Name: Beoordeling van Myofilament Ca 2+ Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer hoe u myofilament Ca2+ gevoeligheid evalueert in cardiomyocyten van ratten met Fura-2 AM en fluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult contractiele veranderingen bij hartfalen en hypertensie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2013068067); door de Brain Korea 21 Graduate Programme van het Koreaanse ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie, Seoul National University Hospital, de Koreaanse Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) en van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).

Het protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health van de VN (NIH publicatie nr 85-23, herzien 1996). Het werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Seoul National University (IACUC goedkeuring nr .: SNU-101213-1). 1. Buffer Voorbereiding (tabel materialen en apparatuur) <ol><li> Bereid 300 ml verse isolatieoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 met NaOH). </li><li> Bereid 100 ml vers opslagoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl 120, KCl 5,4; MgSO4 5, CaCl2 0,2, natrium- pyruvaat 5, glucose 5,5, taurine 20, HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 met NaOH). </li><li> Bereid 1 liter perfusie-oplossing (in mM: NaCl, 141,4, KCl, 4; NaH 2PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 met NaOH). </li><li> Bereid 30 ml collagenase oplossing 1 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), protease (0,1 mg / ml), runderserumalbumine (BSA, 1.67mg / ml) en Ca2 + (0,05 mM) tot 25 ml isolatie oplossing. </li><li> Bereid 20 ml collagenase oplossing 2 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) en Ca2 + (0,05 mM) 16,7 ml isolatieoplossing. </li><li> Bereid 40 ml van BSA door toevoeging 0,4 g BSA aan 40 ml isolatieoplossing. Aparte 10 ml en 30 ml in twee bekers. Voeg Ca2 + aan 30 ml BSA oplossing zodat de uiteindelijke Ca2 + -concentratie in de BSA oplossing 1 mM. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Isolatie van de linker ventriculaire (LV) Myocytes <ol><li> Transfer 8-12 weken oude, mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten in schoon vervoer kooien van de dieren mogelijkheid om de voorbereiding en de isolatiekamer. </li><li> Heet twee waterbaden tot 37 o C. Opmerking: Gebruik een waterbad voor het water - een mantel reservoir en de perfusie buizen van de Langendorff perfusie-systeem. Gebruik de andere waterbad hartspierweefsel trunks schudden om het ene myocyten te scheiden. </li><li> Voeg 5 ml en 3,3 ml van de BSA-oplossing (zonder Ca 2+) tot 25 ml collagenase oplossing 1 en 16,7 ml collagenase oplossing 2 om het volume op 30 ml en 20 ml. </li><li> Voeg isolatieoplossing (100 ml) en collagenase oplossing 1 (30 ml) naar kolom 1 (Kol 1) en 2 kolom (Kol 2) in het Langendorff perfusie systeem, respectievelijk (Figuur 1A). </li><li> Zuurstof de isolatie-oplossing en collagenase oplossing 1 in Col. 1 en Col.2 via de zuurstof verbindingsbuis in het Langendorff perfusie-systeem (Figuur 1A). Evenzo oxygenaat collagenase oplossing 2 en de BSA oplossing in de schudwaterbad met 100% O 2 via dezuurstof verbindingsbuis. </li></ol> 3. Isolatie van LV myocyten <ol><li> Verdoven een SD rat via intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (30 mg / kg) en bevestig de narcose status via teen knijpen en het ontbreken van terugtrekking reflectie. </li><li> Verplaats de rat naar een dissectie lade. In rugligging, zet de vier poten aan de zijden van het lichaam met tape. </li><li> Solliciteer thoracale mid-axiale insnijdingen met chirurgische schaar om de kist te openen, zodat het hart niet te beschadigen. Met een paar schone schaar om het hart ontleden van de verbindende vaten (bv superior en inferior vena cava, longvaten en aorta) en pericardiale membraan 13. </li><li> Laat een deel van de aorta van een voldoende lengte (5-8 mm), klem de aorta met fijne pincet en de canule van het Langendorff perfusie systeem snel te monteren binnen 1 min (Figuur 1A). Bind hechtdraad 4/0 strak over de aorta. </li><li&gt; Zet de klep aan Col. 1 en perfuseren het geïsoleerde hart met voorverwarmd en geoxygeneerde isolatieoplossing voor 10 min (perfusiesnelheid: 12-14 ml / min). Schakel de klep aan Col. 1, zet de kraan op Col. 2 en perfuseren het hart met collagenase oplossing 1 voor 8-10 min. </li><li> Demonteer de verteerde hart door het snijden van de aorta en over te dragen door het vasthouden van de aorta met een tang in de kolf met vers isolatie-oplossing (figuur 1Bi). Gebruik fijne schaar en forceps meeste van de LV vrije wand (inclusief het septum) in kleinere stukjes (~ 22 mm, figuur 1Bii). </li><li> Breng de stukken in een kolf die voorverwarmd en zuurstofrijk vers collagenase oplossing 2 (figuur 1Biii). Schud gedurende 10 minuten. Blijven leveren zuurstof aan de myocyten bevattende collagenase oplossing 2. </li><li> Verplaats de myocyten - vering met een 10 ml centrifugebuis met behulp van druppelaars met een zuigingsbol en voeg Ca 2+ - bevattende BSA-oplossing (1: 1 in volume). Centrifugeer bij 30 g gedurende 2 minuten en gooi de supernatant. Re-schorten de myocyt pellet in 5 ml van de BSA-oplossing. Centrifuge en gooi de supernatant. </li><li> Verspreiden de myocyten pellets en houden myocyten in 10 ml pre-geoxygeneerde opslagoplossing bij kamertemperatuur (Figuur 1Biv-vi). </li><li> Herhaal de procedures (stappen 3,7-3,9) met de resterende LV weefsel in de kolf. Opmerking: Houd herhalen procedures (stappen 3,7-3,9) totdat het meeste LV weefsel verdwijnt om een ​​goede opbrengst van myocyten te verkrijgen. </li><li> Houd de myocyten in opslagoplossing voor 6-8 uur bij KT tot eind experimenten. </li></ol> 4. gelijktijdige metingen van intracellulaire Ca 2 + transiënten en Myocyte Contractie <ol><li> Load LV myocyten met acetoxymethyl ester Fura-02:00 (2 uM). Opmerking: Voer alle laad- procedures en experimenten met geladen myocyten in een donkere buis (figuur 1Bvii). <ol><li> centrifuge de myocyten suspensie (1 ml) bij 2000 xg gedurende 10 sec. Verwijder het supernatant en resuspendeer de myocyt pellet in 1 ml Tyrode oplossing met een lage Ca 2+ concentratie (250 uM, Tafel materialen en apparatuur). </li><li> Add Fura-02:00 en poloxameer 407 (2 pl) voorzichtig dispergeren myocyten suspensie en het mengsel bij kamertemperatuur houden (20-24 ° C) gedurende 15 min (Fig 1Bvii). </li><li> Centrifugeer het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof en de verspreiding van de myocyt pellet in 1 ml perfusie oplossing die 500 uM Ca2 +. Na 10 min centrifugeren van het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg frisse perfusievloeistof (500 uM Ca2 +, 1 ml) en houd de Fura-02:00 - loaded myocyte pellet in deze oplossing voor opnames. </li></ol></li><li> Meting van myocyten LV contractie en intracellulair Ca2 + <ol><li> Voordat u gaat opnemen, vul de perfusie buis die door middel van een looptwater jas met de Tyrode oplossing, die is voorverwarmd tot 36 o C. </li><li> Plaats een paar druppels van de Fura 02:00 - geladen LV myocyten schorsing, op de kamer van een omgekeerde fluorescentie microscoop voor 5-8 min. perfuseren langzaam de Tyrode-oplossing (2,2 ml / min). </li><li> Druk op de knop &quot;start&quot; op het frontpaneel van de digitale stimulator om het veld stimulatie (2 Hz) te starten. Opmerking: De uitgangsspanning (10 V, 5 msec) wordt toegepast op de myocyten in de kamer via platinadraden aan weerszijden van de kamer. <ol><li> Selecteer myocyten dat contract stabiel (niet die het weergeven van hyper- of hypo-contractie) voor de opname. </li></ol></li><li> Stel de myocyte keuze in de horizontale stand van de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem en de focus van de microscoop te passen om optimale beelden te verkrijgen sarcomeren. Plaats de paarse rechthoekige doos op het gebied waarin duidelijke sarcomeres duidelijk worden waargenomen tot het gemiddeldevan sarcomeer lengtes (rood piek) toont een enkelvoudige scherpe piek (Figuur 2A, lager afbeelding). </li><li> Noteer de veranderingen van sarcomeerlengte reactie op veldstimulatie (figuur 2A en B). Opmerking: Gebruik de geladen myocyten binnen 1 - 2 uur. </li><li> Stel het diafragma van de camera, zodat het veld in de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem is de grootte van de myocyten (Figuur 2A). Stimuleren van de myocyten met excitatie bij 360 nm / 380 nm en emissie bij 510 nm (overname frequentie 1000 Hz). Neem sarcomeer verkorten en de fura2 AM verhouding met veldstimulatie (figuur 2B). </li></ol></li></ol> 5. Beoordeling van Myofilament Ca 2+ Gevoeligheid <ol><li> Middel de sarcomeer lengte en Ca2 + transiënten in steady state (10 - 20 sporen) en stel de fase-vlak lus van de Fura-2 verhouding vs. sarcomeerlengte dezelfde myocyten (beide met meetwaardes en delta veranderingen; figuur 2C). </li><li> In elk perceel, definiëren Fura -2-ratio op 50% ontspanning (EC 50, figuur 2C). Vergelijk zowel de lus en EC 50 van elke interventie. </li></ol>

<ol><li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li>
<li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2%2B%3A+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li>
<li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+intracellular+Ca2%2B+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li>
<li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li>
<li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+time-course+of+Ca2%2B+exchange+with+calmodulin%2C+troponin%2C+parvalbumin%2C+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li>
<li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+sensitization+increases+cytosolic+Ca2%2B+binding+affinity%2C+alters+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%2C+and+causes+pause-dependent+Ca2%2B-triggered+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+%CE%B2-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li>
<li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336(2013).</li>
<li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+L-type+Ca2%2B+channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2%2B+sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li>
<li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li>
<li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM%2C+DCM+AND+RCM%3A+what+can+we+learn+about+thin+filament+function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li>
<li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li>
<li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li>
<li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li>
<li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we de protocollen om veranderingen van myofilament Ca 2+ gevoeligheid in enkele geïsoleerde hartspiercel beoordelen en benadrukken het belang van het meten van deze parameter naast elektrofysiologische eigenschappen, intracellulaire Ca 2+ transiënten en myofilament dynamiek. Dit komt omdat de opname van een of twee van de parameters niet de onderliggende mechanismen cardiale contractie en ontspanning kan expliciteren. In tegenstelling tot conventionele werkwijzen die myocyten contr...

Cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling de grondschema voor de analyse mechanische eigenschappen van het myocardium, dwz de contractiele functie van het hart 1,2. EG koppeling wordt geïnitieerd door membraandepolarisatie secundair aan de activiteiten van sarcolemmale ionkanalen (bijvoorbeeld het spanningsgevoelige Na + kanaal, welke kan worden gemeten met patch-clamp techniek). Daaropvolgende activering van spanningsafhankelijke L-type Ca 2+ kanalen (LTCCs) en Ca 2+ influx via LTCCs leiden tot het grootste deel van Ca 2+ vrijkomen door middel van ryanodinereceptor (RyRs), het verhogen van de cytosolische Ca 2+ concentratie van het nanomolair (nM ) naar micromolair (uM) niveau. Een dergelijke verhoging van cytosolisch Ca2 + bevordert Ca2 + binding aan troponine C (TnC) in dunne filamenten en wekt conformatieveranderingen van het filament complex aan de actine-myosine interactie vergemakkelijken en bereikt myocardial contractie 3. Omgekeerd, het cytosolische Ca2 + weer wordt uptaken terug in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via Ca2 + -ATPase in SR (SERCA2a) of buiten de myocyten geëxtrudeerd via de Na + / Ca2 + uitwisselaar en plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Bijgevolg is de daling van cytosolische Ca2 + aanzet conformatieveranderingen van dunne filamenten terug naar de oorspronkelijke toestand, waardoor de dissociatie van actine-myosine en myocyt ontspanning 1-3. In dit schema wordt de activiteit van SERCA2a algemeen beschouwd als de snelheid van myocardiale relaxatie bepalen omdat het goed is voor 70-90% van cytosolische Ca 2 verwijderd in de meeste zoogdiercellen hartcellen 1. Als zodanig abnormale Ca 2+ behandeling door LTCC, RyR en SERCA2a, etc. werd beschouwd als de belangrijkste mechanismen voor de verminderde contractiliteit en ontspanning in het zieke hart 1-4. 2+ die fungeert als de boodschapper in EC koppeling is goed voor ongeveer 1% van de totale intracellulaire Ca 2+ en de meerderheid van Ca 2+ is gebonden aan de intracellulaire Ca 2+ buffers 5,6. Dit komt door het feit dat verschillende Ca2 + buffers zijn overvloedig in cardiomyocyten, bijvoorbeeld membraanfosfolipiden, ATP, creatinefosfaat, calmoduline, parvalbumine, myofibril TnC, myosine, SERCA2a en calsequestrin de SR. 5,6,7. Onder hen, SERCA2a en TnC de overheersende Ca2 + buffers 5,6,7. Bovendien Ca2 + binding aan de buffers is een dynamisch proces in zenuwtrekking (bijvoorbeeld, 30-50% Ca2 + bindt aan TnC en losmaken van het tijdens Ca2 + transiënten 7) en de verandering in Ca2 + binding veroorzaken aanvullende &quot;vrijgeven&quot; van vrij Ca2 + het cytosol, leidt tot veranderingen van de intracellulaire Ca2 + concentration. Derhalve verstoring van de intracellulaire Ca2 + niveau induceert myofilament abnormale bewegingen, die de voorlopers van contractiele dysfunctie en hartritmestoornissen 8,9 zijn. Vele factoren (zowel fysiologische en pathologische) kunnen de bronnen van post-transcriptionele modificaties van myofilament eiwitten, die myofilament Ca 2+ buffering en myofilament Ca 2+ gevoeligheid 8-10 beïnvloeden. Onlangs werd gerapporteerd dat mutaties in myofilament eiwitten verhogen Ca2 + bindingsaffiniteit en intracellulaire Ca2 + handling, triggering pauze-afhankelijke versterking Ca2 + transiënten, abnormale Ca2 + afgifte, en hartritmestoornissen 8. In overeenstemming met dit concept, hebben we ook aangetoond dat myofilament Ca2 + desensibilisatie bij hypertensieve ratten harten secundair aan de up-regulatie van neuronale stikstofoxidesynthase is geassocieerd met verhoogde diastolische en systolische Ca2 + niveaus11, die op zijn beurt, verhoogt de kwetsbaarheid van de LTCC om Ca2 + -afhankelijke 12 inactivering. Daarom myofilament Ca2 + gevoeligheid is een &quot;actieve&quot; regelaar van intracellulair Ca2 + homeostase en myocyt contractiele functie. Het is noodzakelijk geworden om interacties tussen myofilament en Ca 2+ analyseren de behandeling van eiwitten voor grondig onderzoek van myocyten EG koppeling en hartfunctie. We beschrijven een protocol dat de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid geïsoleerde cardiomyocyten beoordeelt. Uitgebreide analyse van de intracellulaire Ca 2+ profiel, zal myofilament Ca 2+ gevoeligheid en krimp nieuwe mechanismen ontgraven onderliggende myocard mechanica.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 weken</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Verzekeringscode:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 20% solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Chang Shin Scientific</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Software Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental Builder</td><td>Acquisitie en analyse van EC koppelingsgegevens in Myocyten</td></tr><tr><td>Myocyte Calcium &amp; Contractility Recording System</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp; Video Detection</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp; System Interface</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Excitati Lichtbron</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>High intensity ARC Lamp Power supply</td><td>Cairn Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel controller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stimulator</td><td>Medical Systems Corporation</td><td>S-98 Multimode</td><td></td></tr><tr><td>Samenstelling van experimentele oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentratie (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentratie (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentratie (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentratie (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentratie (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentratie (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentratie (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentratie (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentratie (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentratie (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentratie (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentratie (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentratie (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentratie (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentratie (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentratie (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentratie (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentratie (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentratie (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentratie (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentratie (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentratie (mmol) 1.8&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Voor Fura 2AM loading, CaCl2 concentraties zijn 0.25 mM en 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentratie (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentratie (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA oplossing 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentratie (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentratie (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentratie (mmol) 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentratie (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (20mL)</td><td></td><td></td>

beoordeling van myofilament ca<sup&gt; 2+</sup&gt; gevoeligheid onderliggende cardiac excitatie-contractie coupling

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Hartfalen en hartritmestoornissen zijn de belangrijkste oorzaken van sterfte en ziekte wereldwijd. Toch blijft het mechanisme van de pathogenese en myocardiale storing in het zieke hart volledig worden opgehelderd. Recente overtuigend bewijs toont aan dat veranderingen in de myofilament Ca2 + gevoelige invloed intracellulair Ca2 + homeostase en ionkanaal activiteiten in cardiomyocyten, essentiële mechanismen verantwoordelijk voor de cardiale actiepotentiaal en inkrimping van gezonde en zieke harten. Sterker nog, de activiteiten van ionkanalen en transporteurs onderliggende cardiale actiepotentialen (bijvoorbeeld Na +, Ca 2+ en K + kanalen en de Na + -Ca 2+ wisselaar) en intracellulaire Ca 2+ hanteren eiwitten (bijv., Ryanodinereceptor en Ca 2+ -ATPase in sarcoplasmatisch reticulum (SERCA2a) of fosfolamban en de fosforylatie) worden gewoonlijk gemeten evaluat de fundamentele mechanismen van cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling. Zowel elektrische activiteiten in de membraan en intracellulaire Ca2 + veranderingen de triggersignalen van EC koppeling, terwijl myofilament de functionele eenheid van samentrekking en ontspanning en myofilament Ca2 + gevoeligheid noodzakelijk is in de uitvoering van myofibril prestaties. Niettemin weinig studies nemen myofilament Ca2 + gevoeligheid in de functionele analyse van het myocardium tenzij het ​​het focus van de studie. We beschrijven een protocol dat sarcomeer verkorting / re-verlenging en het intracellulaire Ca2 + level behulp Fura-02:00 (ratiometrische detectie) en de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid van cardiale myocyten van ratteharten evalueren meet. Het belangrijkste doel is om te benadrukken dat myofilament Ca 2+ gevoeligheid moet in de EG-koppeling in aanmerking worden genomen voor mechanistische analyse. Uitgebreid onderzoek van de iop de kanalen, ion transporters, intracellulaire Ca 2+ handling en myofilament Ca 2+ gevoeligheid die myocyte contractiliteit in gezonde en zieke harten ten grondslag liggen zal waardevolle informatie voor het ontwerpen van meer effectieve strategieën van translationeel en therapeutische waarde.

LV myocyten zijn geïsoleerd van normale en hypertensieve rat harten. Staafvormige myocyten met duidelijke strepen (die sarcomeren) en stabiele samentrekt ingevolge veldstimulatie worden beschouwd als de optimale myocyten zijn en zijn gekozen voor opname (Figuur 2A). In de in F igure 2A bijvoorbeeld een Fura 02:00-geladen LV myocyten is horizontaal geplaatst en het diafragma van de camera wordt ingesteld dat de myocyten neemt het grootste deel van het vel...

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca2+ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca2+ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de calciumsensitiviteit van myofilamenten om ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de contractie in gezonde en zieke harten te vergroten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot hartstuwing en hartfalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het, samen met ionkanalen, iontransporteurs en intercellulaire calciumhuishouding, een uitgebreid inzicht biedt in het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de contractiliteit van het muizenhart bij een gezond hart en hartziekten.Om met deze procedure te beginnen, worden twee waterbaden verwarmd tot 37 °C. Voeg 5 mL calciumvrije BSA-oplossing toe aan 25 mL collagenase-oplossing één en 3,3 mL calciumvrije BSA-oplossing aan 16,7 mL collagenase-oplossing twee. Voeg vervolgens 100 mL isolatie-oplossing toe aan kolom één en 30 mL collagenase-oplossing één aan kolom twee in het Langendorff-perfusiesysteem.Zet de isolatieoplossing en collagenase-oplossing één in kolom één en kolom twee onder zuurstof via de zuurstofverbinding in het Langendorff-perfusiesysteem. Zet op soortgelijke wijze collagenase-oplossing twee en de BSA-oplo

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Murine linker ventriculaire papillaire spier kan worden gebruikt voor cardiale contractiliteit in vitro onderzoeken. Dit artikel beschrijft in detail de isolatie en experimentele protocollen cardiale contractiele kenmerken te bestuderen.

Samentrekbaarheid Metingen op Geïsoleerde papillairspieren voor onderzoek naar Cardiac inotropie in Muizen

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit protocol is bedoeld om stapsgewijze de techniek van extractie en beoordeling van de hartfunctie te beschrijven met behulp van gevilde cardiomyocyten. Deze methode maakt het mogelijk om de myofilamentfunctie te meten en te acuut temodificeren met kleine bevroren biopsieën die kunnen worden verzameld vanaf verschillende hartlocaties, van muizen tot mannen.

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

We presenteren een protocol voor de evaluatie van de elektromechanische effecten van GtACR1 activering bij konijnencardiomyocyten. We geven gedetailleerde informatie over celisolatie, kweek- en adenovirale transductie, en over functionele experimenten met de patch-clamp en koolstofvezel technieken.

Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Dit protocol presenteert een verzameling sarcomere, calcium en macroscopische geometrische gegevens van een actief samentrekkende cardiale trabecula ex vivo. Deze gelijktijdige metingen worden mogelijk gemaakt door de integratie van drie beeldvormende modaliteiten.

Gelijktijdige Brightfield, Fluorescentie en Optische Coherentie Tomografische Beeldvorming van Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Dit protocol beschrijft hoe contractiliteit in volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van donorharten kan worden gemeten met het MyoBLAZER-systeem, een betrouwbaar platform voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit tijdens preklinische ontwikkeling.

Meting van hartcontractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten

Leer hoe u myofilament Ca2+ gevoeligheid evalueert in cardiomyocyten van ratten met Fura-2 AM en fluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult contractiele veranderingen bij hartfalen en hypertensie.

Beoordeling van Myofilament Ca

Meer video's verkennen