Name: Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Ontdek adenovirale gentherapie voor diabetische keratopathie met menselijke orgaan-gekweekte corneas. Deze methode normaliseert vertraagde wondgenezing en herstelt expressie van epitheliale stamcelmarkers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken voor de financiële ondersteuning van NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI-subsidie UL 1RR033176 (AVL) en subsidies van het Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medisch Centrum.

National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) geleverd goedgekeurde post-mortem gezonde en diabetische menselijke ogen en hoornvliezen. NDRI van menselijk weefsel collectie protocol wordt goedgekeurd door de bestuurlijke commissie en onder voorbehoud van de National Institutes of Health toezicht. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) vrijgestelde protocol EX-1055. Samenwerken hoornvlies chirurgen, Drs. E. Maguen en Y. Rabinowitz, geleverd teruggooi corneoscleral velgen voor de isolatie van stamcellen verrijkt cornea epitheliale culturen. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van het goedgekeurde IRB protocol Pro00019393. 1. Human Cornea orgelcultuur Opmerking: Normaal en diabetische hoornvliezen of hele ogen worden ontvangen in gekoelde cornea opslagmedium (bijv Optisol GS) binnen 48 uur na de dood van de nationale leverancier NDRI. <ol><li> Verwijder de hoornvliezen uit opslagcontainer met een pincet en was ze tweemaal in het antibioticum-antimycoticum (ABAM) mengsel. In het geval van de hele ogen, snijd de hoornvliezen uit de bollen met gebogen schaar. Laat minstens een 5 mm conjunctivale velg en ook de hoornvliezen wassen in ABAM. </li><li> Bereid het mengsel in de cornea concaviteit te plaatsen. Het bestaat uit serumvrij minimaal essentieel medium (MEM) bevattende ABAM, 1 mg / ml kalfshuidcollageen (uit een voorraadoplossing van 10 mg / ml in 0,1 N azijnzuur), 1% agar, en insuline-transferrine-seleniet 7 vullen. </li><li> Magnetron dit mengsel aan de kook voor sterilisatie en agar oplossing. Het kan tot 1 minuut voor alles op te lossen. Laat de buis kap gedeeltelijk open, omdat het mengsel overflows makkelijker als het kookt. Daarom kunnen verschillende kokend cycli nodig, elk voor 10-15 sec. Afkoelen van het mengsel tot 37-39 ° C. </li><li> Plaats de hoornvliezen epitheliale kant naar beneden in steriele 60 mm gerechten. Vul het hoornvlies holte met ongeveer 0,5 ml van de in 1.2 beschreven mengsel. Demengsel stolt op het hoornvlies binnen 2 minuten. </li><li> Plaats de cornea agar beneden in steriele 60-mm schaaltjes en voeg het volledige medium met MEM met ABAM en insuline-transferrine-seleniet supplement 7 (37 ° C) om het niveau bij benadering de limbus voor lucht-vloeistof-grensvlak kweek te houden. Het medium volume 7-8 ml per gerecht. </li><li> De schaaltjes met de cornea in een 5% CO2 incubator bevochtigd met water pan (Aldus wordt vochtigheidsgraad gehouden op of boven 95%) bij 35 ° C (normale temperatuur cornea). Voeg 100 ul medium (twee druppels) per dag op het epitheel van het hoornvlies te bevochtigen. </li><li> Bewaken van de cornea morfologie en de epitheliale cellen levensvatbaarheid microscopisch onder doorvallend licht met een standaard microscoop met een 4X doelstelling. Doe dit een keer per dag. </li><li> Verander het medium elke drie dagen. De cornea kan worden gekweekt gedurende ten minste drie weken. Voor de gentherapie-experimenten, de cultuur van de hoornvliezen voor 3-5 dagen, dan omvormerse met genen van belang (4,1-4,4), laat nog eens 3-5 dagen, afhankelijk van de transgene en onder voorbehoud van de wondgenezing protocol (2,1-2,4). </li></ol> 2. epitheliale wondheling Opmerking: In de diabetische hoornvlies, het epitheel debridement mechanisch schrapen niet toelaat de fragiele epitheliale basismembraan losgemaakt in het proces, dat gebeurt niet in de normale cornea. Dus om de normale en diabetische hoornvliezen onder vergelijkbare wondgenezing te houden, is chemisch verwijderen van het epitheel met n-heptanol 19 gebruikt. Deze procedure verwijdert de epitheel, maar laat achter een intact basaal membraan in zowel de normale en diabetische hoornvliezen. <ol><li> Naar het centrum van epitheliale debridement 20 uit te voeren, plaats een 5 mm filterpapier schijf gedrenkt in n-heptanol op het centrale hoornvlies voorste oppervlak voor 75 sec. </li><li> Verwijder het filter en was de hoornvliezen volledig medium. Vul de holte met 0,5 ml agar-collageenmengsel en cultuur als in 1.4. Na debridement, de epitheelcellen meestal sterven en afwerpen met achterlating van microscopisch intact basaal membraan 7. </li><li> Gebruik 8,5 mm schijven groter epitheliale wonden in de experimenten met enige limbale gentherapie creëren. Dit zal zorgen voor de betrokkenheid van limbale stamcellen in het genezingsproces. </li><li> Bewaken van de cornea genezing microscopisch. Maak foto&#39;s op 4x en 10x per dag tot de epitheeldefect volledig genezen is. Het genezingsproces van 2 tot 15 dagen, afhankelijk van de stand (normale of diabetische) en wondgrootte. Opmerking: Tijdens het genezingsproces, zijn zwarte spin-achtige cellen waargenomen bij de top focal plane. Deze cellen zijn apoptotisch stromale keratocyten dat stierf na de epitheliale verwijdering 4. De genezing volledig is beschouwd, wanneer deze dode cellen overwoekerd door de heling epitheel en niet meer zichtbaar (figuur 2, bijvoegsel). </li><li> na genezingvoltooiing, snijd de hoornvliezen in de helft, insluiten in OCT verbinding en proces voor indirecte immunofluorescentie op cryostaat secties of Western blots 16,21. </li></ol> 3. Isolatie van Limbale Cells en onderhoud van Stem Cell-verrijkte culturen Let op: Bereid de primaire limbale epitheliale stamcellen (LESC) verrijkte culturen uit de corneoscleral velgen. De velgen afkomstig van gezonde donoren en weggegooid na het hoornvlies transplantaties worden ontvangen van de samenwerkende chirurgen in de standaard cornea opslagmedium (bijv Optisol). Anders kan de LESC verrijkte culturen worden verkregen bij de velgen uitgesneden uit normale en diabetische hele hoornvliezen of globes ontvangen van NDRI in de cornea opslagmedium. <ol><li> Als de hele hoornvliezen of bollen worden gebruikt, eerst de limbale gebieden te isoleren. Om dit te doen, plaatst u het hoornvlies op een steriele plastic schaaltje met epitheliale kant op en verwijder het centrale gebied met een 9-mm trephine (ronde hoornvlies mes).Gooi dit centrale deel. accijnzen dan de limbale zone met behulp van een 13 mm trephine en gooi de buitenste conjunctivale deel. Te isoleren cellen gebruiken de bagel-achtige limbale rand. Voordat celisolatie Verwijder de endotheelcellen en hechtende resten van de iris van de binnenzijde van het hoornvlies tegenover het oppervlak epitheel met een steriel wattenstaafje. </li><li> Isoleer limbale cel vellen met behulp van dispase behandeling. Incubeer elk corneoscleral rand met 2,4 U / ml dispase II in 1,5 ml keratinocyt serumvrij medium (KSFM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C gedurende 2 uur 22. </li><li> Deze zachtjes limbale epitheliale cellaag van de velg onder een dissectie stereomicroscoop met een pincet en dissociëren de cellen in 1 ml van 0,25% trypsine - 0,02% EDTA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen in 10 ml medium (bv Epilife) en pellet ze bij 300 g in een tafelmodel centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer the cellen in kweekmedium: medium met N2, B27 en menselijke keratinocytgroeifactor supplementen, en 10 ng / ml epidermale groeifactor (EGF). </li><li> Zaad de cellen bij 3000-5000 cellen / ml in flessen en 60 mm schalen bekleed met een mengsel van menselijke basale membraan proteïnen zoals fibronectine, type IV collageen en laminine (FCL), bij 0,5-1 ug / cm 2, in de KSFM medium. </li><li> De cellen te kweken in een bevochtigde (95% of hogere luchtvochtigheid) CO2 incubator bij 37 ° C tot ze volledig confluente monolagen. Dit kan 1-2 weken duren. Let op: regelmatig de cel identiteit door positieve immunocytochemische kleuring voor vermeende LESC markers waaronder PAX6, keratine (K) 14, K15, K17 en ΔNp63α bevestigen. De kleuring gegevens evenals de primaire antilichamen gepubliceerd 8,16-18,22. </li><li> Om de passage confluente cellen te behandelen met 1 ml 0,05% trypsine-oplossing (1: 5 verdunning van de oplossing 0,25%) gedurende 10 min bij 37 ° C. Voeg 5 ml sojaboon trypsin remmeroplossing (10 mg / ml) verdund 1: 4 in medium en gecentrifugeerd cellen in 3,5. </li><li> Was de celpellet in 3 ml verdund sojaboon trypsineremmer oplossing. Plaat de cellen op FCL-gecoate (zie 3.7) gerechten of glazen kamer dia&#39;s 2 x 10 4 cellen / ml. </li></ol> 4. adenovirale transductie van Organ-gekweekte Corneas Opmerking: De recombinante adenovirussen (AV) bevatten AV-vector (geen geïnsereerd), AV-cMet (met c-met gen open leesraam), AV-shM10 (met shRNA tot MMP-10) en AV-shCF ( met shRNA cathepsine F). Ze zijn E1 / E3 gedeleteerde Type 5 AV expressie van genen onder de controle van de belangrijkste onmiddellijk vroege cytomegalovirus promoter. De AV-cMet virussen worden gegenereerd met behulp van AV vector Pad / CMV / V5-DEST 16. De AV-shRNA virussen zijn op maat gegenereerd door subklonering van shRNA sequenties samen met HH1 promotor en GFP-tag sequentie uit iLenti-EGFP vector in een replicatie-incompetente (-E1 / -E3) Human AV type 5 genoom met behulp van adeno-4 expressie systeem 17. <ol><li> Transduceren ene orgaan gekweekte cornea van elk paar met AV-vector en een hoornvlies, een genexpressie-modulerende AV. Gebruik de AV-cMet bij 0,8-1,25 x 10 8 plaquevormende eenheden (pfu) per cornea in kweekmedium gedurende 48 uur bij 37 ° C houden van de hoornvliezen onder het medium oppervlak elk in een putje van een 24-putjes. Gebruik de AV-shRNA virussen bij 1-2 x 10 8 pfu per hoornvlies. </li><li> Gebruik de virussen voor transductie volledig medium, aangevuld met 75 ug / ml sildenafil citrate. Dit reagens activeert de caveolin transport te vergemakkelijken virale opname door de epitheelcellen 21. Vanwege de korte halfwaardetijd van sildenafil in waterige oplossingen, later opnieuw voeg dezelfde hoeveelheid aan middellange 4-5 uur. De standaardbehandeling voor 48 uur. </li><li> Transfer hoornvliezen om nieuwe gerechten met een ronde uiteinde steriele spatel en cultuur in het medium zonder AV houden van het medium niveau van de limbus. Na de addnele 4-8 dagen aan het vloeistof-lucht, verwerkt de AV-behandelde hoornvliezen van verschillende analyses en testen van epitheliale wondgenezing (zie hierboven). Routinematig bevochtig de hoornvliezen tijdens cultuur door het toevoegen van 100 ul medium (twee druppels) op de top van het hoornvlies. </li><li> Voor de transductie van alleen de limbale cellen, incubeer de virussen met de cornea van het lucht-vloeistof raakvlak met medium niveau de limbus, transductie van de centrale epitheel voorkomen. </li></ol> 5. adenovirale transductie van gekweekte Limbale Cells <ol><li> Handhaaf de LESC verrijkte kweken in het medium met 10 ng / ml EGF (zie 3.5) op plastic schaaltjes bekleed met het FCL mengsel bij 0,5 gg / cm 2. </li><li> Transduceren gekweekte cellen 70-80% confluentie met de AV die het op groen fluorescent eiwitgen (AV-GFP) of AV-gecodeerde shRNA-GFP in verschillende multipliciteit van infectie (MOI: 1-300 pfu / cel) hebben bereikt , in het medium met 2 ng / ml EGF. Voer de transduction gedurende 4 uur bij 37 ° C in een minimaal volume (0,2 ml) gevolgd door 20 uur in 0,5 ml medium. De caveolin transport activator sildenafil is niet nodig voor de celkweek transductie. </li><li> Een van de volgende reagentia die de AV binding aan het celoppervlak vergemakkelijken de AV transductie efficiëntie: of polykationen (1 ug / ml poly-L-lysine of 5 ug / ml polybreen) en 6 ul / ml transductie-reagens ( bijvoorbeeld ViraDuctin) of 20 ul / ml transductie versterker (bijv ibiBoost). </li><li> Na het vervangen van het medium voor het zonder het AV incuberen gekweekte cellen gedurende 4 dagen in de bevochtigde CO2 incubator en beoordelen GFP-expressieniveau met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. </li><li> Gebruik de scratch wondgenezing assay om celmigratie te evalueren in de AV-getransduceerde culturen. Groeien de cellen in de multiwell kamer glijbanen. Maak de wonden in een monolaag door krassen cellen in een rechte lineaire beweging met een 200 pi piPette tip. Na verwonding, verandert het medium voor een frisse ene naar de vrijstaande cellen te verwijderen. </li><li> Fotograferen de wonden elke dag met een digitale camera verbonden met een omgekeerde microscoop bij 4x vergroting. Noteer de tijd dat het genezingsproces voltooid is (de wondranden in contact over de gehele wond). </li></ol>

<ol><li>Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+changes+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diabetes+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal changes in diabetes mellitus.</a> Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).</li>
<li>Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quality+of+the+diabetic+eye%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Optical quality of the diabetic eye: a review.</a> Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).</li>
<li>Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+changes+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22DOS+Times%22%5BJournal%5D)">Corneal changes in diabetes mellitus.</a> DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+matrix+metalloproteinase-10+and+matrix+metalloproteinase-3+in+human+diabetic+corneas%3A+a+possible+mechanism+of+basement+membrane+and+integrin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations.</a> Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+and+growth+factor+alterations+revealed+by+gene+microarray+analysis+of+human+diabetic+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).</li>
<li>Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+diabetic+corneas+preserve+wound+healing%2C+basement+membrane%2C+integrin+and+MMP-10+differences+from+normal+corneas+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture.</a> Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+epithelial+stem+cell+marker+patterns+in+human+diabetic+corneas+and+effects+of+c-met+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy.</a> Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).</li>
<li>Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+epigenetic+modifications+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).</li>
<li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+epithelial+repair%3A+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).</li>
<li>Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).</li>
<li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).</li>
<li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li>
<li>Di Girolamo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+epithelia%3A+Tracking+the+fate+of+mammalian+limbal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells.</a> Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).</li>
<li>Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+wound+healing+and+diabetic+markers+in+organ+cultured+human+diabetic+corneas+by+adenoviral+delivery+of+c-met+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+wound+healing%2C+kinase+and+stem+cell+marker+expression+in+diabetic+organ-cultured+human+corneas+upon+MMP-10+and+cathepsin+F+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).</li>
<li>Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+wound+healing+and+stem+cell+marker+patterns+in+organ-cultured+human+diabetic+corneas+by+gene+therapy+of+limbal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells.</a> Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).</li>
<li>Hatchell, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+epithelial+basement+membrane+in+the+corneas+of+diabetic+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits.</a> Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).</li>
<li>Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+topical+Na-hyaluronan+on+hemidesmosome+formation+in+n-heptanol-induced+corneal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury.</a> Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-driven+overexpression+of+proteinases+in+organ-cultured+normal+human+corneas+leads+to+diabetic-like+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes.</a> Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).</li>
<li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+limbal-derived+induced+pluripotent+stem+cells+into+limbal-like+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).</li>
<li>Funari, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+wound+healing-related+microRNAs+in+the+human+diabetic+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea.</a> PLoS One. 8 (12), e84425(2013).</li>
<li>Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%3A+basic+science+and+translational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy: basic science and translational perspective.</a> Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+tropism+of+adenoviruses+and+adeno-associated+viruses+to+corneal+cells%3A+implications+for+corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy.</a> Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).</li>
<li>Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P38+and+ERK1%2F2+coordinate+cellular+migration+and+proliferation+in+epithelial+wound+healing%3A+evidence+of+cross-talk+activation+between+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades.</a> J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).</li>
<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+p38+MAP+kinase+in+regulation+of+cell+migration+and+proliferation+in+healing+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).</li>
<li>Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+suppresses+epidermal+growth+factor+receptor%2Fphosphatidylinositol+3-kinase%2FAkt+signaling+pathway+and+attenuates+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing.</a> Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).</li>
<li>Xu, K., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+epithelial+wound+healing+and+EGFR+signaling+pathways+in+the+corneas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).</li>
<li>Takamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldose+reductase+inhibitor+counteracts+the+enhanced+expression+of+matrix+metalloproteinase-10+and+improves+corneal+wound+healing+in+galactose-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats.</a> Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).</li>
<li>Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibition+improves+corneal+epithelial+innervation+and+wound+healing+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).</li>
<li>Deng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+limbal+stem+cell+deficiency+by+in+vivo+laser+scanning+confocal+microscopy%3A+a+microstructural+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach.</a> Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).</li>
<li>Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+morphology+of+the+limbal+palisades+of+Vogt+correlates+with+progressive+stem+cell+deficiency+in+aniridia-related+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen financiële belangen te hebben.

De cornea lijkt een ideale weefsel voor gentherapie vanwege zijn oppervlak plaats waar de genafgifte, alsmede de evaluatie van de werkzaamheid en bijwerkingen, zijn eenvoudig. Echter, een klinische vertaling van deze krachtige aanpak is nog steeds traag vanwege de schaarse informatie over de genetische oorzaken van het hoornvlies ziekten en de gentherapie targets 24. Diabetische complicaties met inbegrip van de cornea veranderingen kunnen grotendeels epigenetische in de natuur, wat zich vertaalt in metabole g...

De diabetische hoornvlies ziekte resulteert voornamelijk in degeneratieve epitheliale (keratopathie) en zenuwen (neuropathie) verandert. Het wordt vaak tot uiting door de afwijkingen van epitheliale wondgenezing en het hoornvlies zenuwen reductie 1-4. Naar schatting 60-70% diabetici hebben verschillende hoornvlies problemen 1,3. Onze studies hebben verschillende merker eiwitten geïdentificeerd met veranderde expressie in humane diabetische cornea waaronder de neerwaartse regulatie van c-met proto-oncogen (hepatocyt groeifactor receptor) en opregulatie van matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F 5, 6. we hebben ook aanzienlijk gedocumenteerd verminderde expressie van verscheidene mogelijke epitheliale stamcel markers in het menselijk hoornvlies diabetes. In de eerdere studies hebben we een op adenovirale gentherapie om de niveaus van door diabetes veranderde merkers genormaliseerd met menselijke diabetische hoornvlies orgaancultuur, dat langzaam wondgenezing toont ontwikkeld diabetischemarker veranderingen, en stamcel marker expressie verlaging vergelijkbaar met de ex vivo hoornvliezen 7,8. Deze aanhoudende veranderingen blijkt door de aanwezigheid van epigenetische metabole geheugen 9 te zijn. Deze cultuur systeem werd verder gebruikt voor gentherapie. De doelstellingen van deze therapie zijn gekozen markers met hetzij verminderde expressie in diabetische cornea (c-met proto-oncogen), of verhoogde expressie (MMP-10 en cathepsine F). De adenovirale (AV) therapie werd gebruikt in de hele orgaan- gekweekte cornea of ​​corneoscleral perifere limbale enkel compartiment. Dit compartiment herbergt epitheliale stamcellen die het hoornvliesepitheel te vernieuwen en actief deelnemen aan de wondgenezing 4,10-15. Hier worden protocollen die voor het normaal en diabetische menselijk hoornvlies orgelcultuur, epitheliale wondgenezing, isolatie en karakterisering van stamcellen verrijkt limbale celculturen en adenovirale cel en hoornvlies transductie. Onzeresultaten laten de haalbaarheid van deze therapie voor het normaliseren markerexpressie en wondgenezing bij diabetische cornea voor mogelijke toekomstige transplantatie. Ze suggereren ook dat de combinatietherapie is de meest doeltreffende manier om normale merkerpatroon en epitheliale genezing herstellen bij diabetici cornea 16-18.

<table><tbody><tr><td>minimum essential medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Optisol-GS&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>50006-OPT</td><td></td></tr><tr><td>ABAM antibiotic-antimycotic mixture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>calf skin collagen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>agar, tissue culture grade</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>n-heptanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72954-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>keratinocyte serum-free medium (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife medium with calcium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>N2 medium supplement, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 medium supplement, 50x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>human keratinocyte growth supplement, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>trypsin 0.25% with phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>soybean trypsin inhibitor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>insulin-transferrin-selenite supplement (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>antibody to keratin 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>antibody to keratin 15</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47697</td><td></td></tr><tr><td>antibody to keratin 17</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-58726</td><td></td></tr><tr><td>antibody to &Delta;Np63&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8609</td><td></td></tr><tr><td>antibody to PAX6</td><td>BioLegend</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>antibody to nidogen-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2570</td><td></td></tr><tr><td>antibody to integrin &alpha;3&beta;1</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1992</td><td></td></tr><tr><td>human fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>human laminin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4445</td><td></td></tr><tr><td>human type IV collagen</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C6745-1ML</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus expressing MMP-10 shRNA</td><td>Capital BioSciences</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus expressing cathepsin F shRNA</td><td>Capital BioSciences</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP</td><td>Capital BioSciences</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus expressing c-met</td><td>OriGene (plasmid)</td><td>SC323278</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus expressing GFP</td><td>KeraFAST</td><td>FVQ002</td><td></td></tr><tr><td>sildenafil citrate, 25 mg</td><td>Pfizer</td><td>from pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>ViraDuctin</td><td>Cell Biolabs</td><td>AD-200</td><td></td></tr><tr><td>ibiBoost</td><td>ibidi, Germany</td><td>50301</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Corning round end spatula&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6807</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pipet tips</td><td>Bioexpress</td><td>P-1233-200</td><td>other suppliers available</td></tr><tr><td>inverted microscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Diaphot</td><td>other suppliers/models available</td></tr><tr><td>humidified CO2 incubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370 (Steri-Cycle)</td><td>other suppliers/models available</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>BX-40</td><td>other suppliers/models available</td></tr><tr><td>dissecting stereo microscope</td><td>Leica, Germany</td><td>S4 E</td><td>other suppliers/models available</td></tr></tbody></table>

adenovirale gentherapie voor diabetische keratopathie: effecten op wondgenezing en stem cell marker expressie in human organ-gekweekte corneas en limbale epitheelcellen

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Het doel van dit protocol is om moleculaire veranderingen te beschrijven in menselijke diabetische hoornvliezen en laten zien hoe ze kunnen worden ondervangen door adenovirale gentherapie in orgel-gekweekte hoornvliezen. De diabetische corneale ziekte een complicatie van diabetes met frequente afwijkingen hoornvlies zenuwen en epitheliale wondgenezing. We hebben ook gedocumenteerd significant veranderd uitdrukking van een aantal vermeende epitheliale stamcellen markers in menselijke diabetische hoornvliezen. Om deze veranderingen te verlichten, werd adenovirale gentherapie succes uitgevoerd volgens de opregulatie van c-met proto-oncogen expressie en / of neerwaartse regulatie van proteasen matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F. Deze therapie versnelde wondgenezing bij diabetische hoornvliezen zelfs wanneer alleen de limbale stamcel compartiment werd getransduceerd. De beste resultaten werden verkregen met gecombineerde behandeling. Voor mogelijke patiënt transplantatie van stamcellen genormaliseerd, wordt ook een voorbeeld gegeven van de optimizatiop van gen transductie in stamcel-verrijkte culturen met behulp van polykationische enhancers. Deze benadering kan niet alleen nuttig zijn voor de geselecteerde genen maar ook voor de andere mediatoren van corneale epitheliale wondgenezing en stamcel functie.

We hebben eerder aangetoond dat de cornea orgaankweken de verschillen in de expressie van diabetische markers (bijv kelder membraaneiwitten en α3β1 integrine) en wondgenezing tussen de normale en diabetische hoornvliezen worden bewaard. Dit kweeksysteem werd onderworpen aan gentherapie gericht op het normaliseren van de niveaus van diabetes veranderd markers, c-Met, MMP-10 en cathepsine F. Wanneer de gehele hoornvlies...

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om moleculaire veranderingen in menselijke diabetische cornea's te beschrijven en aan te tonen hoe deze in organo-gecultiveerde cornea's kunnen worden verlicht door adenovirale gentherapie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van het diabetische hoornvlies, zoals welke moleculaire veranderingen ten grond liggen aan de vertraagde diabetische epitheliale wondgenezing en de abnormale expressie van epitheliale SEM SEM-moleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het testen mogelijk maakt van gentherapie-benaderingen die gericht zijn op diverse mediatoren van de epitheliale wondgenezing van het hoornvlies en de stamcelfunctie in organo-gecultiveerde cornea's.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van andere hoornvliesziekten die verband houden met stamceldysfunctie, aangezien we de geldigheid van de methode voor het normaliseren van ultradiabetische hoornvliesstamcellen hebben aangetoond. Plaats de hoornvliezen met de epithelzijde naar beneden in steriele schalen van 60 millimeter en vul de holte met 0,5 milliliters agar-collageenmengsel. Het

adenoviral-gene-therapy-for-diabetic-keratopathy-effects-on-wound

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van de pathofysiologie van proliferatieve diabetische retinopathie met behulp van patiënt-afgeleide, operatief verwijderd, fibrovascular weefsels voor driedimensionale inheemse karakterisering en ex vivo weefselkweek. Dit ex vivo cultuur model is ook vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.

Een Ex Vivo weefselkweek Model voor Fibrovascular complicaties in proliferatieve diabetische retinopathie

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Ontdek adenovirale gentherapie voor diabetische keratopathie met menselijke orgaan-gekweekte corneas. Deze methode normaliseert vertraagde wondgenezing en herstelt expressie van epitheliale stamcelmarkers.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen (Video) | JoVE Journal

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Meer video's verkennen