Name: RNA Zuivering van Intracellulair Grown Listeria monocytogenes In macrofaag-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer RNA-zuivering van intracellulair gegroeide Listeria monocytogenes in macrofaagcellen. Deze methode verrijkt bacteriëel RNA en minimaliseert contaminatie met gastheernucleïnezuren voor transcriptoomanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek in het Herskovits-lab wordt ondersteund door 335400 ERC en R01A/109048 NIH-subsidies.

Opmerking: Gedurende het gehele experiment worden macrofaag cellen geïncubeerd bij 37 ° C in een 5% CO 2 geforceerde incubator genomen uit de incubator alleen voor experimentele manipulaties die worden uitgevoerd in een Klasse II biologische veiligheidskast. Werken met L. monocytogenes bacterie is volgens de biologische veiligheid niveau 2 regelgeving. 1. Celbereiding en bacteriële infectie (dag 1 en 2) <ol><li> Dag 1 <ol><li> Zaad 2,0 x 10 7 beenmerg afgeleide cellen macrofagen (BMDM) op een 145 mm schaal in 30 ml BMDM + Pen-Strep media (tabel 2). Zaad 3 platen voor elke bacteriestam te analyseren. Incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO 2 geforceerde lucht incubator. </li><li> Start een &#39;s nachts bacteriecultuur van wild-type (WT) L. monocytogenes stam 10403S in 10 ml Brain Heart infusie (BHI) medium bij 30 ° C in een standaard incubator. Plaats cultuur buizen schuin zonder schudden. Notitie:De groeicondities up-reguleren van de expressie van de genen flagella die efficiënte infectie bevordert. </li></ol></li><li> Dag 2 <ol><li> Voorverwarmen BMDM medium (zonder Pen-Strep antibiotica) (Tabel 2) en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C. </li><li> Wassen macrofaag monolaag tweemaal met 25 ml voorverwarmde PBS antibiotica verwijderen. Voeg 30 ml vers BMDM medium. </li><li> Was 1,5 ml overnacht bacteriecultuur met PBS door centrifugeren kiemen bij&gt; 14.000 xg gedurende 1 min, gooi de supernatant en hersuspenderen bacteriën voorzichtig in 1,5 ml PBS door pipetteren. Herhaal dit twee keer. </li><li> Infect elk macrofaag plaat met 0,5 ml van een gewassen &#39;s nachts cultuur van wild-type L. monocytogenes. Bij gebruik van meerdere platen, besmetten elke plaat 15 min uit elkaar. Dit tijdsinterval zal toelaten oogsten elke plaat afzonderlijk aan het eind van de infectie. Opmerking: De multipliciteit van infectie (MOI) wordt bepaald door het uitplaten seriële verdunnings bacteriekweek gebruikt voor infectie op BHI-agarplaten en het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) na 24 uur incubatie van de platen bij 37 ° C. Gebruik 0,5 ml WT L. monocytogenes stam 10403S resulteert in een MOI van ~ 100 (100 CFU bacteriën per macrofaag cel). Bij de analyse van bacteriële mutanten in intracellulaire groei, moet een hogere MOI worden beschouwd. </li><li> Na 0,5 uur incubatie bij 37 ° C, was de geïnfecteerde cellen tweemaal met PBS om ongebonden bacteriën te verwijderen en voeg 30 ml voorverwarmd medium BMDM. Bijgevoegde bacteriën internaliseren tijdens de komende 0,5 uur. </li><li> Op 1 h na infectie, voeg 30 ul van gentamicine (1: 1000 tot een eindconcentratie van 50 ug / ml bereikt) om extracellulaire bacteriën te doden. </li><li> Monteer het filter apparaat door het plaatsen van een filter hoofd op een verzamelen vloeistof kolf met een vacuüm uitlaatpoort. plaats dan een filter (0,45 pm) op een filterkop, gevolgd door een cilinder trechter en zet de verschillende onderdelen met een metalen clamp. Bereid ijskoude RNase-free water. </li><li> Op 6 uur na infectie oogst bacteriën uit geïnfecteerde cellen als volgt. Behandel elke plaat afzonderlijk. Opmerking: Meestal, L. monocytogenes voltooit 1-log van de groei gedurende 6 uur van de infectie in macrofagen cellen. Langere incubaties kan leiden tot bacteriële overgroei en celdood van macrofagen, terwijl kortere incubatieperiode kan leiden tot aanzienlijk lagere bacteriële belasting. De MOI en het tijdstip van infectie kan worden aangepast om optimale condities te bereiken. <ol><li> Was geïnfecteerde cellen eenmaal met PBS. Voeg 20 ml van ijskoude RNase-free water om macrofaag lyseren. Met behulp van een cel schraper, schraap de cellen van de plaat snel, maar zorgvuldig. </li><li> Verzamel gelyseerde cellen om een ​​50 ml conische buis. Vortex gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Passeren de bovenstaande vloeistof door het filter waarbij gebruik wordt gemaakt van een vacuümsysteem. Met behulp van een pincet, rol de filter en zo snel mogelijk aan een 15 ml CONIcal buis. Snap-bevriezing van de buizen met de filters in vloeibare stikstof. </li><li> Monteer de filterinrichting een nieuw filter voor het volgende monster, zoals beschreven in 1.2.7. </li><li> Bewaar de filters bevroren bij -80 ° C voor de volgende dag. U kunt ook direct doorgaan naar nucleïnezuur extractie. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. nucleïnezuren Extraction (dag 3) Opmerking: Voer alle manipulaties met fenol en chloroform oplossingen in een zuurkast. <ol><li> Maak een 1: 1 mengsel van aangezuurde fenol: chloroform, 400 gl van elk monster. Meng in een aparte buizen, en dan trekken de resulterende waterlaag door aspiratie. Voeg 40 ul van 10% SDS. </li><li> Ontdooi de filter bevattende buizen op ijs te koud. Aan elk filter bevattende buis voeg 650 ul acetaat-EDTA (AE) buffer (tabel 2). </li><li> De volgende stappen zo snel mogelijk. <ol><li> Krachtig vortex de buis met de filter zodat de filter whisks de omtrek van de buis en de buffer volledig wast de filter. Houd de buis koud door het plaatsen van het weer op het ijs. Opmerking: Het kan nodig zijn om de buis bovendien vortex terwijl omgekeerd om de bacteriën volledig wassen van het filter. </li><li> Herhaal dit voor alle buizen. Het kan nuttig zijn om weer op gang langs de suspensie kort (1 min bij 120 xg) aan het einde van het proces. </li></ol></li><li> Breng de bacteriën-bevattende buffer een microcentrifugebuis van 1,5 ml met de SDS en fenol / chloroform mengsel (zoals bereid in 2,1). Herhaal dit voor alle buizen. Het kan nodig zijn om het filter met buizen (1 min bij 120 xg) draaien opnieuw om resterende buffer krijgen van het filter. </li><li> Plaats alle 1,5 ml buizen in een multi-tube vortex-apparaat en vortex op volle snelheid gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer de buizen in een 65 ° C warmteblok 10 min. Centrifuge bij maximale snelheid (&gt; 14.000 xg) gedurende 5 min. </li><li> Breng de waterige fase (ongeveer 400 ui) van elk tUbe een nieuwe 1,5 ml buis met 40 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 1,0 ml 100% ethanol. Vortex elke buis grondig. Opmerking: Glycogeen kan in deze stap worden toegevoegd aan visualisatie van het geprecipiteerde pellet verbeteren. </li><li> Incubeer de monsters bij -80 ° C gedurende 1 uur. Alternatief incubeer monsters bij -20 ° C overnacht. Vervolgens centrifuge de monsters bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid (&gt; 14.000 xg). </li><li> aspireren voorzichtig de ethanol (bovenste laag) van elke buis. Voeg 500 ul koude 70% ethanol aan elk monster en vortex grondig. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid (&gt; 1 4000 xg). </li><li> aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis. De monsters worden gedurende ongeveer 2 minuten met behulp van een vacuüm verdamper zonder warmte. Niet over-drogen van de monsters. </li><li> Voeg 25 pi RNase-vrij water aan elk monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voorzichtig vortex en spin-neer. </li><li> Meten RNA-concentratie in thij monsters met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer. Verwachten tot ongeveer 0,5 te halen - 1 pg van nucleïnezuren per plaat. Opmerking: Technische duplo kunnen worden gecombineerd in dit stadium. </li></ol> 3. DNase behandeling <ol><li> Stel de reactie volgens Tabel 1 in een microfugebuis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Voeg 450 gl RNase-vrij water en 500 ui fenol-chloroform-IAA mix (tabel 2), afzonderlijke fasen door centrifugeren gedurende 2 min bij maximale snelheid (&gt; 14.000 xg). </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 500 ul chloroform-IAA mix (tabel 2), vortex en afzonderlijke fasen door 2 min centrifugeren bij maximale snelheid (&gt; 14.000 xg). </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 1 ml ethanol en 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2). Vortex. Opmerking: Glycogeen kan in deze stap worden toegevoegd aan visualisatie van het geprecipiteerde pellet verbeteren. </li><li&gt; Incubeer gedurende 1 uur bij -80 ° C. Alternatief incubeer monsters bij -20 ° C overnacht. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid. </li><li> aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis. Voeg 500 ul koude 70% ethanol aan elk monster en vortex grondig. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid. aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis. </li><li> De monsters worden gedurende ongeveer 2 minuten met behulp van een vacuüm verdamper zonder warmte. Niet over-drogen van de monsters. </li><li> Voeg 12 gl RNase-vrij water, incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, vortex, en gaat draaien. De monsters bevatten gezuiverde RNA, houd ze op ijs. Alternatief los RNA in RNase-vrij H2O met 0,1 mM EDTA of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA). </li><li> Meet RNA concentraties met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer. Verwacht ~ 100 ng RNA per monster (indien technisch replica worden gecombineerd). Opmerking: RNA geëxtraheerd volgens dit protocol is geschikt for gentranscriptie analyse van meerdere technieken. We meestal maken gebruik van RT-qPCR analyse om L. te studeren monocytogenes gentranscriptie tijdens infectie van macrofagen cellen 1-4. </li></ol>

<ol><li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li>
<li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).</li>
<li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP%2C+which+contribute+to+type+I+interferon+induction%2C+play+a+role+in+cell+wall+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li>
<li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li>
<li>World Health Organization WHO. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/en/">http://www.who.int/en/</a> (2005).</li>
<li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+human+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li>
<li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection%3A+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li>
<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li>
<li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+%28SCOTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li>
<li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li>
<li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34(2015).</li>
<li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+3%27Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323(2015).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li>
<li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocol vormt een geoptimaliseerde methode voor de isolatie van bacteriële RNA uit L. monocytogenes bacteriën intracellulair groeien in macrofaagcellen. Dit protocol is gebaseerd op differentiële cel lysis en omvat twee belangrijke stappen voor de verrijking van bacteriële RNA: macrophage kernen sedimentatie middels centrifugatie en snelle ophoping van bacteriën door filtratie. Deze stappen worden gevolgd door een standaard RNA-extractieprocedure. Hoewel dit protocol beschrijft zuivering van...

Intracellulaire bacteriële pathogenen ─ bacteriën die infectieziekten en kunnen groeien en reproduceren in de cellen van menselijke gastheren ─ zijn een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd 5. Binnen te vallen en te repliceren binnen een zoogdiercel, hebben intracellulaire pathogenen verfijnde virulentie mechanismen en factoren verworven. Hoewel deze zijn essentieel voor het vermogen om een ​​ziekte te veroorzaken, weten we weinig over hun regulatie en dynamiek. Aangezien genexpressieprofielen bacteriën gekweekt in vloeibaar medium niet de werkelijke omgeving binnen gastheercellen weerspiegelen, is er een groeiende behoefte aan transcriptoom analyse bacteriën gekweekt in hun intracellulaire niches. Dergelijke analyses zullen de ontcijfering van specifieke bacteriële aanpassingen naar aanleiding van de gastheer mogelijk te maken en zal helpen om nieuwe targets te identificeren voor therapeutische design. Transcriptoom analyse van intracellulaire bacteriën gekweekt zeer uitdagend omdat zoogdier RNA overtreffen bacterieel RNA met tenminste tienvoudige. In dit manuscript beschrijven we een experimentele methode om bacteriële RNA isoleren van Listeria monocytogenes bacteriën groeien binnen muizen macrofaag cellen. Het geëxtraheerde RNA kan worden gebruikt om intracellulaire aanpassingen en virulentiemechanismen van pathogene bacteriën met verschillende technieken van transcriptie analyse, zoals RT-PCR, RNA-Seq, microarray en andere op hybridisatie gebaseerde technieken bestuderen. L. monocytogenes is de verwekker van listeriose bij de mens, een ziekte met klinische verschijnselen die vooral op immuungecompromitteerde personen, ouderen en zwangere vrouwen 6. Het een Gram-positieve facultatief intracellulaire pathogeen dat een breed scala aan zoogdiercellen die al tientallen jaren als model gastheer-pathogeen interacties bestudeert 7 binnendringt. Bij invasie, verblijft het eerst in een vacuole of phagosome (bij fagocytische cellen), waaruit moet ontsnappen in tHij gastheercel cytosol om te repliceren. Verscheidene virulentiefactoren is aangetoond dat de ontsnapping proces, voornamelijk de porievormende hemolysine, listeriolysine O (LLO) en twee extra fosfolipasen 8 mediëren. In het cytosol gebruiken de bacteriën de gastheer actine polymerisatie machines zich voortbewegen op actine filamenten in de cel en verspreiding van cel naar cel (figuur 1). Alle belangrijke virulentiefactoren van L. monocytogenes die betrokken zijn bij de invasie, intracellulaire overleving en replicatie, worden geactiveerd door de master virulentie transcriptie regulator, PRFA. 8-10. In de afgelopen tien jaar verschillende studies uitgevoerd door ons en anderen hebben met succes toegepast methoden voor de transcriptoom analyse van intracellulaire gegroeid bacteriën in gastheercellen 2,11-15. Twee benaderingen worden gebruikt om bacteriële RNA te scheiden van gastheer-RNA dat is gebaseerd op: 1) Selectieve verrijking van bacteriële RNA en 2) RNA-isolatie door differential cellysis. De eerste benadering is gebaseerd op subtractieve hybridisatie van totaal RNA-extracten van zoogdieren RNA-moleculen (bijvoorbeeld met behulp van commercieel verkrijgbare kits) of selectieve vangen van bacteriële getranscribeerde sequenties (SCOTS) 11. De tweede benadering is gebaseerd op differentiële lysis van bacteriën en gastheercellen, waarbij de gastheercellen worden gelyseerd terwijl bacteriële cellen intact blijven. Bacteriële cellen worden vervolgens gescheiden van de gastheer cellysaat, gewoonlijk door centrifugeren, en het RNA wordt geëxtraheerd onder toepassing van standaardtechnieken. Het grootste probleem met deze benadering is dat samen met de intacte bacteriën gastheercellen kernen zijn ook geïsoleerde, waardoor het RNA preparaten zoogdier RNA bevatten nog steeds. Een manier om dit probleem te overwinnen is intacte bacteriën te scheiden van gastheercellen kernen met behulp van differentiële centrifugatie, maar dit neemt doorgaans tijd die het probleem van veranderingen in genexpressie profiel tijdens extractie. In dit artikel geven we een betere en snelle bacteria RNA-extractie protocol, dat is gebaseerd op differentiële cel lysis benadering. Eerst, L. monocytogenes geïnfecteerde macrofaag-cellen worden gelyseerd met koud water. Vervolgens worden macrofaag kernen verwijderd door een korte centrifugatie en intacte bacteriën snel verzameld op filter, waaruit RNA wordt geïsoleerd met behulp van hete fenol SDS-extractie van bacteriële nucleïnezuren.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr><tr><td>Mergelleukocyten afgeleid van C57B/6 vrouwelijke muizen</td><td></td><td></td><td>21</td></tr><tr><td>H2O, RNAse-vrij</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC-behandeld water kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hersenhartinfusie (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Fenool verzadigd pH 4.3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Iso-amylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C, 5% CO2 geforceerde lucht incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Celkrabbers</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes glazen houder voor 45 mm filters</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore filters 45&nbsp;mm, 0.45&nbsp;&micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac systeem</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm celkweekschalen</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml buisjes, RNase-vrij</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &deg;C incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &deg;C hitteblok</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C tafelcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Steriele pipetten, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falconbuisjes, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna zuivering van intracellulair grown<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; in macrofaag-cellen

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analyse van het transcriptoom van bacteriële pathogenen tijdens infectie bij zoogdieren is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genen en factoren die infectie mediëren. Het is echter een uitdagende taak om bacterieel RNA te isoleren uit geïnfecteerde cellen of weefsels, aangezien RNA van zoogdieren meestal de lysaten van geïnfecteerde cellen domineert. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor RNA-isolatie van Listeria monocytogenes bacteriën die groeien in uit beenmerg afgeleide macrofaagcellen. Bij infectie worden cellen licht gelyseerd en snel gefilterd om de meeste gastheer-eiwitten en RNA weg te gooien, terwijl intacte bacteriën worden behouden. Vervolgens wordt bacterieel RNA geïsoleerd met behulp van hete fenol-SDS-extractie gevolgd door DNase-behandeling. Het geëxtraheerde RNA is geschikt voor gentranscriptieanalyse door meerdere technieken. Deze methode wordt met succes toegepast in onze studies van Listeria monocytogenes gen-regulatie tijdens infectie van macrofaagcellen 1-4. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om andere bacteriële pathogenen en celtypen te bestuderen.

Het modelsysteem is getoond in figuur 1 en omvat macrofaag cellen geïnfecteerd met L. monocytogenes bacteriën, die repliceren in het macrofaag cytoplasma. Figuur 2 geeft het experimentele schema. Figuur 3 toont kenmerkende resultaten van deze RT-qPCR analyse van virulentiegenen tijdens WT L. monocytogenes groei van macrofagen in vergelijking met de groei in rijke laboratoriummedium BHI. De resultaten tonen de transcript...

Hier beschrijven we een methode voor bacteriële RNA-isolatie van Listeria monocytogenes bacteriën die groeien in muis-macrofagen. Deze techniek kan worden gebruikt met andere intracellulaire pathogenen en zoogdierlijke gastheercellen.

RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofaag-cellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van RNA uit bacteriën die intracellulair in macrofagen zijn gekweekt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van bacteriële pathogenese, zoals welke factoren in genen bacteriën activeren om een infectie te bemiddelen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het bacteriëel RNA aanzienlijk verrijkt, terwijl contaminatie door nucleïnezuren van de gastheer tot een minimum wordt beperkt.De procedure zal worden gedemonstreerd door Anna Pasechneck, een promovendus uit mijn laboratorium. Om cellen voor te bereiden op bacteriële infectie, gebruikt u op dag één schalen van 145 millimeter om 2 × 10⁷ beenmerg-afgeleide macrofagen, of BMDM-cellen, uit te zaaien in 30 milliliters BMDM-medium plus Pen/Strep. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator met geforceerde luchtcirculatie.Inoculeer een bacteriële cultuur van wild-type L.monocytogenes bacteriën in 10 milliliters brain heart infusion, of BHI, medium. Plaats de buizen in een schuine positie in een incubator en incubeer gedurende de nacht bij 30 °C zonder schudden. Warm de volgende dag BMDM-medium zonder ant

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor de isolatie en zuivering van...

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em&gt; Legionella</em&gt;-Geïnfecteerde Fagocyten

Source: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the pre-treatment of macrophages with Legionella pneumophila outer membrane vesicles (OMVs) to examine their effect on bacterial replication. By altering host immune signaling, OMVs make macrophages more permissive to infection. Higher colony counts in treated cells, compared to untreated ones, indicate...

Assaying Legionella pneumophila Replication in Macrophages Pretreated with Outer Membrane Vesicles

Source: Sigal, N., et al. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the isolation of internalized pathogenic bacteria from infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Bacteria are allowed to attach to host cells, and unattached bacteria are washed away. After internalization, an antibiotic is added to eliminate non-internalized bacteria. The host cells are lysed, centrifuged, and the supernatant is...

Isolation of Intracellular Pathogenic Bacteria from Infected Host Cells

Source: Sigal, N., et al. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates RNA extraction from Listeria monocytogenes isolated from infected murine macrophages. The protocol preserves RNA, lyses cells using phenol–chloroform and heat, and separates RNA by centrifugation. Salt and ethanol, combined with cold incubation, promote RNA precipitation. The resulting RNA captures host-induced gene expression, revealing...

RNA Extraction from Listeria monocytogenes Harvested from Infected Murine Macrophages

In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Dit document beschrijft een nieuwe werkwijze voor orale infectie van muizen...

Mondelinge transmissie van<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Muizen via inname van besmet voedsel

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Leer RNA-zuivering van intracellulair gegroeide Listeria monocytogenes in macrofaagcellen. Deze methode verrijkt bacteriëel RNA en minimaliseert contaminatie met gastheernucleïnezuren voor transcriptoomanalyse.

RNA Zuivering van Intracellulair Grown

Meer video's verkennen