Name: Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer virusachtige deeltjes (VLPs) zuiveren voor vaccinontwikkeling met behulp van ultracentrifugatie. Deze methode maakt veilige identificatie van virale antigenen mogelijk zonder complexe dichtheidslagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de voorafgaande leden van de Ross lab die hebben geholpen optimaliseren protocol voor maximale efficiëntie en opbrengst erkennen.

1. Mammalian Expression Systeem voor het genereren van Influenza H3N2 VLP <ol><li> Subkloon virale structurele glycoproteïnen hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische expressievectoren zoals eerder beschreven pTR600. 7 </li><li> Amplificeren DNA in chemisch competente Escherichia coli (bijvoorbeeld DH5a) en isoleren transfectie-grade plasmide met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Hoeveelheid DNA is afhankelijk van de opbrengst en de wensen van de gebruiker. </li><li> Handhaaf zoogdiercellijn, 293T, in groeimedia bevattende 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C met 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Groeien cellen zodanig dat een T-150 weefselkweek kolf bevat 45-75 x 10 6 cellen per fles zodanig dat fles verkrijgt volledige cel hechting en 85-95% cel confluentie door de volgende dag. Inspecteer cellen onder de microscoop op gewenste conflurantie. Opmerking: De hoge celdichtheid wordt meestal aanbevolen om optimale eiwit expressie opleveren met minimale cytotoxiciteit bij het gebruik van commerciële transfectie reagentia echter over-confluentie kan leiden tot ophoping van cellulaire afval bijproducten en levensvatbaarheid van de cellen te verminderen. </li><li> Op de dag van transfectie bereiden liposomen en DNA-mengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant en transfecteren DNA cellen met een DNA samenstelling van 1: 1: 2 of HA: NA: Gag met totaal DNA hoeveelheid 40 ug per T-150 kolf. Verdun DNA- en liposoomoplossingen in serumvrije transfectie media zonder antibiotica zodat elke kolf een totaal volume van 20-30 ml. Let op: Ratio van gen-constructen kunnen gebruikers optimalisatie nodig. Hoewel hier niet getoond, heeft een soortgelijke transfectie procedure uitgevoerd met respiratoir syncytieel virus (RSV) en F HIV Gag op een 1: 1 ratio. Voor DENV en CHIKV één expressieplasmiden totaal 20 ug DNA per T-150 kolf gebruikt voor optimale eXpression. DNA: transfectiereagens verhoudingen gebruiker geoptimaliseerd. Gebruik aanbevolen transfectiemedium gebaseerd op transfectie methode, dwz polykationische lipide transfecties aanbevolen door verlaging of afwezigheid van foetaal runderserum aldus media worden gesupplementeerd met groeihormonen en sporenelementen groei in de afwezigheid van serum ondersteunen. </li><li> Terugkeren kolven tot 37 ° C met 5% CO2 incubator. Voor een volume van 200 ml, gebruiken 9 T-150 kolven. De cellen worden gehandhaafd in transfectie kweekmedium tot de dag van VLP oogst. </li><li> Oogst kweeksupernatant van cellen na 72-96 uur na transfectie afhankelijk antigeen, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80%, zoals geschat door microscopische inspectie. Overdracht supernatant in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om celresten te pelleteren. Opmerking: Vervanging van 3 dagen supernatant met verse voorverwarmde, serumvrije transfectie media om hechtende cellen zal yielda tweede partij van VLPs met gelijke of iets lagere opbrengst en worden geoptimaliseerd door gebruiker. </li><li> Pool supernatant en filter door een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie. </li><li> Test de hemagglutinatie activiteit van de HA-expressie VLP&#39;s door standaard hemagglutinatietest 14 bij 0,8% kalkoen of zoogdiercellen rode bloedcellen of doorgaan met antigeen-specifieke ELISA. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten. </li></ol> 2. CHIK VLP expressie met behulp van baculovirus / Insect Cell System <ol><li> Genereren recombinant baculovirus tot expressie chikungunyavirus capside en envelop-eiwitten (C-E3-E2-6K-E1) van S-27-stam onder toepassing van een commercieel baculovirus expressiesysteem. </li><li> Cultuur Spodoptera frugiperda Sf9-cellen in serumvrij Sf9 groeimedium met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 28 ° C. Gebruik 3-5 x 10 5 c / ml tot centrifugekolf culturen voor suspens initiërenion celgroei. Passage routinematig bij het ​​bereiken celdichtheden van 2-4 x 10 6 c / ml (om de 3-4 dagen). </li><li> Cultuur Sf9 cellen in suspensie in spinner flessen met roeren bij 130 rpm op een multipoint roerder plate-systeem. Voor een goede beluchting, te handhaven cultuur volumes op niet meer dan de helft van het volume van de spinner kolf. </li><li> Voor expressie van CHIK VLP infecteren Sf9-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml recombinant baculovirus met een multipliciteit van infectie van 1 en terugkeer naar 28 ° C incubator. Gewoonlijk infecteren één of twee spinner flessen gemaakt met 250 ml Sf9-cellen. Let op: Hoewel we niet deze methode gebruikt, kan Sf9 cellen gekweekt in schudkolven bij 28 ° C met behulp van een shaker platform. </li><li> Oogst kweken na 72-96 uur na infectie, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80% zoals bepaald door trypan blauw exclusie volgens het protocol van de fabrikant. Opmerking: De cellen blijven prolifereren terwijl geïnfecteerde en ereen ~ 80% levensvatbaarheid Sf9 kweken geïnfecteerd met recombinant baculovirus CHIK VLP op 3 dagen na infectie (dpi). -Baculovirus geïnfecteerde cellen zijn groter van uiterlijk. Morfologie ook veranderen van rond tot langwerpig. In de late stadia van baculovirus infecties, de cellen begon te lyseren. </li><li> Transfer kweken direct van suspensiekweek in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verzamel supernatanten en te filteren door middel van een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie. </li></ol> 3. Sedimentatie / Zuivering van VLP / SVP <ol><li> Steriliseren 25 mm x 89 mm met open dak ultracentrifuge buizen met 70% ethanol in bioveiligheid kap. Zorg ervoor dat de ethanol is opgedroogd af voor gebruik. </li><li> Plaats maximaal 32 ml van de bovenstaande in een schone buis. Een minimaal volume van 25 ml wordt aanbevolen om collaps en beschadiging van onvoldoende gevuld ultracentrifuge buizen te voorkomen. </li><li> onderlaag zorgvuldig supernatanten with steriele 3 ml 20% glycerol in PBS (v / v). Controleer buizen zijn gebalanceerd. </li><li> Spin bij 135.000 g gedurende 4 uur bij 4 ° C. </li><li> Zuig supernatant, het waarborgen van de pellet niet los van de buis. </li><li> Hersuspenderen gesedimenteerd VLP onderaan de buizen met steriele PBS door krachtig pipetteren en neer. De hoeveelheid PBS nodig resuspenderen VLP afhankelijk VLP totale eiwitopbrengst en verdere toepassingen. Typisch, resuspendeer pellet in elk VLP ten minste 100 pl. </li><li> Store monsters 4 ° C voor de korte termijn opslag en -80 ° C opslag voor de lange termijn opslag. </li></ol> 4. Vaststellen Eiwit Opbrengsten en Specifiek Antigeen Opbrengsten <ol><li> Bepaal het totale eiwitgehalte onder toepassing van een commerciële eiwit kwantificering werkwijze, zoals BCA assay volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Specifieke antigeengehalte beoordelen voeren direct enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) door bekleding van seriële verdunningen van standaard antigen en 2-51, g totaal eiwit monster een ELISA 96-well plaat met vlakke bodem. <ol><li> Breng vervolgens antigeenspecifieke antilichamen om de aanwezigheid van de antigenen op de plaat sonde en gebruik conventionele ELISA ontwikkeling substraten detecteerbare absorptie voor microplaatlezer produceren. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten van HA en ELISA bepaling voor een monster HA tot expressie VLP; vele combinaties van HA en NA zijn mogelijk, maar de opbrengst kan verschillen bij HA-NA compatibiliteit 15. Opmerking: Antigeen-specifieke antilichamen hebben variabele affiniteiten en het wordt aanbevolen dat eindpunt-verdunning titratie van antilichamen worden bepaald voordat VLP kwantificering. Commerciële antilichamen voorgestelde concentratie of verdunning bereiken voor gebruik in ELISA, alsmede gesuggereerd protocollen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li>
<li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engerix-B+package+insert%5BTitle%5D)+AND+%22GlaxoSmithKline%2C+Research+Triangle+Park%2C+NC%22%5BJournal%5D)">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li>
<li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li>
<li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+%28COBRA%29+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li>
<li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501(2008).</li>
<li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li>
<li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li>
<li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB%2Fc+mice%2C+with+no+evidence+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li>
<li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li>
<li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vaccine+Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li>
<li>Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).</li>
<li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+DL+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 463, Academic Press. 191-222 (2009).</li>
<li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li>
<li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A%2Fgoose%2FGuangdong%2F1%2F96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+%3A+Morbidity+and+mortality+weekly+report%5BTitle%5D)+AND+%22Recommendations+and+reports+%2F+Centers+for+Disease+Control%22%5BJournal%5D)">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben de hierboven beschreven technieken die worden gebruikt om met succes uit te drukken en te zuiveren SVP en VLP samengesteld uit meerdere structurele eiwitten van verschillende ziekteverwekkers. In het algemeen gebruiken we zoogdierexpressiesystemen onze VLP&#39;s te genereren. Echter, in onze handen, zoogdieren cel afkomstige CHIK VLP opbrengsten waren laag. CHIK VLP opbrengst was robuuster bij het gebruik van een recombinant baculovirus-insectencel systeem. In het algemeen baculovirus-insectencel systemen leve...

Virusachtige deeltjes (VLP&#39;s) zijn een erkende technologie voor de vaccinatie van mensen. In feite zijn sommige van de meer eigentijdse geregistreerde vaccins, zoals de menselijke papillomavirus (HPV) en hepatitis Β (HepΒ) vaccins gebruiken deze aanpak. VLP&#39;s worden gevormd uit structurele eiwitten die in staat zelf te monteren. De samengestelde deeltjes nabootsen virale morfologie, maar kan infecteren of te repliceren, omdat ze geen virale genomen. VLP&#39;s kunnen tot expressie worden gebracht en gezuiverd uit een aantal prokaryotische en eukaryotische systemen. Een overzicht van de literatuur is gebleken dat verschillende expressie systemen worden ingezet tegen de volgende tarieven: bacteriën - 28%, gist - 20%, plant - 9%, insect - 28%, en van zoogdieren - 15% 1. Van de nota, zijn HPV-vaccins gebaseerd op L1 capside-eiwit geproduceerd in gist (Gardasil) of in een insect cel systeem (Cervarix) 2. HepΒ vaccins Recombivax en Engerix-Β, worden geproduceerd in gist, en bestaan ​​uit HepΒ oppervlakteantigeen 3, 4. We gebruiken zoogdier- en insectencellen-expressiesystemen tot VLP&#39;s die co-expressie van meerdere eiwitten voor structurele assemblage produceren. Ons werk richt zich op het ontwerpen, produceren en zuiveren-VLP gebaseerde vaccins tegen menselijke pathogenen: griepvirus, respiratoir syncytieel virus (RSV), dengue virus (DENV) en chikungunya-virus (CHIKV). De methoden zijn flexibel genoeg om voor co-expressie van meerdere structurele eiwitten van verschillende expressieplasmiden of een expressieplasmide (figuur 1). Eerder hebben we geproduceerd en gezuiverd H5N1 VLP&#39;s opgebouwd uit de co-expressie van plasmiden die coderen voor influenza hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en matrix (M1) in humane embryonale nier 293T-cellen 5,6. De genen werden codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in pTR600, een eukaryotische expressievector die de cytomegalovirus immediate-early promotor plus intron A voor het initiëren Transcription van eukaryote inserts en runderen groeihormoon polyadenyleringssignaal voor beëindiging van de transcriptie 7. Een vergelijkbare benadering met behulp van drie plasmide co-expressie van HA, NA (figuur 1A) en een andere virale matrix eiwit, HIV Gag p55, werd gebruikt voor het verkrijgen van seizoensgebonden influenzasubtype menselijke H3N2 VLP&#39;s in dit onderzoek en blijkt genereren VLP&#39;s van soortgelijke grootte als influenza deeltjes 8. Hoewel griepvaccins hoofdzakelijk opwekken anti-HA-antilichamen, de toevoeging van griep neuraminidase bemiddelt sialidase activiteit VLP budding uit getransfecteerde cellen en 9 aanwezig additionele immunogene targets mogelijk. RSV VLP produceren we ook de geselecteerde verbonden kern van HIV Gag prototypische vaccins die uitsluitend RSV-glycoproteïnen van het oppervlak presenteren verder aan te tonen flexibiliteit van VLP-vorming middels HIV Gag, zoals eerder beschreven en gekenmerkt door elektronenmicroscopie 6,10 ontwerpen. anderenhebben eerder aangetoond dat VLP presenteren RSV-glycoproteïnen kunnen worden geassembleerd met behulp van verscheidene virale componenten van Newcastle Disease virus (NDV) 11 en 12 influenza matrix. Full-length oppervlakte glycoproteïne sequenties werden gebruikt in deze studie natieve conformaties die noodzakelijk zijn voor receptorbinding en functionele antilichaamherkenning assay kan worden door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) behouden. Onze voorbeelden voor het gebruik van enkel plasmide expressie systemen om deeltjes te genereren DENV en CHIKV. Bij DENV, kunnen we subvirale deeltjes (SVP) zonder capside in 293T cellen van een plasmide dat een prM / E structurele genexpressiecassette 13 produceren. De term SVP wordt gebruikt om het gebrek aan een kern- of capside-eiwit in de assemblage van virale structurele proteïnen duiden. CHIK VLP&#39;s kunnen ook worden geproduceerd met een plasmide dat een structureel gen CHIKV cassette codeert capside en envelop eiwitten of insect cellen door het infecteren met een recombinant baculovirus coderend voor hetzelfde gen cassette structureel geoptimaliseerd voor insectencel expressie (Figuur 1B - C). Het eindresultaat van de expressie benaderingen hierboven besproken is het vrijkomen van VLP&#39;s in celkweekmedium dat dan via ultracentrifugatie kan worden gezuiverd door een 20% glycerol kussen. In dit rapport presenteren we methoden om uit te drukken en te zuiveren van deze VLP&#39;s van zoogdieren en insecten cel systemen.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear ultracentrifuge tubes</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Bevestig geschikte buizen voor ultracentrifuge en emmergrootte</td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat citraat buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-fenyleendiamine dihydrochloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 μm vacuümfilter top (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virusachtige deeltjes (VLP&#39;s) en subvirale deeltjes (SVP) een alternatieve benadering voor virale vaccins die de voordelen van een verhoogde biologische veiligheid en stabiliteit op het gebruik van levende pathogenen heeft. Niet-infectieuze en zelfassemblerende VLP&#39;s worden gebruikt voor structurele eiwitten presenteren als immunogenen, het omzeilen van de behoefte aan levende pathogenen of recombinante virale vectoren voor antigeen-afgifte. In dit artikel tonen we de verschillende stadia van VLP ontwerp en ontwikkeling voor toekomstige toepassingen in preklinische dierproeven. De procedure omvat de volgende stadia: selectie van antigeen expressie van antigeen in cellijn naar keuze, zuivering van VLP&#39;s / SVP en kwantificering van antigeen doseren. We demonstreren gebruik van zowel zoogdieren en insecten cellijnen voor expressie van onze antigenen en tonen hoe methoden verschillen opbrengst. De gepresenteerde methode kan voor een verscheidenheid aan pathogenen en kan worden bereikt door het substitueren van de immunogene antigenen met structural eiwitten van micro-organisme van het belang van de gebruiker. VLP&#39;s en SVP helpen met antigeen karakterisering en selectie van de beste kandidaat-vaccins.

VLP opbrengsten waren variabel door virale antigeen construct ontwerp. In dit protocol hebben we gebruik van insectencellen en zoogdiercellen voor de productie van SVP of VLP&#39;s in supernatant en zuivering door ultracentrifugatie toonde. Vier subtypen van DENV prM / E structuurgen expressiecassettes werden gebruikt om de versie van DENV SVP (afgebakend zoals 1-4) construct in tabel 1 en tonen een bereik tussen 1,1-2,6 mg totaal eiwit in 0,6 ml volumes. Voor VLP dat ee...

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Het algemene doel van deze procedure is het zuiveren van virusachtige deeltjes, of VLP's, die tot expressie worden gebracht en worden uitgescheiden door expressiesystemen van zoogdier- of insectencellen. Deze methode kan antwoord bieden op kernvragen binnen het vakgebied van de vaccinologie, zoals hoe conformationeel relevante virale antigenen op een veilige en flexibele manier kunnen worden tot expressie gebracht en gezuiverd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen proteïneprecipitatie met polyethyleenglycol of het bereiden van meerdere dichtheidslagen vereist om VLP's te concentreren.Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij de identificatie van virale antigenen als vaccindoelen, kunnen VLP's ook worden gebruikt als instrumenten voor ziekteonderzoek en serologie. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien een glycerol-onderlaag bij de resuspensiestappen van VLP's moeilijk aan te leren is omdat beginners mogelijk geen gebruik maken van de juiste techniek. Bereid op de dag van de transfectie de liposoom- en DNA-oplossingen voor volgens de aanbevelingen van de fabrikant.Transfect de DNA-cellen met een DNA-compositie van één op één op twee van HA op NA op Gag en een totale DNA-hoeveelheid van 40 microgram per T150-fles. Herhaal deze stap om negen T150-flessen te creëren, voor een totaal volume van 200 milliliter. Verdun vervolgens de DNA- en liposoomoplossingen in serumvrij transfectiemedium zonder antibiotica, zodat elke fles een totaal volume van 24 milliliter bevat.Plaats de kolven terug in de incubator en houd de cellen en het transvectie-kweekmedium in stand tot de dag van de oogst van virusachtige deeltjes, of VLP's. Breng het supernatant over in conische buizen van 50 milliliter om de kweek 72 tot 96 uur na transvectie van de cellen te oogsten. Centrifugeer de cellen om het cellulaire debris te pelletteren.Verzamel de supernatanten en filter deze door een 0,22 micron poreus membraan. Kweek eerder bereide spodoptera frugiperda-, of Sf9-cellen, in suspensie in spinner-kolven, door deze continu te roeren bij 130 rpm op een multi-point roerplaat-systeem. Houd de cultuurvolumes op maximaal de helft van het volume van de spinner-kolf voor een goede beluchting.Exprimeer vervolgens CHIK VLP's door 250 milliliter Sf9-cellen in een spinnerfles bij een dichtheid van twee keer tien tot de zes cellen per milliliter te infecteren met eerder geprepareerd recombinant baculovirus, en plaats de cellen terug in een incubator van 28 degree Celsius. Gebruik trypaanblauw-uitsluiting om vast te stellen of de celviabiliteit is afgenomen tot 70 tot 80%. Na bevestiging worden de culturen direct vanuit suspensie overgebracht naar 50 milliliter conische buizen en worden de cellen gecentrifugeerd. Verzamel de supernatanten en filter deze door een 0.22 micron pour-membraan vóór sedimentatie.Sterilise zes ultracentrifugebuizen van 25 millimeter bij 89 millimeter met een open bovenkant met 70% ethanol. Zorg vervolgens dat de ethanol volledig is verdampt. Breng 32 milliliters supernatant over in de schone buizen.Leg vervolgens voorzichtig een laag van drie milliliter steriele 20% glycerol en PBS onder de supernatanten. Voeg de glycerol langzaam toe om verstoring van de dunne dichtheidslaag tussen de glycerol en de VLP-oplossing te voorkomen. Het te snel toevoegen van de glycerol zal ertoe leiden dat de glycerol en de VLP-oplossingen mengen, waardoor de sedimentatie van de VLP's afneemt.Zorg ervoor dat de buisjes in balans zijn en start vervolgens de centrifugatie. Verwijder de buisjes na vier uur uit de centrifuge. Aspireer het supernatant, waarbij u er zorgvuldig op let dat het pellet niet uit de buis wordt losgemaakt.Resuspendeer de bezonken VLP's onderin de buisjes in ten minste 100 µL steriele PBS door voorzichtig en langzaam op en neer te pipetteren. De resuspensie van het VLP-pellet moet worden uitgevoerd door PBS herhaaldelijk voorzichtig en langzaam op te zuigen en uit te stoten met een pipet. Vermijd de vorming van bellen om verlies van VLP's te beperken.Bewaar tot slot de resuspendeerde VLP's. VLP-volumes en de totale eiwitopbrengst, bepaald met een conventionele BCA-assay, werden verkregen van diverse SVP- en VLP-constructen. De CHIK SVP-opbrengsten uit Sf9-cellen variëren tussen 0,008 en 0,016 milligram totaal eiwit per milliliter supernatantvolume.Terwijl productie via mammale 293 T-cellen leidt tot een tienvoudige afname van het eiwit, laat deze elektronenmicrografie zien dat HA Gag core influenza VLP's succesvol worden tot expressie gebracht, geassembleerd en gezuiverd als VLP's. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen gezonde en levensvatbare celculturen moeten worden getransfecteerd en geïnfecteerd, aangezien dit de totale expressieniveaus van het eiwit beïnvloedt.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals BCA-, ELISA- en HA-assays worden uitgevoerd om het totale eiwitgehalte, het specifieke antigeengehalte en de expressie van het functionele HA te meten. Houd er rekening mee dat het werken met een ultracentrifuge gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het balanceren van de buizen, het uitsluitend gebruiken van aanbevolen rotors en snelheden, en het correcte toezicht op nieuw laboratoriumpersoneel.

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors — encoding different viral structural proteins — in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

This video shows how virus-like particles, VLPs are generated by infecting insect cells with a recombinant baculovirus carrying the chikungunya virus gene cassette. The recombinant virus infects cells, leading to VLP formation, assembly, and release into the culture medium for potential use in vaccine production.

Generation of Chikungunya Virus-Like Particles Using Baculovirus Expression System in Insect Cells

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke...

Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay

Het huidige protocol beschrijft de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als een "Plug-and-Display" vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.

Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Leer virusachtige deeltjes (VLPs) zuiveren voor vaccinontwikkeling met behulp van ultracentrifugatie. Deze methode maakt veilige identificatie van virale antigenen mogelijk zonder complexe dichtheidslagen.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Meer video's verkennen