Name: Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer micro-injectie voor transgenese en genoombewerking in driestekelige stekelbaars. Deze methode genereert efficiënt transgene vissen voor functionele genetische analyse en helpt bij het bestuderen van gen- en enhancerfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gefinancierd door de NIH R01 # DE021475 (CTM), een NIH predoctorale Training Grant 5T32GM007127 (PAE) en een NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Wij danken Kevin Schwalbach voor het uitvoeren van BAC recombineering en injecties, Nick Donde voor het genereren van CRISPR Sanger sequencing data, en Katherine Lipari voor nuttige feedback over de injectie protocol.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Fisher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Kikuta, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgenesis+using+Tol2+transposon+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Moleculario+Biology%3A+Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors.</a> Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li>
<li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genomic+tools+for+molecular+studies+of+evolutionary+change+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).</li>
<li>Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+for+identifying+distant+regulatory+elements+applied+to+the+Gdf6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene.</a> Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice.</a> BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+compatible+vectors+for+analysis+of+gene+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3-new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) </a>. , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).</li>
<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het injecteren van een cel stekelbaars embryo&#39;s voor transgenese of genoom bewerken presenteert drie grote uitdagingen. In de eerste plaats ten opzichte van de zebravis embryo&#39;s, de stekelbaars embryonale chorion is taai en zal vaak breken naalden. Dit probleem kan gedeeltelijk worden ondervangen door dikker en sterker glazen micropipetten en injecteren loodrecht op het chorion (zie protocol figuur 2). Zorgen dat zo min mogelijk water wordt toegevoegd aan het embryo (net genoeg om de oorzaak cho...

Een fundamenteel onderdeel van het begrip van hoe biodiversiteit ontstaat is het bepalen van de genetische en ontwikkelingsstoornissen bases van geëvolueerd fenotypische veranderingen in de natuur. De driedoornige stekelbaars vis, Gasterosteus aculeatus, heeft ontpopt als een uitstekend model voor het bestuderen van de genetische basis van de evolutie. Stekelbaarzen hebben veel adaptieve evolutionaire veranderingen ondergaan zeevissen talloze zoetwater omgevingen gekoloniseerd rond het noordelijk halfrond, wat resulteert in dramatische morfologische, fysiologische en gedragsveranderingen 1. De genomen van individuen 20-1 stickleback populaties werden gesequenced en geassembleerd, en een hoge dichtheid koppelingskaart werd gegenereerd om het samenstel te verbeteren 2,3. Genetische mapping experimenten hebben genomische regio&#39;s die ten grondslag liggen aan geëvolueerd fenotypes 4-6, en in een paar gevallen zijn de functionele rol van specifieke kandidaat-genen getest 7,8. Een aantal genoomgebieden onderliggende morfologische veranderingen werden geïdentificeerd met veelbelovende kandidaat-genen, maar deze kandidaten nog niet functioneel getest 9-12. Bovendien, stekelbaars zijn gangbare modellen voor studies van de bevolking genetica / genomics 13,14, soortvorming 15, gedrag 1, endocrinologie 16, ecotoxicologie 17, immunologie en parasitologie 18 19. Toekomstige studies in elk van deze gebieden zullen profiteren van de mogelijkheid om functionele genetische manipulaties in sticklebacks. Naast het manipuleren van hun coderende sequenties, kan de rol van kandidaatgenen worden geëvalueerd door het bestuderen van hun cis van regelgevende sequenties en functioneel toenemen, afnemen of elimineren van expressie van het kandidaatgen. Micro-injectie en transgenese methoden in stekelbaars zijn goed ingeburgerd 7,8,20 en werden in eerste instantie ontwikkeld met behulp van een meganuclease bemiddeldeWerkwijze 21 eerst beschreven in medaka 22. De gemodificeerde micro-injectie hier gepresenteerde methode is geoptimaliseerd voor zowel Tol2 gemedieerde transgenese en recent ontwikkelde genoom bewerken reagentia met inbegrip van Talens en CRISPRs. Wijzigingen in cis van regelgevende elementen worden gedacht van cruciaal belang voor morfologische evolutie te zijn, zoals cis van regelgevende veranderingen die de negatieve gevolgen van pleiotrope codering mutaties 23 kunnen voorkomen. Daarom is het testen en vergelijken van vermeende cis van regelgevende sequenties is uitgegroeid tot een centrale doelstelling van een toenemend aantal evolutionaire studies. Daarnaast hebben de meeste menselijke ziekten varianten zijn regulerende varianten 24,25, en het model gewervelde systemen zijn hard nodig om cis van regelgevende element functie en logica te bestuderen. Vissen die hun embryo&#39;s extern bemesten in grote aantallen bieden krachtige gewervelde systemen om cis -regeling te bestuderen. Het Tol2 transposon systeem, waarbij buign DNA te integreren in het genoom wordt geflankeerd door Tol2 transposase bindingsplaatsen en co-geïnjecteerd met Tol2 transposase mRNA, werkt met hoge werkingsgraad voor succesvolle integratie plasmide constructen in fish genoom 26-28. Typisch wordt een mogelijke enhancer gekloneerd stroomopwaarts van een basale promotor (zoals hsp70l 29) en fluorescerende reportergen zoals EGFP (verhoogd groen fluorescent eiwit) of mCherry in een Tol2 hoofdketen en geïnjecteerd met transposase mRNA 26. Waarneming van expressie van het fluorescerende reporter, hetzij geïnjecteerde embryo&#39;s of nakomelingen met stabiel geïntegreerde transgenen, geeft informatie over de spatio-temporale regulatie van genexpressie aangedreven door de vermoedelijke enhancer. In verdere experimenten, kan bevestigd versterkers worden gebruikt om weefselspecifieke overexpressie van genen van belang drijven. Voor de analyse van grotere cis van regelgevende regio&#39;s, van hoge kwaliteit met grote insert genomic bibliotheken met behulp van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) zijn gebouwd voor zowel zee- en zoetwater stekelbaars 30. Deze BACs kunnen worden recombineered een gen te vervangen door een fluorescerende reporter gen in de context van een groot (150-200 kb) genomisch gebied 31. De fluorescerende reporter wordt vervolgens uitgedrukt in een spatiotemporele patroon, zoals bepaald door de regelgevende sequenties binnen de BAC. Voor studies in vis, kan Tol2 locaties worden toegevoegd aan de BAC op genomische integratie 32,33 vergemakkelijken. In latere stadia van ontwikkeling in situ hybridisatie technisch uitdagend, kan de fluorescentie van de BAC worden gebruikt om patronen van genexpressie te bestuderen, zoals is getoond stickleback Bone morfogenetisch eiwit 6 (BMP6) 20. Bovendien kunnen fluorescerende expressiepatronen bij een individu worden gevolgd in de tijd, die niet kan worden bereikt met in situ hybridisatie. BAC&#39;s kunnen ook worden gebruikt om een ​​additiona toevoegenl kopie van een genomisch gebied de dosering van een gen van belang te verhogen. Voor het onderzoek van genfunctie, genoom bewerken is een explosief groeiende sector die kan worden gebruikt om gerichte wijzigingen genomische sequenties in diverse organismen 34 te produceren. Transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn modulair, sequentie-specifieke nucleasen oorspronkelijk geïsoleerd uit plantaardige pathogenen die nauwkeurig kan worden ontworpen om direct te binden aan een genoomsequentie van de keuze en het genereren van een dubbele streng te breken 35,36. Geclusterde regelmatig afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS werden oorspronkelijk gevonden in bacteriën en gebruik een gids-RNA en eiwit Cas9 om een breuk in een doel DNA sequentie complementair aan de geleiding 37 te genereren. De daaropvolgende reparatie van de dubbelstrengbreuk door zowel Talens en CRISPRs vaak laat een kleine insertie of deletie, waarbij de functie van de doelsequentie kunnen verstoren35-37. In sticklebacks zijn Talens gebruikt om genexpressie ontwrichten via manipulatie van een versterker 20, en beide Talens en CRISPRs met succes geproduceerd coderende mutaties (ongepubliceerde gegevens). Een gedetailleerd protocol voor het genereren van CRISPRs voor gebruik in zebravis kan worden gebruikt als richtlijn om CRISPRs voor stekelbaarsjes 38 ontwikkelen. Transgene en genoom bewerken experimenten vereisen invoering van nucleïnezuren in een pasbevruchte eencellige embryo. Door het inbrengen van het transgen of genoom-editing tool vroeg in de ontwikkeling, is het aantal genetisch gemanipuleerde dochtercellen in het embryo gemaximaliseerd. Geïnjecteerde embryo&#39;s worden vervolgens visueel onderzocht op fluorescentie of moleculair gescreend genoom wijzigingen. Als cellen die bijdragen tot de kiemlijn succesvol zijn gericht, kan het transgen of mutatie worden doorgegeven aan een subset van nakomelingen, zelfs wanneer na injectie dodelijkheid hoog. Het mozaïek vis kan worden outcrossed ofgekruist en hun nakomelingen gescreend om de mutant allelen of een stabiel geïntegreerd transgen van rente terug te vorderen. Dit protocol beschrijft methoden voor het introduceren van transgenen en genoom bewerken reagentia in één cel stekelbaars embryo&#39;s en het toezicht op voor een succesvolle genomische modificaties.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with transillumination</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Micromanipulator</td></tr><tr><td>Pressure Injecion system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Iron plate (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% phenol red in DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>injection tracer</td></tr><tr><td>#5 forceps, biologie dumoxel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>for needle breaking</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>holds needles</td></tr><tr><td>6", 6 teeth per inch plaster drywall saw</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>hold eggs for injection</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm glass plate</td><td>any hardware store</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*harder glass than zebrafish injection capillaries</td></tr><tr><td>150 x 15mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>raise stickleback embryos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>store eggs pre-injection</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>fish anaesthesia/euthanasia</td></tr><tr><td>Sp6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>For transcription of TALENs and transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purify transposase or TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>clean up plasmids for injection</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>for BAC DNA preparation</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contains endotoxin rinse buffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel Extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>for sequencing induced mutations</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetate-EDTA buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&nbsp; Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-strip PCR tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-injectie voor transgenese en genome bewerken in threespine stekelbaarzen

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

De driedoornige stekelbaars vis zich ontwikkeld tot een krachtig systeem om de genetische basis van uiteenlopende morfologische, fysiologische bestuderen en gedragsmatige fenotypes. De opmerkelijk verschillende fenotypen die zijn geëvolueerd mariene populaties passen aan talloze zoetwatermilieus, gecombineerd met de mogelijkheid mariene en zoetwater vormen kruisen, vormen een zeldzame vertebraat systeem waarin genetica kan worden gebruikt om genomische regio kaart besturen geëvolueerd eigenschappen. Uitstekende genomische middelen zijn nu beschikbaar, het vergemakkelijken van moleculair genetische dissectie van geëvolueerd veranderingen. Terwijl mapping experimenten genereren van lijsten van interessante kandidaatgenen zijn functionele genetische manipulaties nodig om de rol van deze genen te testen. Genregulatie kan worden bestudeerd met transgene reporter plasmiden en BACs geïntegreerd in het genoom via het transposase Tol2 systeem. Functies van specifieke kandidaat-genen en cis-elementen van regelgevende kan worden beoordeeld door het induceren gerichtmutaties met TALEN en CRISPR / Cas9 genoom bewerken reagentia. Alle methoden vereisen introduceren van nucleïnezuren in bevruchte één-cel stekelbaars embryo&#39;s, een taak moeilijker geworden door de dikke chorion van stekelbaars embryo&#39;s en de relatief klein en dun blastomere. Hier is een gedetailleerd protocol voor micro-injectie van nucleïnezuren in stickleback embryo beschreven transgene genoom en bewerkingssoftware om genexpressie en functie te bestuderen, alsook technieken voor het succes van transgenese beoordelen en herstellen stabiele lijnen.

Voor reportergen transgenen die enhancer activiteit, zal succesvol injectie resulteren in specifieke cellulaire expressie van het transgen (Figuur 4A, 4C). Geïnjecteerd vis kan vervolgens worden outcrossed om stabiele lijnen (voorbeeld van een BAC stabiele lijn weergegeven in figuur 4B) te produceren. Het injecteren van DNA in stekelbaars embryo resulteert meestal in veel hogere sterfte dan RNA alleen. Typerend te zien tot 50% (soms meer...

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Het algemene doel van deze microinjectietechniek is het genereren van transgene en genoom-bewerkte prikspieringen om de functie van genen en enhancers te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelings- en evolutiegenetica, zoals de manier waarop genen en enhancers functioneren bij het creëren van het lichaamsplan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt transgene vissen genereert voor functionele genetische analyse.Nadat de twee plasmiden en het mRNA volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, worden er ten minste vier micropipetnaden getrokken uit borosilicaatglas. Bewaar deze verticaal in een capillair bewaarpotje met de scherpe uiteinden naar beneden gericht. Om tot honderd prikkelrugge-eitjes te bevruchten, wordt 50 µL spermaloysing toegevoegd en wordt een pipetpunt gebruikt om voorzichtig te roeren om ervoor te zorgen dat alle eitjes bevrucht zijn.Terwijl u op ijs werkt, vult u ten minste drie naalden van achteren door 0,5 µL injectie-oplossing in het stompe uiteinde van de naald te pipetteren en dit vervolgens te laten weglopen. Zet ondertussen de doorlichtingslamp van de dissectiemicroscoop aan en plaats een g

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Source: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the stereotaxic injection of a viral vector encoding Cre recombinase and green fluorescence protein or GFP into the striatum of a genetically modified mouse pup to achieve gene manipulation by excising a loxP-flanked STOP cassette, activating red fluorescence protein or RFP as a reporter.

Stereotactic Microinjection of a Viral Vector for Gene Manipulation in a Mouse Pup Striatum

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

-Gen-targeting mutagenese is nu mogelijk in een breed scala van organismen, waarbij genoom montagetechnieken. Hier tonen we een protocol voor gerichte gen mutagenese met behulp van transcriptie-activator, zoals effector nucleasen (Talens) in Astyanax mexicanus, een soort vis dat oppervlak vis en cavefish omvat.

Genome bewerken in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Met behulp van transcriptie Activator-achtige Effector Nucleases (Talens)

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Leer micro-injectie voor transgenese en genoombewerking in driestekelige stekelbaars. Deze methode genereert efficiënt transgene vissen voor functionele genetische analyse en helpt bij het bestuderen van gen- en enhancerfunctie.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Meer video's verkennen