Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen
May 13th, 2016
Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.
Het algemene doel van deze micro-injectietechniek is om transgene en genoombewerkte stekelbaarsvissen te genereren om gen- en enhancerfunctie te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelings- en evolutionaire genetica, zoals hoe genen en enhancers functioneren om lichaamspatronen te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt transgene vissen genereert voor functionele genetische analyse.
Na het voorbereiden van twee toll-plasmiden en mRNA volgens het tekstprotocol, trekt u ten minste vier micropipetnaalden uit borosilicaatglas. Bewaar verticaal in een capillair opslagpot waarbij de scherpe uiteinden naar beneden wijzen. Om tot honderd stekelbaars-eieren te bevruchten, voegt u 50 microliter sperma-oplossing toe en gebruikt u een pipettetip om voorzichtig te roeren om ervoor te zorgen dat alle eieren bevrucht zijn.
Terwijl u op ijs werkt, vult u ten minste drie naalden terug door 0,5 microliter injectieoplossing in de stompe punt van de naald te pipetten en laat het weglopen. Schakel in de tussentijd het transverlichtingslicht voor de dissectiescoop in en plaats een glazen plaat van 13 vierkante centimeter op de microscooplichtbasis met een gipszaagblad van 15 centimeter bovenop de glazen plaat. Orienteer de zaag loodrecht op het injectieapparaat met de inkepingen naar de naaldhouder toe, zet vervolgens de bedieningsbox aan en zorg ervoor dat de druk is ingesteld op ongeveer 175 kilopascal.
Stel de injectieduur in op 180 milliseconden. Draai vervolgens de naaldhouder los, steek een gevulde naald in de houder totdat de weerstand van de rubberen houder voelbaar is en draai de naaldhouder vast totdat deze vingervast is. Pas vervolgens de naaldachtigte aan tot ongeveer 45 graden.
Gebruik de micromanipulator-bedieningselementen om de naald aan te passen zodat het uiteinde zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Zoom in tot ongeveer 40x vergroting en concentreer u op de punt van de naald, die de glasbodem niet mag raken. Grijp met horlogemakerstangen de punt van de naald twee tot drie tangbreedtes vanaf het uiteinde en breek de punt voorzichtig in een hoek van 60 graden.
Druk vervolgens meerdere keren op het injectie-voetpedaal om te testen of de naald gebroken is. Na een paar tikken zouden er kleine rode druppels uit het uiteinde moeten komen. Gebruik een wegwerp-overdrachtspijp om een paar druppels stekelbaarswater op de glazen plaat te plaatsen.
Laat de naald voorzichtig in het water zakken en verhoog vervolgens de tegendruk totdat er een zwakke stroom roze vloeistof uit de naald komt. Trek de naald zo ver mogelijk terug zodat deze niet beschadigd raakt tijdens het voorbereiden van de embryo's. Ongeveer 25 minuten na de bevruchting, gebruikt u twee pipettetips van 10 microliter om vijf tot 10 embryo's uit de koppeling te verwijderen en over te brengen naar de glazen plaat.
Gebruik de pipettetips om de embryo's voorzichtig te scheiden in individuele inkepingen van het zaagblad, wees voorzichtig om de embryo's niet te doorboren. Voeg vervolgens met een overdrachtspijp voldoende stekelbaarswater toe om de embryo's te bedekken. Verwijder vervolgens na drie tot vijf seconden het meeste water en laat alleen een klein volume achter dat elk embryo bedekt.
Beginnend met het embryo dat het verst weg is, schuif de glazen plaat en zoom in op het embryo zodat het ongeveer 25 procent van het gezichtsveld vult. Laat de naald in het gezichtsveld zakken en gebruik een pipettetip van 10 microliter om het embryo voorzichtig te draaien om de blastomeer te identificeren, een korrelige, lichtgele, verhoogde bult cytoplasma bovenop de dooier. Draai het embryo zodat de blastomeer direct loodrecht op het uiteinde van de naald staat.
Laat de naald langzaam en gelijkmatig zakken en druk toe om het corion te doorboren en de naald in het cytoplasma te steken zonder de onderliggende dooier erdoorheen te duwen. Druk drie tot vier keer op het voetpedaal om te injecteren, zodat een rode bolus met licht verspreide randen ongeveer 1/8 van de diameter van het cytoplasma vult. Het hebben van een scherpe naald loodrecht op het corion zal deze stap vergemakkelijken.
Het beperken van de hoeveelheid toegevoegd water zal helpen om het corion zacht te houden. En ten slotte zal het targeten van het cytoplasma de kans op het verkrijgen van een transgeen dier verhogen. Gebruik de micromanipulator-bedieningselementen om de naald terug te trekken en houd met de pipettetip van 10 microliter het embryo vast als het aan de naald blijft plakken.
Nadat de naald is teruggetrokken, schuift u de glazen plaat om het volgende embryo met de naald uit te lijnen en herhaalt u de injectie. Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, gebruikt u de overdrachtspijp met het afgesneden uiteinde om water aan de plaat toe te voegen. Gebruik vervolgens een overdrachtspijp om de embryo's te verzamelen en plaats ze in een petrischaal van 150 millimeter gevuld met stekelbaarswater.
Incubeer de embryo's op 18 graden Celsius. Een dag na de injectie giet u voorzichtig het stekelbaarswater af en vervangt u het door vers water. Controleer op dode of misvormde embryo's en verwijder ze om besmetting te voorkomen.
Zoals hier geïllustreerd, resulteert een succesvolle injectie voor transgenen met enhanceractiviteit in specifieke cellulaire expressie van het transgen. Bijvoorbeeld, in de borst- en mediale vinnen en de notochord. Geïnjecteerde vissen kunnen vervolgens worden uitgekruist om stabiele lijnen te produceren, zoals deze ruglijn die GFP-expressie in het embryonale hart drijvt op vier dagen na bevruchting.
Voor een actieve enhancer zal 40 tot 50 procent van de embryo's weefselspecifieke transgenexpressie vertonen, bijvoorbeeld in de mediale en borstvinnen. Tot 100 procent van de GFP-positieve F0-vissen die toll-twee-plasmide-transgenen tot expressie brengen, produceren trans
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd micro-injectieprotocol voor het genereren van genomische modificaties in de driedoornige stekelbaars. De methode richt zich op transgene manipulaties en genoombewerkingstechnieken, inclusief Tol2-gemedieerde constructies, TALENs en CRISPRs.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Evolutionaire biologie
Achtergrond
- Transgene en genoombewerkingstechnieken zijn essentieel voor functioneel testen van genen.
- De driedoornige stekelbaars dient als een opkomend modelorganisme.
- Het begrijpen van gen- en enhancerfunctie is cruciaal voor ontwikkelings- en evolutionaire genetica.
- Deze micro-injectietechniek kan efficiënt transgene vis produceren.
Doel van het onderzoek
- Om transgene stekelbaarsvissen te genereren voor functionele genetische analyse.
- Om de rollen van genen en enhancers in lichaamspatroongeneratie te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het testen van genfunctie.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Tol2 plasmiden en mRNA volgens het protocol.
- Micro-injectie in bevruchte stekelbaarseieren.
- Gebruik van micropipetnaalden voor nauwkeurige injectie.
- Bevruchting van eieren met sperma-oplossing voor succesvolle ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- De micro-injectietechniek genereert met succes transgene stekelbaarsvissen.
- Efficiënte productie van genetisch gemodificeerde organismen voor analyse.
- Maakt verkenning van gen- en enhancerfuncties mogelijk.
- Dragen bij aan het begrip van ontwikkelings- en evolutionaire processen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers in de genetica.
- Het verbetert het vermogen om complexe genetische interacties te bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere modelorganismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microinjection-based transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks enables direct functional interrogation of candidate genes and regulatory elements in a vertebrate model with high phenotypic diversity. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at the earliest stages of discovery, providing predictive confidence for gene function and regulatory architecture. The approach is strategically positioned for portfolio triage and prioritization of genetic targets in developmental and evolutionary contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional testing of candidate genes and enhancers identified from mapping studies.
- Supports mechanistic de-risking by allowing targeted genome editing with TALENs and CRISPR/Cas9.
- Facilitates validation of gene regulatory elements using transgenic reporter assays.
- Provides predictive confidence for gene-phenotype relationships in a vertebrate system.
Screening & Assay Development
- Prepares validated transgenic and genome-edited lines for downstream phenotypic screening.
- Standardizes microinjection and selection protocols to ensure reproducibility and quantitative assessment of transgenesis efficiency.
- Enables scalable production of genetically modified embryos for assay development.
- Supports reliable evaluation of gene function and regulatory activity in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with disease-relevant phenotypes and evolutionary adaptations.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical model development in a vertebrate context.
- Enables risk-adjusted advancement of genetic targets based on functional outcomes.
- Supports the establishment of stable lines for longitudinal and cross-generational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection protocol integrates into the discovery continuum from candidate gene identification to functional validation and preclinical model generation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct gene and enhancer manipulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for transgenesis and genome editing efficiency.
- Analytics: Enables measurement of transgene expression and mutation rates to compare experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in a vertebrate system with diverse phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation applicable to multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for genetic manipulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microinjection and embryo handling.
- Needs access to specialized instrumentation such as micromanipulators and dissecting microscopes.
- Demands cross-team standardization of injection and selection protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different genetic constructs or model systems.
- Efficiency and transmission rates can vary by construct type and must be empirically determined.
