Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Het algemene doel van deze gel-ondersteunde rehydratatiemethode is om robuust intacte unilamellaire gigantische polymeervesikels te vormen, waarbij de grootteverdeling van de vesikels eenvoudig kan worden gecontroleerd. Deze methode biedt een robuust alternatief voor de vorming van polymeervesikels, die gebruikt kunnen worden om de fysische eigenschappen van het membraan te onderzoeken en deze vesikels vervolgens te integreren in bioengineering-toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om snel honderden intacte gigantische polymeervesikels te produceren, op een veel minder arbeidsintensieve manier dan met traditionele technieken.

Het idee hiervoor ontstond toen we kennismaakten met de gel-geassisteerde rehydratietechniek voor het vormen van gigantische lipide-vesikels. Onze huidige methoden voor het vormen van gigantische polymersomen zijn echter uitdagend en leveren vaak een lage opbrengst op, dus we hebben besloten deze methodologie als alternatieve benadering te gebruiken. Begin de bereiding van de polymeeroplossing door vijf milligram PEO-PBD diblock copolymeer in één milliliter chloroform in een glazen vial te zwenken tot het volledig is opgelost.

Voeg een oplossing van polymeer in chloroform van 5 mg/mL en een oplossing van fluorescent gelabelde lipiden in chloroform van 1 mg/mL toe aan een nieuw vial tot een uiteindelijke concentratie van 99,5 mol% polymeer en 0,5% lipiden is bereikt. Om verdamping te minimaliseren, wordt de polymeeroplossing overgebracht naar een luchtdicht vial met een chloroformbestendige dop en bewaard bij 20 °C voor later gebruik. Om te beginnen met de bereiding van de agarosefilm, voegt u 50 mL water en 0,5 g standaard agarose toe aan een Erlenmeyerflask van 250 mL.

Kook gedurende één minuut in een magnetron. Koel de agarose-oplossing vervolgens af tot tussen 65 en 75 graden Celsius om slechte hechting of klontering te voorkomen. Snijd daarna het uiteinde van een 1000 microliter pipetteertip af en gebruik deze om 300 microliters van de agarose-oplossing op een vierkant glazen dekglas van 25 milliliter te pipetteren.

Houd, terwijl u handschoenen draagt, de rand van het dekglas vast en verspreid de agarose gelijkmatig over het gehele oppervlak met de lange zijde van een andere pipetteertip van 1000 µL. Plaats het dekglas met de agarosezijde naar boven op parafilm en incubeer dit gedurende ten minste één uur bij 37 °C. Ga vervolgens verder door 30 µL van de eerder bereide polymeeroplossing op het met agarose gefilmde dekglas te pipetteren.

Houd de rand van het dekglas vast met handschoenen aan en verspreid de polymeeroplossing in een cirkelvormige beweging over de agarosefilm met de lange zijde van een naald met een diameter van 18 gauge. Sluit af door het dekglas met de polymeerzijde naar boven in een plastic petrischaal in een vacuümexsiccator te plaatsen. Trek de exsiccator gedurende ten minste één uur vacuüm om eventuele resterende oplosmiddelen te verwijderen.

Om polymersomen te vormen, wordt eerst een dekglasplaatje aan de polymeerzijde van het gecoate dekglasplaatje bevestigd door zachtjes te drukken tot er een nauwe afsluiting is gevormd. Voeg vervolgens 200 tot 500 microliters rehydratie-oplossing toe aan de kamer. Plaats daarna een nat, opgerold laboratoriumdoekje langs de binnenrand van een glazen petrischaal om een bevochtigingskamer te creëren.

Plaats het dekglas met de vastgeplakte dekput in de schaal en sluit deze af met een deksel. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleken te minimaliseren en plaats deze vervolgens op een warmteplaat bij 40 °C gedurende ten minste 30 minuten om de vorming van de polymersomen te voltooien. Om het FRAP-beeldvormingsproces te starten, plaatst u het dekglas met de vastgeplakte dekput op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een instelbare condensor.

Select vervolgens een filterset op basis van het gebruikte fluorescente lipide en beeld de polymersomen op het bovenvlak van het dekglas met een 100X olie-objectief. Om de membraanvloeibaarheid via FRAP te karakteriseren, wordt eerst een polymersoom in focus gebracht, waarna de condensor van de microscoop wordt gesloten tot een kleine opening en wordt gecontroleerd of de randen van het polymersoom binnen het beeldveld liggen. Verhoog vervolgens de belichtingstijd van de camera, verwijder alle neutrale dichtheidsfilters en laat het interessegebied 30 tot 60 seconden fotovlitsen.

Schakel tot slot de lamp uit en open de condensator volledig. Zet de belichting terug naar de begininstellingen en leg gedurende drie minuten elke 30 seconden beelden vast. Open de software voor beeldanalyse op de computer van de microscoop en laad de verkregen beelden van de polymersomen.

Stel de schaal voor de meting in door het vervolgkeuzemenu Analyze te openen en de optie Set Scale te selecteren. Voer de juiste kalibratie-eenheden in voor afstand in pixels, de bekende afstand en de lengte-eenheid, en selecteer vervolgens oké. Gebruik daarna de lijn-toolbox en trek een lijn over de diameter van een geselecteerd polymersoom.

Meet de diameter van het polymersoom door het vervolgkeuzemenu Analyze te openen en Measure te selecteren. Om de analyse te vergemakkelijken, gebruikt u Ctrl+D om de meetlijn op de afbeelding af te drukken voordat u naar het volgende polymersoom gaat. Ga door met het meten van polymersomen volgens de bovenstaande procedure en voeg elke meting toe aan het gegevensvenster totdat dit voltooid is.

Sla tenslotte de gegevens op door op Bestand en Opslaan als te klikken. Klik op Opslaan in het venster dat opent en open vervolgens het resultatenbestand als spreadsheet om de gegevens te analyseren. Polymersomen gevormd uit PEO-PBD-polymeerfilms, gerehydrateerd met verschillende buffers, werden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie. De beelden tonen aan dat de polymersomen onder de verschillende rehydratiecondities niet homogeen zijn in grootte, met een diameter die doorgaans onder de 10 micrometers ligt.

Epifluorescentiebeelden van polymersomen gevormd in water bij verschillende temperaturen laten zien dat er grotere polymersomen worden gevormd naarmate de rehydratatietemperatuur stijgt. De gemiddelde diameters voor meer dan 100 polymersomen gevormd in water bij verschillende rehydratatietemperaturen zijn berekend. Bij 24 °C was de gemiddelde diameter 2,93 µm, wat toenam tot 14,04 µm bij 70 °C.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de polymersomen te allen tijde in oplossing te houden. Zorg ervoor dat de afdekkap stevig aan het dekglas is bevestigd om lekkage van de rehydratie-oplossing en uitdroging van de polymersomen te voorkomen.

Na het volgen van deze procedure kunnen methoden zoals elektronenmicroscopie worden gebruikt om aanvullende structurele eigenschappen van de polymersomen te begrijpen. Deze techniek plaveit de weg voor onderzoek in de synthetische biologie en bioengineering om polymersomen te verkennen als een robuust, chemisch aanpasbaar alternatief voor lipidemembranen voor onderzoek en abiotisch-biotische interfaces, onderzoek naar geneesmiddelentoediening en protocelsystemen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u robuust giant polymersomes kunt vormen met behulp van gel-geassisteerde rehydratie, hoe u de totale grootte van de vesicles kunt afstemmen en hoe u hun membraanintegriteit kunt karakteriseren.

Houd er rekening mee dat het werken met chloroform of de agarose en naalden gevaarlijk kan zijn. Wees uiterst voorzichtig tijdens het uitvoeren van deze procedures. Neem voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, en draag te allen tijde een veiligheidsbril en handschoenen.