Name: Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer de gel-geassisteerde rehydratatiemethode voor het vormen van reuzen-polymeervesicles met gecontroleerde grootteverdeling. Deze techniek produceert honderden intacte vesicles sneller dan traditionele methoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez en Dr. Walter F. Paxton dankbaar erkennen voor hun technische expertise, advies en hulp bij dit werk. Dit werk werd ondersteund door het U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS en GDB werden ondersteund door BES-MSE. Dit werk werd, gedeeltelijk, uitgevoerd bij het Center for Integrated Nanotechnologies, een Office of Science User Facility geëxploiteerd voor het U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user projectnummer RA2015A0004, PI: ACG).

1. polymeren en Agarose Voorbereiding Opmerking: handschoenen en een laboratoriumjas moeten worden gedragen ten alle tijden in dit protocol. Veiligheidsbril worden eveneens tijdens het werk met elk organisch oplosmiddel of een stadium met mogelijke spatten vereist. <ol><li> Bereid een 5 mg / ml oplossing van het polymeer in chloroform. Voeg 1 ml chloroform tot 5 mg vast poly (ethyleenoxide) - b- poly (butadieen) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) diblokcopolymeer in een glazen flesje en zwenk om volledig oplossen. Voer alle stappen met behulp van chloroform in een chemische dampkap. </li><li> Meng een fluorescent gelabelde lipiden (al aangeschaft in chloroform opgelost) en een 0,5 mol% eindconcentratie in 99,5 mol% unlabeled polymeer. <ol><li> Bijvoorbeeld pipet ~ 12 ul van een 1 mg / ml fluorescerend gemerkte lipiden in chloroform in 997,58 ui PEO-PBD, EO 22 -bd 37 polymeer in chloroform (met een molecuulgewicht van 2950 Dalton) voor een uiteindelijke concentratie van 0.5 mol% gelabelde lipiden gemengd en 99,5 mol% polymeer. </li><li> Winkeloplossing in een luchtdichte flacon met chloroform- resistente deksel bij -20 ° C. Wikkel loodgieters tape op flacon rand waar het deksel schroeven op het flesje en zet het deksel op de flacon. Wikkel ander stuk loodgieters tape aan de buitenzijde van het deksel en tenslotte Parafilm wikkel aan de buitenzijde van de band minimale verdamping zorgen. </li></ol></li><li> Maak een 1% w / v agarose oplossing door het mengen van 0,5 mg standaard agarose in 50 ml water (of 50 ml 100 mM sucrose) in een 250 ml Erlenmeyer kolf. Kook de agarose oplossing in een standaard magnetron gedurende ~ 1 min (of totdat het volledig is opgelost Zoals de vereffening van de oplossing). Opmerking: De agarose oplossing kan worden gebruikt na enkele minuten koelen of te stollen, opgeslagen en opnieuw gesmolten volgens dezelfde procedure. </li></ol> 2. Agarose Filmvoorbereiding <ol><li> Snijd het einde weg van een 1000 ui pipet tip om verstoppingen te voorkomen. Met behulp van de cut tip, pipet 300 ul van gesmolten agarose oplossing op een 25 mm vierkante glazen dekglaasje rechtstreeks van de fabrikant. </li><li> Laat de agarose afkoelen tot ~ 65-75 ° C vóór depositie. Als de agarose te koelen, zal het beginnen klonteren op het oppervlak tijdens het verspreiden proces. Omgekeerd, als de agarose te warm is, zal meer nodig verspreiding naar de agarose aan het oppervlak hechten. </li><li> Houd alleen de rand van het dekglaasje met handschoenen aan en gebruik de lange zijde van een 1000 pi pipetpunt de agarose gelijkmatig over het oppervlak van het dekglaasje verspreid. Verplaats de pipetpunt heen en weer over het dekglaasje totdat de agarose volledig voldoet aan en dekt het dekglaasje. </li><li> Plaats de met agarose gecoate dekglaasje op een stuk Parafilm de agarose naar boven. Zodra het gewenste aantal dekglaasjes bekleed, plaatst de Parafilm de dekglaasjes in een 37 ° C incubator om de agarose drogen op het oppervlak ten minste 1 uur. Opmerking: Uitdrogingwordt bepaald door het verdwijnen van de zichtbare laag van agarose; het dekglaasje moet kijken plat en duidelijk. Zodra de films volledig gedehydrateerd, opslag dekglaasjes met agarose boven gericht in een wegwerpbare plastic petrischaal. </li></ol> 3. Polymer Film Formation <ol><li> Pipetteer 30 ul bereide polymeeroplossing op de agarose film. </li><li> Houd alleen de rand van het dekglaasje met handschoenen aan en gebruik de lange zijde van een 18 G naald om de oplossing in de agarose films met een draaiende beweging verspreiden verspreiden. Verder verspreiden tot de oplossing ingedampt. Let op: Wees voorzichtig met het scherpe uiteinde van de naald. </li><li> Plaats de polymeerfilms in een plastic petrischaal polymeer naar boven en zet de petrischaal in een standaardhuis vacuümexsiccator bedekt met aluminiumfolie (tot fotobleken van de gelabelde lipiden voorkomen) gedurende ten minste 1 uur om eventueel achtergebleven oplosmiddel volledig te verwijderen. </li></ol> 4. Vorming van Polymersomes <ol><li> Hechten een coverwell, ofwel een zelfgemaakte polydimethylsiloxaan (PDMS) en (een ~ 0,5 cm dik blok genezen PDMS met ~ 1 cm diameter van de middelste geslagen out) of een in de handel ook beschikbaar voor het dekglaasje bekleed met de polymeerfilm. Druk op de coverwell voorzichtig op de met polymeer beklede dekglaasje met het polymeer naar boven totdat een goede afdichting wordt gevormd tussen de coverwell en het dekglaasje. Wees voorzichtig niet te hard te drukken en breek het dekglaasje. </li><li> Voeg 200-500 ul rehydratatieoplossing (water is goed, maar een reeks buffers of media werkt ook) naar de kamer (rehydratie volume afhankelijk van de grootte van de coverwell gehecht). </li><li> Een bevochtigingskamer om verdamping van de rehydratatie oplossing verminderen. Plaats een opgerolde, natte Kimwipe langs de randen van een glazen petrischaal. Plaats de polymeerfilm met de gehechte coverwell in de vochtige kamer en dek af met een deksel. Dek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleken te minimaliseren. Plaatsde petrischaal op een hete plaat die op 40 ° C gedurende ten minste 30 min. </li><li> Regel de temperatuur van de verwarmingsplaat tijdens rehydratatie 24-70 ° C afstemmen van de grootte van de vesicles (figuur 5). 70 ° C ligt in de buurt van de T m van de agar dus voorzichtigheid is geboden bij het ​​verder gaat dan deze temperatuur. </li></ol> 5. Karakterisering van polymeervesicles door Fluorescence Recovery na Photobleaching (FRAP) <ol><li> Beweeg het dekglaasje met de gehechte coverwell direct op een omgekeerde microscoop voor beeldvorming. </li><li> Kies de juiste filter set op basis van de fluorescerende lipide opgenomen in de polymeeroplossing. Voor Rhodamine-gelabelde lipiden gedoteerd in de polymeeroplossingen, gebruik dan een 560/25 nm excitatie filter en een 607/36 nm emissie filter, of vergelijkbare filter sets. </li><li> Gebruik een 100x olie doelstelling bijzondere aandacht op het bovenoppervlak van het dekglaasje waar de polymeervesicles worden nageleefd. Als de polymeervesicles bijzondergrote (&gt; 20 urn) of als de polymeerfilm te dik is, zou een lager vermogen doel (bijvoorbeeld 40X) worden gebruikt om beter zichtbaar polymeersomen. </li><li> Identificeer de polymeervesicles met behulp van fluorescentie microscopie. Identificeer polymeervesicles door de karakteristieke holle, bolvormige vesikels met een diameter&gt; 5 urn. </li><li> Karakteriseren membraan vloeibaarheid met behulp van fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) op een fluorescentiemicroscoop met een verstelbare condensor. Als gevolg van de hechtende aard en de strakke verpakking van polymeervesicles op de substraten, wordt de natuurlijke beweging van de polymeervesicles beperkt, het verhogen van FRAP beeldkwaliteit. <ol><li> Focus de microscoop op de polymeersomen van belang. Sluit de condensator een kleine regio en zorgen dat de rand van een polymeersomen binnen het beeldgebied van belang. </li><li> Verhoog de belichting camera en zorgen dat alle neutrale dichtheid filters worden verwijderd om de regio van belang effectief photobleach. Laat de folie fl<html> fluorescentie intensiteit photobleach 30-60 seconden of totdat de fluorescentie-intensiteit aanzienlijk verminderd. </li><li> Schakel de lamp en de condensor volledig open. Verlaag de blootstelling terug naar de startpositie instellingen en beginnen direct vastleggen van beelden om de 30 seconden voor 3 min. </li><li> Bereken membraan diffusie coëfficiënten middels standaardwerkwijzen 12. Als het gebleekte gebied herwint fluorescentie-intensiteit in de 3-5 min, dit betekent dat het membraan fluïdum. </li></ol></li></ol> 6. Karakterisering van polymeersomen Size <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figuur 6. Werkwijze voor de grootte analyse van polymeervesicles gebruik van beeldbewerkingssoftware. Stap-voor-stap instructies over hoe de diameter van de blaasjes gevormd meten. De gebruiker moet de kalibratie-eenheden in pixels / um van de microscoop gebruikt kennen.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol><li> Open de verkregen beelden van polymeervesicles in beeldanalyse software 13. </li><li> Zet de schaal voor de afbeelding door te klikken op de doos analyseren drop-down en het klikken op &quot;SET scale&quot;. <ol><li> Kalibreer de schaal voor de microscoop met behulp van standaard methoden (dwz een micrometer). </li><li> Vul het kalibratie-eenheden in en klik op &quot;ok&quot;. </li></ol></li><li> Klik op de lijn gereedschapskist en trek een lijn verspreid over de diameter van een blaasje. </li><li> Verzamel de lengte metingen door te klikken op de doos analyseren drop-down en te klikken op &quot;maatregel&quot;. </li><li> Blijven meten individuele vesicles volgens de bovenstaande procedure en elke nieuwe meting wordt toegevoegd aan het venster meetgegevens. </li><li> Druk op &#39;Ctrl + D &quot;na het trekken elke lijn en het meten van de lengte van de lijn op de afdrukimage waardoor het makkelijker om bij te houden welke blaasjes zijn geanalyseerd. </li></ol>

<ol><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+reconstituted+in+GUVs%3A+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li>
<li>Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Assembly+of+Polymer+Nanotube+Networks+via+Kinesin+Powered+Microtubule+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments.</a> Nanoscale. , (2015).</li>
<li>Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+dependence+of+polymersome+membrane+structure%2C+elasticity%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability.</a> Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).</li>
<li>Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+polymersome+surfaces%3A+functionalization+with+dendritic+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups.</a> Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).</li>
<li>Egli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+functionalization+of+polymersome+surfaces%3A+A+new+approach+to+surface+immobilization+and+cell+targeting+using+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).</li>
<li>Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymersome+nanoreactor+with+controllable+permeability+induced+by+stimuli-responsive+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers.</a> Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxide+ion+flux+and+pH-gradient+driven+ester+hydrolysis+in+polymer+vesicle+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors.</a> Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).</li>
<li>Henderson, I. M., Paxton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt%2C+shake%2C+fuse+-+Giant+hybrid+polymer%2Flipid+vesicles+through+mechanically+activated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).</li>
<li>Discher, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+Tough+Vesicles+Made+from+Diblock+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers.</a> Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).</li>
<li>Howse, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+formation+of+giant+polymer+vesicles+with+controlled+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions.</a> Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).</li>
<li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength+Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength.</a> J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Sandia National Laboratories is een laboratorium met meerdere programma's dat wordt beheerd en geëxploiteerd door Sandia Corporation, een volledige dochteronderneming van Lockheed Martin Corporation, voor de National Nuclear Security Administration van het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract DE-AC04-94AL85000.

Polymeervesicles worden steeds op grote schaal onderzocht als biologisch membraan nabootst. De robuuste en veelzijdige eigenschappen van polymeren maken ze veel aantrekkelijker voor studies die membraan functionalisering, lange levensduur en afgestemd responsiviteit. Traditionele methoden voor het vormen van giant-sized polymeervesicles 9,10 (&gt; 4 micrometer) zijn arbeidsintensief en vereisen dure en gespecialiseerde apparatuur. Hier presenteren we voor de eerste keer, een snelle, veelzijdige en robuuste werkwijze voor het vormen gigantische polymeervesicles toepassing van standaard laboratorium- goedkope reagentia en apparatuur. Middels gel-geassisteerde rehydratie, kunnen unilamellaire polymeervesicles snel worden gevormd (&lt;30 min), in diverse rehydratatie oplossingen (waaronder celcultuur media) en met een verscheidenheid van verschillende polymeren (gegevens niet getoond). De vorming van multilamellaire vesicles of asymmetrische werd niet waargenomen met deze techniek. In dit werk, gebruikten we poly (ethyleenoxide) - b- poly (butadieen) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) neutraal diblokcopolymeer. Veel verschillende polymeersamenstellingen (inclusief gebracht diblokcopolymeren) werken goed met deze methode (niet getoond). Echter, sommige in de handel verkrijgbare triblokcopolymeren en hoger gewicht diblokcopolymeren moleculaire (~&gt; 5000 Dalton) vormen geen aparte polymeervesicles. Voor alle experimenten in dit handschrift, een lage concentratie van gelabeld lipide werd gedoteerd in de polymeeroplossingen alleen voor visualisatie. Andere visualiseringtechnieken, waaronder polymeren direct gefunctionaliseerd met een fluorescerende kleurstof kan ook worden gebruikt. Polymeervesicles kan eveneens worden afgebeeld met heldere veld microscopie, hoewel fluorescentiemicroscopie zorgt voor een betere resolutie. De meeste kleine wijzigingen aan het protocol meestal geen resultaten veranderen. Zo hebben kleine verschillen in de concentratie van de polymeeroplossing verspreid op de dekglaasjes niet de vorming van het polymeer f veranderenilm gevormd. Terwijl de volledige concentratietraject niet werd bepaald, zal polymeersomen vorming succesvol optreden bij een groot aantal polymeerfilm concentraties (bijvoorbeeld 1-10 mg / ml). Echter, er zijn een aantal protocol wijzigingen die een negatieve invloed hebben op polymeersomen formatie. De meest opvallende is dat de ronde glazen dekglaasjes (in plaats van vierkante) resulteren in zeer slechte vorming van polymeervesicles. We schrijven dit toe aan de extreem gelijkmatige laag van agarose op het glas die in feite de vorming van polymeervesicles belemmert. Een van de meest opmerkelijke uitdagingen van deze techniek is de mogelijkheid om de polymeervesicles van het oppervlak herstellen met een hoge opbrengst. Er zijn bepaalde gevallen waar het verwijderen van de polymeervesicles van het oorspronkelijke oppervlak kan voordelig zijn. Door de hoge achtergrondfluorescentie van de gedroogde polymeerfilm verwijderen individuele polymeervesicles en hechten ze dekglaasjes reinigen zal beeldkwaliteit en karakterisatie verhogen (particularly tijdens FRAP analyse). Om dit, zachte pipetteren met een pipet tip waarin het uiteinde is afgesneden zal de polymeervesicles desorberen van het oppervlak (hoewel het aantal blaasjes hersteld is aanzienlijk lager dan de oorspronkelijk gevormd). Polymeervesicles kan vervolgens dekglaasje gemodificeerde oppervlakken worden geplaatst, zodat de polymeersomen om met de nieuwe dekglaasje. Kenmerkend voor neutrale PEO-PBD polymeervesicles, dekglaasjes met ozon behandeld gedurende 15 min kan de polymeervesicles te vallen naar de oppervlakte voor beeldvorming. Verschillende oppervlaktemodificatie is vereist voor verschillende polymeersomen samenstellingen (bijvoorbeeld negatief of positief geladen polymeren). De meeste materialen gebruikt in dit protocol zijn met succes opgeslagen en gebruikt voor de dagen tot weken. De gestolde agarose kunnen keer worden gekookt en opnieuw totdat de agarose begint aggregaten zelfs na het koken of het gestolde agarose begint te drogen. Coverslips met droge agarose films kunnen worden opgeslagen en gebruiktoneindig d (bijvoorbeeld maanden). Het polymeer werd opgelost in chloroform kan enkele maanden worden bewaard bij -20 ° C. Zodra de polymeerfilm wordt gedroogd op agarose films moeten echter de films onder huisvacuüm worden bewaard en binnen twee weken (langere termijn opslag werd niet rechtstreeks bepaald maar zijn er opmerkelijke verschillen in polymeervesicles gevormd uit polymere films ouder dan twee weken). Met behulp van de gel bijgestaan ​​rehydratatie protocol hier wordt gepresenteerd, zijn honderden uniform-vormige polymeervesicles snel gevormd met slechts een paar uur van de arbeid met behulp van standaard uitrusting en goedkope laboratorium reagentia. Bovendien kan polymeervesicles worden gevormd in een verscheidenheid van fysiologische bufferoplossingen en uit verschillende polymeersamenstellingen (niet getoond). Kleine wijzigingen in de werkwijze geen negatieve de vorming van polymeersomen veranderen, waardoor gel ondersteunde rehydratatie een veelzijdige en toegankelijke techniek wetenschappers uiteenlopende technische eXPERTISE. De mogelijkheid om gigantische polymeervesicles gemakkelijk van de grootte schaal van de cellen is essentieel voor het bouwen van kunstmatige cel-achtige systemen. Het gebruiksgemak en de veelzijdigheid van-gel bijgestaan ​​rehydratatie om deze polymeervesicles maken biedt een enorme vooruitgang in de biomimetic veld voor het creëren van robuuste celmembraan nabootst. Bijvoorbeeld met behulp van deze techniek strategieën voor inkapseling van verschillende intracellulaire componenten, functionalisering van het polymeer met cel membraaneiwitten en integratie van membraan transporteiwitten, om maar een paar te noemen, kan worden ontworpen om polymeersomen-gebaseerde kunstmatige cellen bouwen.

Oprichting van synthetische cel-en kleinbedrijf, grote unilamellaire blaasjes (GUVs) is van toenemend belang in de in vitro reconstructie van verschillende cellulaire processen om een kader voor de vorming van een kunstmatige cel-achtig systeem 1,2 bouwen. Terwijl GUVs samengesteld van lipide membranen zijn uitstekend nabootst van natuurlijke, biologische membranen, ze instabiel zijn tegen milieu-fluctuaties en hebben een vrij korte houdbaarheid. Door deze beperkingen zijn amfifiele blokcopolymeren toegepast als lipiden nabootst polymeer blaasjes of polymeervesicles vormen. In dit verband polymeervesicles voordelig bij de ontwikkeling van biomimetische celsystemen gezien hun hogere stabiliteit 3, chemische veelzijdigheid 4,5 en aanpasbaar fysieke eigenschappen 6-8. De huidige methoden voor het vormen van giant-sized polymeervesicles omvatten electroformation 9 en templated rehydratatie 10, beide which zijn tijdrovend, arbeidsintensief, vereisen gespecialiseerde apparatuur en produceren van lage opbrengsten van intacte reus polymeervesicles. Een eenvoudige gel-ondersteunde rehydratie methode werd recent ontwikkeld voor de productie van lipide GUVs 11. Hier beschrijven we een aanpassing van de gel-geassisteerde rehydratatie techniek om grote polymeervesicles met verschillende polymeersamenstellingen gecontroleerde grootte en buffer in verschillende composities. Kort samengevat, 1% w / v van standaard DNA agarose gelelektroforese films ontwaterd op een glazen dekglaasje. Polymeeroplossingen bereid in chloroform worden vervolgens verspreid over het uitgedroogd agarose film en verdampen. Na volledige verwijdering oplosmiddel worden polymeerfilms gerehydrateerd in de buffer naar keuze met een lichte verwarming (40-70 ° C) en grote (&gt; 4 pm) formaat polymeervesicles worden gevormd binnen 30 minuten. Deze methode snel produceert honderden volledig intact, goed gevormde polymeervesicles met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en Reagents tegen minimale kosten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische afbeelding van de gel-ondersteunde rehydratatie methode. Giant polymeervesicles uit een diblokcopolymeer gevormd na ~ 30 min rehydratatie. De hydrofiele blok wordt aangeduid in magenta en het hydrofobe blok wordt aangeduid in het groen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>125 ml Erlenmeyer kolf</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge naald</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>25 mm vierkante dekglasjes</td><td>VWR</td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Een standaard agarose voor DNA-gelelektroforese</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306-2L</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële dekglasjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70336</td><td>Press-to-Seal Silicone Isolators</td></tr><tr><td>Fiji Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Gratis downloaden: http://fiji.sc/Fiji&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Glazen flesje met Teflon deksel</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>1,9 ml capaciteit, verpakking van 144</td></tr><tr><td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>1 mg lipide bij een concentratie van 1 mg/ml in chloroform</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10,2 cm x 38,1 m</td></tr><tr><td>poly(ethyleenoxide)-b-poly(butadieen) of PEO-PBD (met een molecuulgewicht van 2.940)</td><td>Polymer Source</td><td>P2904-BdEO</td><td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td></tr><tr><td>Plastische petrischaal</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Teflon tape</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2" breedte</td></tr></tbody></table>

het vormen van giant-sized polymeervesicles met behulp van gel-geassisteerde rehydratatie

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Polymeervesikels, of polymersomes, worden veel onderzocht als synthetische analogen van lipidevesikels vanwege hun stabiliteit, robuustheid, barrière-eigenschappen, chemische veelzijdigheid en instelbare fysische kenmerken. De typische methoden die worden gebruikt om gigantische (> 4 µm) vesikels te bereiden, zijn echter zowel tijd- als arbeidsintensief en leveren een laag aantal intacte polymersomes op. Hier presenteren we voor het eerst het gebruik van gel-ondersteunde rehydratie voor de snelle en hoog-opbrengstvorming van gigantische (>4 µm) polymeervesikels (polymersomes). Met deze methode kunnen polymersomes worden gevormd uit een breed scala aan rehydratie-oplossingen, waaronder verschillende fysiologisch-compatibele buffers en volledige celkweekmedia, waardoor ze direct bruikbaar zijn voor biomimicry-studies. Deze techniek is ook in staat om op betrouwbare wijze polymersomes te produceren uit verschillende polymeersamenstellingen met veel betere opbrengsten en veel minder moeilijkheden dan traditionele methoden. De grootte van polymersomes is eenvoudig instelbaar door de temperatuur tijdens rehydratie te wijzigen of membraanvervloeimiddelen toe te voegen aan het polymeermembraan, waardoor gigantische polymersomes (>100 µm) worden gegenereerd.

Polymeervesicles werden gevormd onder toepassing van de bovenstaande procedure (figuur 1) en de gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur figuur 2 geschetst. Polymeervesicles werden gerehydrateerd met gedeïoniseerd water (Figuur 3) en afgebeeld op een omgekeerde microscoop in epifluorescentie met een 100x olie doelstelling. Merk op dat als polymeervesicles niet zichtbaar, zij zouden hebben op maten te groot te vangen met een 100x olie doelstelling gevormd; een lager vermogen doelstelling moet mogelijk worden gebruikt. Een van de voordelen van gel-ondersteunde rehydratatie is de veelzijdigheid van het vormen polymeersomen in verschillende rehydratatie oplossingen. Polymeervesicles succesvol gevormd in gedeïoniseerd water, een volledige zoogdiercel kweekmedium sucrose oplossingen en twee fysiologisch relevante bufferoplossingen (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)), zie figuur 4. Onder standaardomstandigheden (rehydratiemet water bij 40 ° C gedurende 1 uur), zijn meer dan ~ 70 polymeervesicles typisch zijn per 40 x 40 urn 2 gezichtsveld. Terwijl het oppervlak productie van polymeervesicles niet homogeen is, zijn er tientallen velden van mening met deze representatieve opbrengst. Bovendien polymeervesicles waren stabiel in oplossing gedurende tenminste 24 uur. Polymeervesicles grootte werd gemakkelijk afgestemd door hydrateren polymeer films bij verschillende temperaturen. Polymeervesicles gevormd in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur had een gemiddelde diameter van 2,9 ± 0,7 pm. Naarmate de temperatuur stijgt tijdens rehydratatie, de gemiddelde grootte van de polymeervesicles verhoogt (Tabel 1). Bij hoge temperaturen (&gt; 60 ° C), polymeervesicles gevormd met afmetingen nog groter dan 100 um (figuur 5). Alle beeldverwerking werd voltooid met behulp van open-source imaging software (Figuur 6).Verzamelde beelden werden geopend in het softwareprogramma. De geijkte pixelgrootte is in te stellen schaal wordt ingevoerd. Met behulp van de line tool, werden lijnen getrokken over de diameters. Na elke afzonderlijke lijn werd getrokken, werd het geijkt lengte gemeten en toegevoegd aan de doos resultaten. Gegevens kunnen vervolgens worden uitgezet in de wiskundige software naar keuze (bijvoorbeeld Excel, Prism, Oorsprong, etc.) <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figuur 2. Foto conventionele en goedkope nodig voor de vorming van polymeersomen De benodigde items labo materialen zijn: Parafilm, een 18,5 G naald polymeer in chloroform of andere geschikt oplosmiddel, een 1000 pi pipetpunt, een Erlenmeyer pincet, agarose, 25 mm vierkant dekglaasjes, PDMS imaging waterputten en een glazen petrischaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">klik hier om</a>bekijk een grotere versie van dit cijfer. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figuur 3. Foto&#39;s van de gel bijgestaan ​​rehydratatie methode. Agarose Opgelost is verspreid over een 25 mm vierkante dekglaasje totdat een gelijkmatige film lagen de hele dekglaasje. Coverslips worden vervolgens in een 37 ° C incubator te zetten en film is uitgedroogd. Een polymeeroplossing wordt afgezet op het uitgedroogd agarose film en verspreiden met behulp van een naald in een cirkelvormige beweging. Het dekglaasje wordt dan plaats in een exsiccator O / N om volledig elk oplosmiddel resten verdampen. Tot slot, en imaging kamer is gehecht aan het substraat en polymeren worden gehydrateerd met een oplossing van de keuze en geplaatst in een petrischaal bij 40 ° C gedurende ten minste 25 min te staan ​​voor de vorming van polymeervesicles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.</a> </p<html> &gt; <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figuur 4. polymeervesicles kan vormen in verschillende buffers. PEO-PBD polymeerfilms werden gedurende 1 uur gerehydrateerd met het aangegeven buffer bij 40 ° C. Schaal bar = 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Figuur 5. Het verhogen van de temperatuur tijdens rehydratatie neemt de grootte van de polymeervesicles. Representatieve epifluorescentie beelden van polymeersomen gevormd in water bij de aangegeven temperaturen rehydratatie. Het verhogen van de temperatuur leidt tot grotere polymeervesicles. Schaal bar = 10 micrometer._blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatuur (° C) </td><td> Gemiddelde grootte (pm) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5.76 ± 2.5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6.65 ± 2.4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11.46 ± 5.8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Het verhogen van de temperatuur tijdens rehydratatie resulteert in een verhoogde polymeersomen omvang. Gemiddeld diameters voor meer dan 100 polymeervesicles in water per andere temperatuur conditie werden berekend en worden hier afgebeeld. Fout is standaarddeviatie.

We presenteren een protocol om snel gigantische polymeervesikels (pGVs) te vormen. In het kort, polymeeroplossingen worden gedehydrateerd op gedroogde agarose-films die op dekglasjes zijn bevestigd. Rehydratie van de polymeerfilms resulteert in een snelle vorming van pGVs. Deze methode brengt de bereiding van synthetische gigantische vesikels voor directe toepassingen in biomimetische studies een grote stap vooruit.

Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

Het algemene doel van deze gel-ondersteunde rehydratatiemethode is om robuust intacte unilamellaire gigantische polymeervesikels te vormen, waarbij de grootteverdeling van de vesikels eenvoudig kan worden gecontroleerd. Deze methode biedt een robuust alternatief voor de vorming van polymeervesikels, die gebruikt kunnen worden om de fysische eigenschappen van het membraan te onderzoeken en deze vesikels vervolgens te integreren in bioengineering-toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om snel honderden intacte gigantische polymeervesikels te produceren, op een veel minder arbeidsintensieve manier dan met traditionele technieken.Het idee hiervoor ontstond toen we kennismaakten met de gel-geassisteerde rehydratietechniek voor het vormen van gigantische lipide-vesikels. Onze huidige methoden voor het vormen van gigantische polymersomen zijn echter uitdagend en leveren vaak een lage opbrengst op, dus we hebben besloten deze methodologie als alternatieve benadering te gebruiken. Begin de bereiding van de polymeeroplossing door vijf milligram PEO-PBD diblock copolymeer in één milliliter chloroform in een glazen vial te zwenken tot het volledig is opgelost.Voeg een oplossing van polymeer in chloroform van 5 mg/mL en een oplossing van fluorescent gelabelde lipiden in chloroform van 1 mg/mL toe aan een nieuw vial tot een uiteindelijke concentratie van 99,5 mol% polymeer en 0,5% lipiden is bereikt. Om verdamping te minimaliseren, wordt de polymeeroplossing overgebracht naar een luchtdicht vial met een chloroformbestendige dop en bewaard bij 20 °C voor later gebruik. Om te beginnen met de bereiding van de agarosefilm, voegt u 50 mL water en 0,5 g standaard agarose toe aan een Erlenmeyerflask van 250 mL.Kook gedurende één minuut in een magnetron. Koel de agarose-oplossing vervolgens af tot tussen 65 en 75 graden Celsius om slechte hechting of klontering te voorkomen. Snijd daarna het uiteinde van een 1000 microliter pipetteertip af en gebruik deze om 300 microliters van de agarose-oplossing op een vierkant glazen dekglas van 25 milliliter te pipetteren.Houd, terwijl u handschoenen draagt, de rand van het dekglas vast en verspreid de agarose gelijkmatig over het gehele oppervlak met de lange zijde van een andere pipetteertip van 1000 µL. Plaats het dekglas met de agarosezijde naar boven op parafilm en incubeer dit gedurende ten minste één uur bij 37 °C. Ga vervolgens verder door 30 µL van de eerder bereide polymeeroplossing op het met agarose gefilmde dekglas te pipetteren.Houd de rand van het dekglas vast met handschoenen aan en verspreid de polymeeroplossing in een cirkelvormige beweging over de agarosefilm met de lange zijde van een naald met een diameter van 18 gauge. Sluit af door het dekglas met de polymeerzijde naar boven in een plastic petrischaal in een vacuümexsiccator te plaatsen. Trek de exsiccator gedurende ten minste één uur vacuüm om eventuele resterende oplosmiddelen te verwijderen.Om polymersomen te vormen, wordt eerst een dekglasplaatje aan de polymeerzijde van het gecoate dekglasplaatje bevestigd door zachtjes te drukken tot er een nauwe afsluiting is gevormd. Voeg vervolgens 200 tot 500 microliters rehydratie-oplossing toe aan de kamer. Plaats daarna een nat, opgerold laboratoriumdoekje langs de binnenrand van een glazen petrischaal om een bevochtigingskamer te creëren.Plaats het dekglas met de vastgeplakte dekput in de schaal en sluit deze af met een deksel. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleken te minimaliseren en plaats deze vervolgens op een warmteplaat bij 40 °C gedurende ten minste 30 minuten om de vorming van de polymersomen te voltooien. Om het FRAP-beeldvormingsproces te starten, plaatst u het dekglas met de vastgeplakte dekput op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een instelbare condensor.Select vervolgens een filterset op basis van het gebruikte fluorescente lipide en beeld de polymersomen op het bovenvlak van het dekglas met een 100X olie-objectief. Om de membraanvloeibaarheid via FRAP te karakteriseren, wordt eerst een polymersoom in focus gebracht, waarna de condensor van de microscoop wordt gesloten tot een kleine opening en wordt gecontroleerd of de randen van het polymersoom binnen het beeldveld liggen. Verhoog vervolgens de belichtingstijd van de camera, verwijder alle neutrale dichtheidsfilters en laat het interessegebied 30 tot 60 seconden fotovlitsen.Schakel tot slot de lamp uit en open de condensator volledig. Zet de belichting terug naar de begininstellingen en leg gedurende drie minuten elke 30 seconden beelden vast. Open de software voor beeldanalyse op de computer van de microscoop en laad de verkregen beelden van de polymersomen.Stel de schaal voor de meting in door het vervolgkeuzemenu Analyze te openen en de optie Set Scale te selecteren. Voer de juiste kalibratie-eenheden in voor afstand in pixels, de bekende afstand en de lengte-eenheid, en selecteer vervolgens oké. Gebruik daarna de lijn-toolbox en trek een lijn over de diameter van een geselecteerd polymersoom.Meet de diameter van het polymersoom door het vervolgkeuzemenu Analyze te openen en Measure te selecteren. Om de analyse te vergemakkelijken, gebruikt u Ctrl+D om de meetlijn op de afbeelding af te drukken voordat u naar het volgende polymersoom gaat. Ga door met het meten van polymersomen volgens de bovenstaande procedure en voeg elke meting toe aan het gegevensvenster totdat dit voltooid is.Sla tenslotte de gegevens op door op Bestand en Opslaan als te klikken. Klik op Opslaan in het venster dat opent en open vervolgens het resultatenbestand als spreadsheet om de gegevens te analyseren. Polymersomen gevormd uit PEO-PBD-polymeerfilms, gerehydrateerd met verschillende buffers, werden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie. De beelden tonen aan dat de polymersomen onder de verschillende rehydratiecondities niet homogeen zijn in grootte, met een diameter die doorgaans onder de 10 micrometers ligt.Epifluorescentiebeelden van polymersomen gevormd in water bij verschillende temperaturen laten zien dat er grotere polymersomen worden gevormd naarmate de rehydratatietemperatuur stijgt. De gemiddelde diameters voor meer dan 100 polymersomen gevormd in water bij verschillende rehydratatietemperaturen zijn berekend. Bij 24 °C was de gemiddelde diameter 2,93 µm, wat toenam tot 14,04 µm bij 70 °C.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de polymersomen te allen tijde in oplossing te houden. Zorg ervoor dat de afdekkap stevig aan het dekglas is bevestigd om lekkage van de rehydratie-oplossing en uitdroging van de polymersomen te voorkomen.Na het volgen van deze procedure kunnen methoden zoals elektronenmicroscopie worden gebruikt om aanvullende structurele eigenschappen van de polymersomen te begrijpen. Deze techniek plaveit de weg voor onderzoek in de synthetische biologie en bioengineering om polymersomen te verkennen als een robuust, chemisch aanpasbaar alternatief voor lipidemembranen voor onderzoek en abiotisch-biotische interfaces, onderzoek naar geneesmiddelentoediening en protocelsystemen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u robuust giant polymersomes kunt vormen met behulp van gel-geassisteerde rehydratie, hoe u de totale grootte van de vesicles kunt afstemmen en hoe u hun membraanintegriteit kunt karakteriseren.Houd er rekening mee dat het werken met chloroform of de agarose en naalden gevaarlijk kan zijn. Wees uiterst voorzichtig tijdens het uitvoeren van deze procedures. Neem voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, en draag te allen tijde een veiligheidsbril en handschoenen.

forming-giant-sized-polymersomes-using-gel-assisted-rehydration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren de synthese van een split-inteïne gemedieerde proteïne hydrogel. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten copolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Menging van de twee copolymeren eiwit activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid die zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer pH-en temperatuur-stabiele compatibel met organische oplosmiddelen...

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Reusachtige blaasjes die micrometergrote componenten bevatten, zijn nuttige celmodellen. De centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsie is een eenvoudige, krachtige tool voor de bereiding van reusachtige blaasjes met ingekapselde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.

Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

Polymersomen zijn zelfgeassembleerde polymere blaasjes die worden gevormd in bolvormige vormen om Gibb's Free Energy te minimaliseren. In het geval van medicijnafgifte zijn meer langwerpige structuren gunstig. Dit protocol stelt methoden vast om meer staafachtige polymersomen te maken, met langwerpige beeldverhoudingen, waarbij zout wordt gebruikt om osmotische druk te induceren en interne blaasvolumes te verminderen.

Modulerende vorm van polymersomen op polyesterbasis met osmotische druk

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Leer de gel-geassisteerde rehydratatiemethode voor het vormen van reuzen-polymeervesicles met gecontroleerde grootteverdeling. Deze techniek produceert honderden intacte vesicles sneller dan traditionele methoden.

Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Meer video's verkennen