Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Het algemene doel van deze gel-geassisteerde rehydratatiemethode is om robuust intacte unilamellaire gigantische polymeervesikels te vormen waarbij de grootteverdeling van de vesikes gemakkelijk kan worden gecontroleerd. Deze methode biedt een robuuste alternatief voor de vorming van polymeervesikels, die kunnen worden gebruikt om de fysische eigenschappen van het membraan te onderzoeken en vervolgens die vesikes te integreren in bio-engineeringtoepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om honderden intacte gigantische polymeervesikels veel sneller en op een minder arbeidsintensieve manier te produceren dan traditionele technieken.

Dus, het idee hiervoor ontstond toen we hoorden over de gel-geassisteerde rehydratatietegniek voor het vormen van gigantische lipidevesikels. Onze huidige methoden voor het vormen van gigantische polymerosomen zijn echter uitdagend en vaak met een lage opbrengst, dus besloten we deze methodologie als alternatieve benadering te gebruiken. Begin de polymeeroplossingvoorbereiding door vijf milligram PEO-PBD diblokcopolymeer in één milliliter chloroform in een glazen glas te wervelen tot het volledig is opgelost.

Voeg een oplossing van vijf milligram per milliliter polymeer en chloroform en een oplossing van één milligram per milliliter van fluorescent gelabeld lipide en chloroform toe aan een nieuw glas tot een uiteindelijke concentratie van 99,5 molpercent polymeer en 0,5 procent lipide wordt verkregen. Om verdamping te minimaliseren, breng de polymeeroplossing over naar een luchtdichte fles met een chloroformbestendige deksel en bewaar deze bij 20 graden Celsius voor later gebruik. Om de agarosefilmvoorbereiding te starten, voeg 50 milliliter water en 0,5 gram standaard agarose toe aan een 250 milliliter Erlenmeyer kolf.

Kook gedurende één minuut met behulp van een magnetron. Voordat u verdergaat, koelt u de agaroseoplossing af tot tussen de 65 en 75 graden Celsius om slechte hechting of klontering te voorkomen. Snijd vervolgens het uiteinde van een 1000 microliter pipettip af en gebruik deze om 300 microliters van de agaroseoplossing op een vierkante glazen deksel van 25 milliliter te pipetteren.

Terwijl u handschoenen draagt, houdt u de rand van het deksel vast en verspreidt u de agarose gelijkmatig over het hele oppervlak met behulp van de lange rand van een andere 1000 microliter pipettip. Plaats het deksel met de agarosekant naar boven op parafilm en incubeer het gedurende minimaal één uur bij 37 graden Celsius. Ga verder door 30 microliters van de eerder bereide polymeeroplossing op de agarosefilm gecoate deksel te pipetteren.

Houd de rand van het deksel vast met behulp van behandschoende vingers en verspreid de polymeeroplossing over de agarosefilm in een cirkelvorkige beweging met behulp van de lange rand van een 18 gauge naald. Beëindig door het deksel met de polymeerkant naar boven in een plastic petrischaal in een vacuümdroger te plaatsen. Evacueer de droger gedurende minimaal één uur om eventuele resterende oplosmiddelen te verwijderen.

Om polymerosomen te vormen, bevestigt u eerst een dekselputje aan de polymeerkant van de gecoate deksel door voorzichtig te drukken totdat een strakke afdichting is gevormd. Voeg vervolgens 200 tot 500 microliters rehydratatieoplossing toe aan de kamer. Plaats vervolgens een natte opgerolde laboratoriumdoek langs de binnenrand van een glazen petrischaal om een vochtigheidskamer te vormen.

Plaats het deksel met het bevestigde dekselputje in de schaal en bedek het met een deksel. Bedek de petrischaal met folie om fotobleken te minimaliseren en zet deze vervolgens gedurende minimaal 30 minuten op een hotplate bij 40 graden Celsius om de vorming van polymerosomen te voltooien. Om het FRAP-beeldvormingsproces te starten, plaatst u het deksel met het bevestigde dekselputje op de trap van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een instelbare condensor.

Selecteer vervolgens een filterset op basis van het gebruikte fluorescente lipide en om de polymerosomen op het bovenoppervlak van het deksel te beeldvormen met behulp van een 100X olieobjectief. Om de vloeibaarheid van het membraan te karakteriseren met behulp van FRAP, focust u eerst op een polymerosom, sluit vervolgens de microscoopcondensor naar een kleine opening en zorg ervoor dat de randen van de polymerosom binnen het beeldveld liggen. Vervolgens verhoogt u de camera-expositie, verwijdert u alle neutrale dichtheidsfilters en laat u het gebied van belang 30 tot 60 seconden fotobleken.

Schakel ten slotte de lamp uit en open de condensor volledig. Verlaag de belichting naar de startinstellingen en neem elke 30 seconden gedurende drie minuten afbeeldingen. Open de beeldanalysesoftware op de computer van de microscoop en laad de verworven afbeeldingen van de polymerosomen.

Stel de schaal voor de meting in door het analysevervolgkeuzemenu te openen en de optie Schaal instellen te selecteren. Voer de juiste kalibratie-eenheden in voor afstand in pixels, bekende afstand en lengte-eenheid en selecteer vervolgens oké. Gebruik vervolgens de lijngereedschapskist en teken een lijn die de diameter van een geselecteerd polymerosom overspant.

Meet de diameter van het polymerosom door het analysevervolgkeuzemenu te openen en Meten te selecteren. Om de analyse te vergemakkelijken, gebruikt u controle plus D om de meetlijn op de afbeelding af te drukken voordat u naar het volgende polymerosom gaat. Ga door met het meten van polymerosomen met behulp van de bovenstaande procedure en voeg elke meting toe aan het gegevensvenster totdat dit voltooid is.

Bewaar ten slotte de gegevens door op Bestand en Opslaan als te klikken. Klik op Opslaan in het venster dat wordt geopend en open vervolgens het resultatenbestand als een spreadsheet om de gegevens te analyseren. Polymerosomen gevormd uit PEO-PBD polymeerfilms gehydrateerd met verschillende buffers werden beeldvormd met behulp van fluorescentiemicroscopie. De afbeeldingen tonen dat de polymerosomen niet-homogeen in grootte zijn onder de verschillende rehydratatieomdingen, met een diameter die typisch onder de 10 micrometer ligt.

Epifluorescentieafbeeldingen van polymerosomen gevormd in water bij verschillende temperaturen laten zien dat naarmate de re