Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van

Het algemene doel van deze zuivering is om functioneel Helicobacter pylori neutrofiel-activerend proteïne of HP-NAP in zijn natuurlijke vorm te verkrijgen met een hoge zuiverheid en opbrengst, gebruikmakend van batchchromatografie in negatieve modus met di-ethylamino-ethyl ionenuitwisselingshars. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat HP-NAP in één stap in zijn natuurlijke vorm kan worden gezuiverd met een hoge zuiverheid en opbrengst. De negatieve zuivering van HP-NAP begint met een batch-bindingsprocedure waarbij de oplosbare proteïnefractie uit bacteriële lysaten wordt toegevoegd aan DEAE-hars.

Het mengsel wordt geïncubeerd om de totale eiwitten te laten binden aan de hars. HP-NAP in de ongebonden fractie wordt vervolgens verkregen door centrifugatie of door zwaartekrachtstroom. De implicaties van deze techniek zijn een 10:1 preventieve behandeling en prognostiek van Helicobacter pylori-geassocieerde ziekten, evenals cancertherapie.

Vanwege de immunogene en immunomodulerende eigenschappen van HP-NAP zullen personen die niet bekend zijn met deze methode over het algemeen moeite hebben, omdat HP-NAP gemakkelijk aggregeert tijdens de sterilisatie.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Zhi-Wei Hong, een promovendus uit ons laboratorium. Terwijl er op vier graden Celsius wordt gewerkt, suspenderen we 50 milliliters van het celpellet, geprepareerd zoals beschreven in het tekstprotocol, in 20 milliliters Tris-buffer met een lage zoutconcentratie bij pH 9.0 met een protease-remmermengsel. Het is essentieel om de monsters op vier graden Celsius te houden, zodat de procedure proteïneaggregatie kan voorkomen.

Breek de bacteriële cellen open door de bacteriële suspensie zeven keer door een hogedrukhomogenisator te leiden, ingesteld op een bereik van 15, 000 tot 20, 000 PSI bij vier graden Celsius. Zodra de lysaten zijn gevormd, moeten deze onmiddellijk worden gecentrifugeerd. Breng de gehomogeniseerde monsters over in een centrifugebuis.

Centrifugegeel het cellysaat onmiddellijk in een ultracentrifuge bij 30.000 ×g gedurende één uur bij vier graden Celsius om de oplosbare en onoplosbare eiwitfracties te scheiden. Breng na centrifugatie het supernatant als de oplosbare eiwitfractie over in een bekerglas. Bepaal de eiwitconcentratie van de oplosbare eiwitfractie via de Bradford-methode met behulp van een commerciële kit en bovine serumalbumine als standaard, conform de instructies van de fabrikant.

Voeg vervolgens 177,6 µL normale HCl toe aan 20 mL van de oplosbare eiwitfractie om de pH-waarde aan te passen van pH 9,0 naar pH 8,0. Voeg 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, en 50 mM natriumchloride toe aan de eiwitoplossing om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,5 mg/mL te verkrijgen. Om 15 mL DEAE-hars voor te bereiden, wordt 0,6 g DEAE-hars droog poeder gedurende ten minste één dag bij kamertemperatuur gesuspendeerd in 30 mL Tris-HCl-buffer.

Centrifugeer de hars bij 10.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende één minuut en verwijder vervolgens het supernatant om dit weg te gooien. Voeg daarna 15 milliliters Tris-HCl-buffer toe. Nadat de centrifugatie- en resuspensiestappen nog vier keer zijn herhaald, bewaart u de 15 milliliters bezonken hars bij vier graden Celsius voor later gebruik.

Voeg bij vier graden Celsius 45 milliliter van de voorbereide oplosbare eiwitten toe aan milliliter van de hars en breng dit over naar een bekerglas van 100 milliliter met een roerstaf. Roer het eiwit-harsmengsel met een roerplaat bij vier graden Celsius gedurende één uur. Giet vervolgens het eiwit-harsmengsel in een plastic of glazen kolom die is voorzien van een stopkraan en laat de hars onder invloed van de zwaartekracht bezinken.

Open de stopkraan zodat de eiwitoplossing door zwaartekrachtstroom door de kolom kan lopen totdat het vloeistofniveau in de kolom net boven de hars bevindt. Verzamel de doorstroom als de ongebonden fractie die het gezuiverde neutrofiel-activerende eiwit bevat. Voeg 15 milliliters van de ijskoude Tris-HCl buffer toe aan de kolom.

Open de stopkraan opnieuw zodat de wasbuffer door zwaartekracht door de kolom kan stromen totdat het vloeistofniveau in de kolom net boven de hars staat. Verzamel de doorstroom als wasfractie. Herhaal het wassen met ijskoude buffer nog vier keer om de aanvullende wasfracties te verzamelen.

Voeg vervolgens 15 milliliters ijskoude 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, één molar natriumchloride toe aan de kolom. Verzamel de doorloop als elutiefracties zoals voorheen. Herhaal de elutiestappen nog vier keer om de aanvullende elutiefracties te verzamelen.

Het effect van pH op de oplosbaarheid van HP-NAP in E.coli lysaat wordt hier getoond. De hoeveelheid HP-NAP gedetecteerd in deze oplosbare fractie was merkbaar verhoogd bij pH 7,5 tot 9,5. Recombinant HP-NAP werd bijna volledig teruggewonnen in de oplosbare fractie na cellysis bij pH 9,0.

Hier worden de effecten van de pH op de negatieve zuivering van recombinant HP-NAP, tot expressie gebracht in E.coli, met DEAE-harsen in batchmodus getoond. Bij pH 8.0 was slechts een kleine hoeveelheid HP-NAP aanwezig in de elutiefractie. De hoeveelheid HP-NAP in de ongebonden fracties was het hoogst bij pH 8.0.

De geoptimaliseerde hoeveelheid eiwitten die op de DEAE-hars wordt geladen, is 1,5 milligram eiwit per milliliter hars om de maximale capaciteit van de hars voor het absorberen van onzuiverheden uit E.coli te bereiken. Bij pH 8,0 worden er in batchmodus met DEAE-harsen zeer weinig eiwitten anders dan HP-NAP in zijn natuurlijke vorm teruggewonnen in de ongebonden fractie. De zuiverheid van HP-NAP was hoger dan 95 procent.

Het gezuiverde HP-NAP vouwt zich tot een multimeer met een secundaire structuur van alfa-helix, zoals blijkt uit het gelfiltratie-chromatogram en het far-UV circulaire dichroïsme-spectrum. Een luminale-afhankelijke chemiluminescentie-assay onthult dat het gezuiverde HP-NAP in staat is om de productie van reactieve zuurstofsoorten door neutrofielen te triggeren. Zodra deze technieken beheerst zijn, kunnen ze binnen vijf uur worden uitgevoerd indien dit correct wordt gedaan.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe functioneel HP-NAP in zijn natuurlijke vorm met een hoog rendement en een hoge zuiverheid kan worden gezuiverd middels batch-chromatografie in negatieve modus met DEAE-ionenwisselingshars. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat buffers met de juiste pH moeten worden gebruikt tijdens de sterilisatiestap in de batch-chromatografie. Het idee voor deze methode ontstond toen we probeerden andere chromatografische benaderingen in plaats van filtratie toe te passen om HP-NAP in zijn natuurlijke vorm te zuiveren.

Hoewel deze methode is ontworpen voor zuivering door recombinant HP-NAP tot expressie gebracht in E.coli, kan deze ook worden toegepast op andere bacteriële expressiesystemen, zoals per-sida sep-tidas. De visuele demonstratie van deze procedure is kort.

Daarnaast zijn de stappen van sterilisatie en batch-chromatografie moeilijk aan te leren. Deze stappen moeten namelijk zonder tijdverlies bij vier graden Celsius worden uitgevoerd. Indien een eiwit dat bestemd is voor zuivering geschikt is voor onze ionenuitwisselingschromatografie in negatieve modus, kan deze procedure ook worden aangepast als uitgangspunt voor de ontwikkeling van een zuiveringsproces.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het klinische veld om de mogelijkheid te verkennen van het gebruik van HP-NAP in cancertherapie, alsook de ontwikkeling van vaccins, geneesmiddelen en diagnostiek voor ziekten die geassocieerd zijn met Helicobacter pylori.