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, verwijderen media en resuspendeer cellen in 10 ml vers bot stromale celgroei media. </li><li> Pool cellen van alle kolven en passage 1: 5 in drie nieuwe T75 flessen en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Na de cellen nogmaals 70% te bereiken, herhaalt u stap 4.6 en zwembad en de passage van alle aanhangend cellen een tweede keer. Opnieuw plate alle cellen vier T75 flessen en incubeer 37 ° C en 5% CO2. Bot stromale cel groeimedia worden gebruikt voor alle stappen. </li><li> Laat cellen om samenvloeiing bereiken, wassen cellen drie keer met PBS en voeg bot stromale cellen verzameling media (DMEM: F12 media + 1x geconcentreerd mitogeen supplement + penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml); 10 ml / T75), om ervoor te zorgen dat deze media vrij is van FBS. Verzamel beenmerg geconditioneerde medium 72 uur later, gefiltreerd door een 0,22 urn filter, pool, hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde beenmerg-stromacellen (BMSC) met behulp van antilichamen tegen muizen Sca-1, CD105, CD29, en CD73, CD44, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven. </li></ol> 5. Het genereren van lymfkliertest airconditioning Media <ol><li> In een steriele weefselkweek kap, omkeren PBS buis met lymfeklieren drie keer om de resterende bloed uit de lymfeklieren en zuig bloedige PBS te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt. </li><li> Plaats lymfeklieren in 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt lymfeklieren door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot tissuE-fragmenten zijn ongeveer 1 mm3 groot. </li><li> In een conische buis, resuspendeer weefselfragmenten in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) medium aangevuld met penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), 5 x 10 -5 M steriele β-mercaptoethanol ( 1,75 pl / 500 ml media) en 10% FBS. </li><li> Centrifugeer bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer alle cellen in 30 ml media. Voeg 5 ml medium / putje in een 6-wells plaat en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na 7 dagen incubatie media verwijderen, wassen hechtende cellen met 5 ml warm PBS en voeg 5 ml vers medium aan elk putje. Een cel in staat om te groeien tot confluentie (ongeveer 5-7 dagen), trypsinize, zwembad alle cellen en passage zoals beschreven in stap 4.6. Opnieuw plate cellen 6-wells plaat. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Na drie passages, zodat de cellen groeien tot samenvloeiing, wassen putjes driemaal met PBS en voeg 2 ml / putje van DMEM: F12 + 1xgeconcentreerd mitogeen supplement en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), zodat de folie vrij van FBS. Verzamel lymfe-node geconditioneerde media na 72 uur, zwembad, hoeveelheid, en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen (LNSC) met behulp van antilichamen tegen muizen CD45 en gp38, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven. </li></ol> 6. Gebruik van Organ-geconditioneerde media betreffende Downstream Testen om metastatische gedrag van kankercellen Verwante <ol><li> Zodra het orgaan geconditioneerde medium werd gegenereerd zoals beschreven in stappen 1-5, gebruiken verschillende benedenstroomse cel en moleculaire biologie assays uit te voeren om de invloed van oplosbare orgaan afgeleide factoren op de metastatische gedrag van kankercellen te bepalen. Voorbeelden van standaard assays (elders in de literatuur beschreven) omvatten eiwitarrays 13, cellulaire groei assays &lt;sup&gt; 13, celmigratie assays 13, tumorsphere formatie 14 en RT-PCR 15. De originele basismedium gebruikt om het orgel geconditioneerde medium genereren (dwz ongeconditioneerde DMEM. F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) worden gebruikt als een negatieve controle . </li></ol>

<ol><li>Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organ+microenvironment+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organ microenvironment and cancer metastasis.</a> Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+Diseases%3A+A+Treatise+on+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors.</a> Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.+1889%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889.</a> Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+hematogenous+metastatic+patterns+in+humans+as+revealed+by+autopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy.</a> Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Chu, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Factors+Mediate+Breast+Cancer+Cell+Migration+through+CD44+Receptor-Ligand+Interactions+in+a+Novel+Ex+Vivo+System+for+Analysis+of+Organ-Specific+Soluble+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins.</a> Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).</li>
<li>Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).</li>
<li>Deepak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+PCR%3A+Revolutionizing+Detection+and+Expression+Analysis+of+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes.</a> Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+mesenteric+lymph+node+cells+are+essential+for+the+generation+of+gut-homing+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo.</a> J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Baddoo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+murine+bone+marrow+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.</a> J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).</li>
<li>Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurger%2C+KA+%22Curr+Mol+Med%22">Curr Mol Med</a>. 1 (5), 621-632 (2001).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+as+breast+cancer+drivers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+of+breast+cancer%3A+inflammation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Endocr+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion.</a> Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).</li>
<li>Kakinuma, T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2C+chemokine+receptors%2C+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis.</a> J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).</li>
<li>Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemokines and cancer.</a> Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).</li>
<li>Schlesinger, M., Bendas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29--an+increasing+insight+into+its+role+in+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis.</a> Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).</li>
<li>Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+endocrine+resistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.</a> Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).</li>
<li>Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+%28IR%29+and+insulin-like+growth+factor+receptor+1+%28IGF-1R%29+signaling+systems%3A+novel+treatment+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer.</a> Med Oncol. 31 (1), 805(2014).</li>
<li>Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+pathway+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis.</a> Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+TSLP+receptors+mitigates+Th2+polarization+and+the+establishment+and+growth+of+4T1+primary+breast+tumours+but+has+different+effects+on+tumour+quantities+in+the+lung+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain.</a> Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+tumor+metastasis%3A+new+concepts+from+intravital+videomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy.</a> Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).</li>
<li>Gupta, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+site-specific+metastasis+genes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying site-specific metastasis genes and functions.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Psaila, B., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metastatic+niche%3A+adapting+the+foreign+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The metastatic niche: adapting the foreign soil.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).</li>
<li>Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+factors+secreted+by+mesenchymal+stromal+cells+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.</a> J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Metastase is een complex proces waarbij een reeks cellulaire gebeurtenissen uiteindelijk veroorzaken weefselinvasie en verre tumor inrichting 4,30,31. De ex vivo modelsysteem gepresenteerde kunnen worden gebruikt om twee belangrijke aspecten van metastatische progressie studeren: kankercel homing of migratie naar een specifiek orgaan ( &quot;daarheen&quot;) en groei van dat orgaan ( &quot;daar groeien&quot;). Vele studies hebben eerder gericht op het identificeren van mol specifieke eigenschappen van...

Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker bij vrouwen en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen 1. Borstkanker hoge sterftecijfer is vooral te wijten aan het falen van conventionele therapie te verminderen en te elimineren gemetastaseerde ziekte; ongeveer 90% van kanker-gerelateerde sterfgevallen te wijten metastase 2. Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen van de metastatische cascade grootste belang voor de ontwikkeling van therapeutische effectief zowel vroege als late stadium van borstkanker. Verleden onderzoek heeft geholpen verhelderen de meerdere stappen aard van de uitzaaiing van borstkanker en het wordt verondersteld dat het resultaat van zowel de progressie van kanker en metastase is grotendeels afhankelijk van interacties tussen kankercellen en de nieuwe omgeving 3. Klinische observaties tonen aan dat veel kankers tonen orgaan tropisme, dwz., De neiging om bij voorkeur metastaseren specifieke organs.In case borstkanker, ziekte van een patiënt typisch verspreidt of uitzaaiing 5 belangrijkste plaatsen, zoals het been, longen, lymfeknopen, lever en hersenen 4-6. Veel theorieën zijn ontwikkeld om dit proces uit te leggen, maar slechts een paar hebben de tand des tijds doorstaan. Ewing&#39;s theorie van metastase, in de jaren 1920 voorgesteld, de hypothese datde verdeling van metastase was strikt door mechanische factoren; waarbij tumorcellen in het lichaam via de normale fysiologische gedefinieerd bloedstroom patronen worden uitgevoerd en eenvoudig te arresteren in het eerste capillaire bed die ze tegenkomen 7. Daarentegen Stephen Paget 1889 &quot;zaad en aarde&quot; hypothese geopperd dat bijkomende moleculaire interacties verantwoordelijk waren voor overleving en groei van metastasen, waarbij kankercellen ( &quot;seeds&quot;) zich alleen kunnen oprichten en proliferatein orgaan microenvironments passende moleculaire factoren produceren ( &quot;bodem &quot;) 8. Bijna een eeuw later, Leonard Weiss ondernam een ​​meta-analyse van eerder gepubliceerde data autopsie bevestigd Ewing voorspelling dat vele uitgezaaide tumoren waargenomen bij de autopsie werden gevonden in de verwachte verhoudingen die zou worden verwacht wanneer orgaan met metastasen tropisme alleen bepaald door de bloedstroom patronen. In manyinstances waren er minder of meer metastasen gevormd op bepaalde plaatsen dan zou Ewing voorgestelde mechanische factoren 9 verwachten. Deze rekeningen en theorieën suggereren dat specifiek orgaan microenvironments een cruciale rol in de verspreiding patronen en de daaropvolgende groei en overleving van vele vormen van kanker, zoals borstkanker spelen. Eerder onderzoek inspanningen zijn voornamelijk gericht op tumor- cellen afgeleide factoren en hun bijdrage aan het orgaan tropisme waargenomen bij borstkanker metastase 10-12, maar weinig onderzoek is onderzocht factoren afgeleid van het micro orgaan dat kan gunstig niche in de vaststellingborstkanker metastasen. Dit is grotendeels te danken aan de technische uitdagingen van het bestuderen componenten van het orgel in vitro micro-omgeving. De huidige artikel beschrijft een gedetailleerd ex vivo model voor het bestuderen van de invloed van de oplosbare bestanddelen van de lymfeknoop, bot, long en hersenen op het metastatisch gedrag van humane borstkankercellen. Eerdere studies hebben dit modelsysteem bevestigd door aan te tonen dat verschillende borstkankercellijnen tonen cellijn specifieke en orgaanspecifieke maligne gedrag in reactie op geconditioneerde media-orgaan dat overeenkomt met de in vivo metastatisch potentieel 13. Dit model kan worden gebruikt voor het identificeren en specifieke organen afgeleide oplosbare factoren die een rol spelen bij het metastatische gedrag van borstkanker en andere soorten kankercellen, met inbegrip invloeden op de groei, migratie evalueren, stam-achtig gedrag en genexpressie en de identificatie vanpotentiële nieuwe therapeutische doelwitten voor kanker. Dit is de eerste ex vivo model dat kan worden gebruikt om orgaanspecifieke metastatisch gedrag in detail te onderzoeken en de rol van organen afgeleide oplosbare factoren voor het proces van metastase te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>1x Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Nude muizen</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Gebruik bij 6 - 12 weken oud</td></tr><tr><td>Polystyreen schuimpad</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>De weggegooide deksel (~ 4 x 8 inch of groter) van een polystyreen schuimverpakking kan voor dit doel worden gebruikt. Steriliseer door met ethanol af te vegen.</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Gaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>60 mm2 glazen petrischalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Scalpelmesjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik, steriel bewaren&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>Aangeduid als "geconcentreerde mitogeen aanvulling" in het manuscript. Steril bewaren</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik, steriel bewaren&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA oplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik, steriel bewaren&nbsp;</td></tr><tr><td>6-well tissuecultuur platen</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>0,22 μm spuitfilters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>T75 tissuecultuur flasken</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>Steril bewaren, gebruiken voor migratie-assays</td></tr><tr><td>Anti-muis Sca-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB1226P</td><td>gebruiken bij 10 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis CD105</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>gebruiken bij 10 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis CD29</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>gebruiken bij 10 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis CD73</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>gebruiken bij 10 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis CD44</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>gebruiken bij 0,25 µg/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>gebruiken bij 5 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>Anti-muis gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>gebruiken bij 10 µl/106 cellen</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Proteïne arrays</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Gebruik 1 array per mediaconditie (inclusief negatieve controle), in drievoudige</td></tr></tbody></table>

genereren van organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van organ-specifieke invloeden op borstkanker gemetastaseerde behavior

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Borstkanker geeft bij voorkeur uitzaaiingen naar de lymfklier, botten, longen, hersenen en lever bij borstkankerpatiënten. Eerdere onderzoeksinspanningen waren gericht op het identificeren van factoren die inherent zijn aan borstkankercellen die verantwoordelijk zijn voor dit waargenomen uitzaaiingspatroon (genaamd orgaantropisme), maar er is veel minder bekend over factoren die aanwezig zijn in specifieke organen die bijdragen aan dit proces. Dit komt deels door een gebrek aan in vitro modelsystemen die de orgaanmicro-omgeving nauwkeurig nabootsen. Om dit aan te pakken, is een ex vivo modelsysteem opgezet dat de studie van oplosbare factoren die aanwezig zijn in verschillende orgaanmicro-omgevingen mogelijk maakt. Dit model bestaat uit het genereren van geconditioneerde media uit organen (lymfklier, botten, longen en hersenen) geïsoleerd van normale athymische naakte muizen. Het modelsysteem is gevalideerd door aan te tonen dat verschillende borstkankercellijnen cel-lijnspecifiek en orgaanspecifiek kwaadaardig gedrag vertonen in reactie op orgaangeconditioneerd medium dat overeenkomt met hun in vivo uitzaaiingspotentieel. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om specifieke orgaan-afgeleide oplosbare factoren te identificeren en evalueren die een rol kunnen spelen in het uitzaaiingsgedrag van borst- en andere soorten kankercellen, inclusief invloeden op groei, migratie, stamcel-achtig gedrag en genexpressie, evenals de identificatie van potentiële nieuwe therapeutische doelen voor kanker. Dit is het eerste ex vivo modelsysteem dat kan worden gebruikt om orgaanspecifiek uitzaaiingsgedrag in detail te bestuderen en de rol van specifieke orgaan-afgeleide oplosbare factoren te evalueren bij het aansturen van het proces van kankermetastase.

Generatie van Organ geconditioneerde Media Overzichtsdiagrammen / schema van het proces van orgaan isolatie en productie van geconditioneerd medium wordt getoond in Figuur 1, met representatieve fotografische beelden van de in figuur 2 procedure. Opgemerkt wordt dat bij dit protocol werd voor het eerst in ontwikkeling is lever inbegrepen in onze analyse omdat het een gemeensch...

Dit manuscript beschrijft een ex vivo modelsysteem bestaande uit orgaan-geconditioneerde media, afgeleid van de lymfknoop, bot, long en hersenen van muizen. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om op orgaan afgeleidde oplosbare factoren te identificeren en te bestuderen en hun effecten op de orgaantropisme en metastatisch gedrag van kankercellen.

Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van geconditioneerde media met behulp van lymfeklieren, botten, longen en hersenen van muizen om orgaan-afgeleide oplosbare factoren en hun effecten op het metastatische gedrag van kankercellen te identificeren en te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van metastase, zoals: hoe beïnvloeden orgaanspecifieke factoren de groei, migratie en genexpressie van kankercellen? Deze techniek biedt een direct ex vivo platform dat representatief is voor orgaanspecifieke in vivo oplosbare factoren die het fenotype en gedrag van kankercellen beïnvloeden.Om de lymfeklieren te isoleren, begint u door een zes tot twaalf weken oude muis op een polystyreenschuimmat in een steriele weefselkweekkap te plaatsen en de ledematen in een uitgestrekte positie te fixeren. Gebruik vervolgens een pincet en een schaar om een mediane incisie in de abdominale huid te maken van de genitaliën naar de mond. Trek daarna voorzichtig de huid van de buikspieren af en zet deze vast op de dissectiemat.Verwijder de lymfeklieren voorzichtig met een schaar uit de huid, het vet en de vaten, en plaats de klieren direct na het oogsten in 30 milliliters ijskoud PBS. Wanneer alle lymfeklieren zijn verzameld, wordt met de pincet en schaar voorzichtig door de blootgestelde buikwand in een opwaartse beweging door het borstbeen gesneden, waardoor de borstholte wordt blootgelegd. Snijd het diafragma door.Til de longen van onderaf op en snijd het onderliggende weefsel richting de trachea door. Plaats de longen vervolgens in een nieuwe container met ijskoude PBS. Het hart kan tijdens deze stap of vóór het wegen van de organen uit de longen worden verwijderd.Om de pootbeenderen te oogsten, wordt de muis in buikligging geplaatst en wordt de huid over de onderrug van flank tot flank ingesneden. Gebruik vervolgens een stuk steriel gaas om de torso en de huid over de poten en voeten vast te pakken. Houd met hetzelfde stuk gaas het onderbeen vast terwijl u voorzichtig het enkelgewricht van één poot breekt, en pel de huid over het gewricht proximaal richting de knie.Verwijder vervolgens met een schaar de tibia uit het kniegewricht en plaats het pijpbeen in ijskoud PBS. Nadat de tweede tibia is geoogst, wordt het femur met een pincet op zijn plaats gehouden en wordt de omliggende spierweefsel met een schaar weggesneden. Plaats daarna het pijpbeen in ijskoud PBS.Om de hersenen te oogsten, gebruikt u een nieuw stuk steriel gaas om de kop vast te pakken en verwijdert u voorzichtig de huid met een schaar en een pincet om de schedel bloot te leggen. Gebruik vervolgens een schaar om het achterhoofdsbeen zorgvuldig vanaf het bovenste midden van de schedel in een rechte lijn naar beneden door te knippen om de posterieure hersenen vrij te leggen. Schep vervolgens onder het weefsel richting de anterieure zijde van de schedel en breng de volledige hersenen over in ijskoud PBS.Om het longgeconditioneerde medium te genereren, worden de buisjes met longweefsel drie keer omgekeerd om elk residu van bloed uit de organen te verwijderen. Vervang vervolgens de wasvloeistof door verse koude PBS en herhaal dit tot de zoutoplossing bloedvrij is. Verplaats daarna de longen per muis naar één glazen Petrischalen van 60 vierkante millimeter en gebruik twee steriele scalpellames om de weefsels fijn te malen door herhaaldelijk heen en weer te snijden.Wanneer de weefselfragmenten een grootte van ongeveer één millimeter kubiek hebben, worden de stukjes opnieuw gesuspendeerd in het juiste volume DMEM:F12-medium aangevuld met antibiotica, en worden de weefsels per muis geïncubeerd in één putje van een zeswellplaat bij 37 °C en vijf procent CO2. Na 24 uur wordt de volledige inhoud van elk putje overgebracht naar individuele 50 ml conische buizen en wordt het geconditioneerde medium per buis verdund met drie equivalente volumes vers DMEM:F12-medium. Centrifugeer de buizen om grotere stukken weefselresten te verwijderen.Combine vervolgens de geconditioneerde media door een spuitfilter van 0,22 micron in één enkele conische buis van 50 milliliter. Om botmerg-geconditioneerd medium te verkrijgen, worden de botten onder een steriele weefselkweekkap overgebracht en wordt het overtollige weefsel van het bot verwijderd. Gebruik een schaar om de epiphysen te verwijderen.Gebruik vervolgens een naald van 27,5 gauge om 1 mL PBS door de mergholte van elk bot in een buis met verse PBS te spoelen. Wanneer alle beenmergstromale cellen zijn verzameld, worden de cellen drie keer gewassen met PBS. Resuspendeer na de laatste wasbeurt het pellet in 20 mL groeimedium voor beenstromale cellen, aangevuld met 10% foetaal runderserum, en zaai 10 mL cellen per T75-fles uit.Wanneer de cellen een confluentie van ongeveer 70% hebben bereikt, worden de culturen twee keer gewassen met drie milliliter PBS. Detacheer vervolgens de cellen met drie milliliter 0,025% trypsine/EDTA-oplossing, waarbij erop wordt gelet dat de trypsine het gehele oppervlak van de fles bedekt. Stop na twee tot drie minuten de enzymatische reactie met drie milliliter groeimedium voor benenstromale cellen en verzamel de cellen in een buis van 50 milliliter.Centrifugeer de cellen. Resuspendeer het pellet vervolgens in 10 milliliters vers medium. Verdeel de culturen nu in een verhouding van één op vijf over drie nieuwe T75-kolfjes totdat ze een confluentie van 70% bereiken.Was vervolgens de cellen drie keer met PBS zoals zojuist gedemonstreerd, en voed de culturen gedurende 72 uur met serumvrij botstromaalcel-verzamelmedium aangevuld met mitogeen en antibiotica. Pool na de derde dag van cultuur de media door een 0,22 micron zeef. De stromaalcellen zouden adherent in cultuur moeten zijn, waarbij een langgerekte en fibroblastische morfologie wordt waargenomen in de lymfeklijerstromaalcelculturen, en een kleinere en ronder morfologie wordt vertoond door de botmergstromaalcelculturen.Flowcytometrische analyse bevestigt dat de stromale cellen van de lymfeklieren grotendeels CD45-negatief en gp38-positief zijn. Stromale cellen uit het beenmerg moeten positief zijn voor CD-44 en CD-29, zwak positief voor CD-105 en Sca-1, en negatief voor CD-73. Menselijke borstkankercellen met verschillende genetische achtergronden vertonen differentiële migratie- en groeipatronen richting specifieke orgaancondities.In dit representatieve experiment migreert bijvoorbeeld de bot-zoekende 231-BoM-variant bij voorkeur naar het geconditioneerde medium van het beenmerg in vergelijking met de geconditioneerde media van de hersenen en de longen. Op dezelfde manier migreert de long-zoekende 231-LM2-variant bij voorkeur naar het geconditioneerde medium van de longen in vergelijking met de geconditioneerde media van het beenmerg en de hersenen. Bovendien laat RT-qPCR-analyse zien dat blootstelling van ouderlijke MDA-MB-231-borstkankercellen aan geconditioneerd medium van bot of long een upregulatie induceert van de genen die geassocieerd zijn met bot- of longspecifieke metastasen van de borstkankercellen in vivo.Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de oogsting van weefsel en de opzet van het geconditioneerde medium in twee tot drie uur worden voltooid, mits ze correct worden uitgevoerd. De stappen voor subcultivering op volgende dagen nemen 15 tot 30 minuten per dag in beslag. Tijdens het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om alles steriel te houden.Na de generatie van het geconditioneerde medium kunnen andere methoden, zoals proteïne-arrays, celgroeimetingen en migratie-assays, tumorsfeer-vorming en RT-PCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over het effect van organspecifieke factoren op het gedrag van kankercellen. Na de ontwikkeling hiervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van borstkankeronderzoek om organspecifiek metastatisch gedrag in een ex vivo modelsysteem te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u geconditioneerde media genereert met behulp van de botten, longen en hersenen van muizen.Vergeet niet dat het werken met scherpe dissectie-instrumenten gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het gebruik van een precieze en zorgvuldige dissectietechniek.

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video beschrijft een methode voor het genereren van een orgaangeconditioneerd medium afgeleid van de muizenlever. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om orgaan-afgeleide oplosbare factoren en hun effecten op het orgaantropisme en gemetastaseerd gedrag van kankercellen te identificeren en te bestuderen.

Organ Conditioned Medium: Medium genereren uit geoogste orgaancellen voor gemetastaseerde kankerstudies

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

Leer hoe je organ-geconditioneerde media genereert uit lymfeklieren, botten, longen en hersenen van muizen om borstkankermetastase te bestuderen. Deze ex vivo methode helpt onderzoekers organ-specifieke oplosbare factoren identificeren.

Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior (Video) | JoVE Journal

Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior

Meer video's verkennen