Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System
August 8th, 2016
Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).
Het algemene doel van deze methodologie is om meerdere enzymen te evalueren met behulp van een enkel high-throughput screeningsysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie en bio-engineering over metagenomisch screening en enzymengineering. We hebben een genetisch enzymscreeningsysteem ontwikkeld dat bestaat uit de MPL-mutant die reageert op fenyleenverbindingen en de downstream GFP-reporter.
Zodra een metagenomisch gen de enzymactiviteit toont die voor ons interessant is door te reageren met het aangeboden substraat, activeert een fenyleenverbinding van het reactieproduct de Dmp-mutant en activeert de GFP-reporterexpressie, die gemakkelijk kan worden vastgelegd door een fluorescentiemeter. Het grote voordeel van deze techniek is dat, in tegenstelling tot conventionele screeningtechnieken, deze enkele methode kan worden toegepast voor het screenen van meerdere soorten verschillende enzymen door het juiste substraat te gebruiken. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Kil Koang Kwon, een afgestudeerde student in ons laboratorium.
Na het construeren van een metagenomische bibliotheek in E.Coli met een fosmidvector met behulp van een fosmidbibliotheekproductiekit, transporteer je het pGESS(E135K)DNA naar de metagenomische bibliotheekcellen. Bewaar vervolgens de getransformeerde bibliotheekcellen bij min 70 graden Celsius en in 20 microliter aliquots. Om de valse positieven te verwijderen, ontdooi je eerst een aliquot van de metagenomische bibliotheekcel op ijs.
Vervolgens inoculeert u tien microliter van de ontdooide cellen in twee milliliter lysogeenaarde bevattende ampicilline en chlooramfenicol in een ronde bodembuis van 14 milliliter bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende vier uur. Ondertussen stel je de juiste parameters in op de FACS-machine voor het lezen van de metagenomische bibliotheekcellen in de standaard FACS-software. Aan het einde van de incubatie, breng je vijf microliter cellen over in één milliliter PBS in een ronde bodembuis van vijf milliliter.
Laad vervolgens het verdunde bibliotheekmonster en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 1500 gebeurtenissen per seconde. Om een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log-geschaald zijverstrooiingsoppervlak verspreidingsplot op een Global Worksheet te genereren, creëer je een dot-plot en teken je een polygoongat rond de enkele gebeurtenissen die de bacteriepopulatie bevatten. Om een celtelling versus log-geschaald FITC-gebied histogram te plotten, open je een histogram en pas je de FITC-spanning aan zodat de piek van de klokvormige verdeling minder dan tien tot de twee van het FITC-gebied is.
Vervolgens open je een andere dot-plot om een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log FITC-gebied plot te maken en stel je een R2-sorteringsgat in tussen plus vijf en min vijf procent van de cellen vanuit het centrum van de verdeling. Wanneer alle poorten zijn ingesteld, plaats je een verzamelbuis met 1,2 milliliter antibioticum aangevuld lysogeenaarde bij de uitlaat van de FACS-instrument en sorteer je eenmaal tien tot de zesde van de poorten cellen in de bouillon. Aan het einde van de sorteerprocedure, sluit je de verzamelbuis af en roer je voorzichtig de cellen door.
Om de metagenomische enzymen van belang te screenen, incubeer je de gesorteerd cellen bij 37 graden Celsius en 200 RPM tot de OD600 0,5 bereikt, voeg je vervolgens één microliter van de kopie-inductieoplossing toe om het intracellulaire fosmid-kopienummer te versterken. Na drie uur bij 37 graden Celsius en 250 RPM, combineer je 0,5 milliliter van de cellen met het juiste substraat in een ronde bodembuis van 14 milliliter tot een eindconcentratie van 100 micromolar. Vervolgens incubeer je de controle- en experimentele monsters bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende nog eens drie uur.
Terwijl de monsters schudden, stel je de FACS-machineparameters in zoals net gedemonstreerd. Vervolgens voeg je vijf microliter cellen van elk monster toe aan afzonderlijke ronde bodembuizen van vijf milliliter die elk een milliliter PBS bevatten. Laad vervolgens de monstercellen en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde.
Maak een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log-geschaald zijverstrooiingsoppervlak verspreidingsplot en pas de R1-verspreidingspoort aan om de enkele gebeurtenis bacteriecellen te omvatten. Creëer vervolgens een log-geschaald voorwaarts verstrooiing versus log-geschaald FITC-gebied verspreidingsplot en stel een R2-sorteringspoort in zodat minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd. Laad vervolgens de monsterbuis en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde, indien nodig.
Plaats vervolgens een verzamelbuis met 0,5 milliliter lysogeenaarde bij de uitlaat van de FACS-instrument en verzamel eenmaal tien tot de vierde van de cellen binnen de R1- en R2-gates. Wanneer alle cellen zijn geïsoleerd, sluit je de verzamelbuis af en roer je voorzichtig de cellen door. Verspreid vervolgens 0,5 milliliter van de verzamelde monsters op twee agarplaten van 90 millimeter bevattende lysogeenaarde aangevuld met antibiotica en incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius.
In deze figuur wordt het gedemonstreerde screeningprotocol geïllustreerd, inclusief de verwijdering van de valse positieven door negatieve sortering, en de selectie van de positieve hits met behulp van de R1 en R2 sorteerpoorten. De hits kunnen vervolgens worden geëvalueerd door de monsterfluorescentie te vergelijken met en zonder het substraat. In deze representatieve p-nitrofenolacetaat gemedieerde screening was de fluorescentie van de met substraat behandelde cellen hoger dan die van de controlecellen, waardoor vijf lipasekandidaten in dit experiment werden bevestigd.
Het is belangrijk om te onthouden dat deze techniek kan worden toegepast op het screenen van een breed scala aan enzymen door een geschikt substraat en een rationconcentratie te kiezen. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals next generation sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de identificatie en karakterisering van de enzymkandidaat
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie introduceert een high-throughput screeningmethode die gebruikmaakt van een universeel genetisch enzymscreeningsysteem dat in staat is om meer dan 200 enzymen te beoordelen. Het systeem identificeert verschillende enzymen, waaronder lipase, cellulase en alkalische fosfatase, door het gebruikte substraat te wijzigen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Enzymengineering
- Microbiële biotechnologie
- Metagenomische screening
Achtergrond
- High-throughput screening is essentieel voor het evalueren van enzymactiviteit.
- Traditionele methoden vereisen vaak aparte systemen voor verschillende enzymen.
- Deze studie heeft tot doel het screeningproces te stroomlijnen.
- Het gebruik van één systeem kan de efficiëntie in enzymonderzoek verbeteren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het tegelijkertijd screenen van meerdere enzymen.
- Om onderzoek in enzymengineering en metagenomica te vergemakkelijken.
- Om een efficiënter alternatief te bieden voor conventionele screeningtechnieken.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een genetisch enzymscreeningsysteem.
- Gebruik van een fenyleenverbinding en GFP-reporter voor detectie.
- Screening van enzymen door het substraat te wijzigen.
- Meting van fluorescentie om enzymactiviteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van lipase, cellulase en alkalische fosfatase.
- De veelzijdigheid van het screeningsysteem werd aangetoond.
- Er werd aangetoond dat de methode kan worden toegepast op verschillende enzymen.
- De effectiviteit van het gebruik van één systeem voor meerdere enzymen werd gevalideerd.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de efficiëntie van enzymscreening aanzienlijk.
- Deze aanpak kan het onderzoek in enzymengineering bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere metagenomische studies omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput genetic enzyme screening enables rapid functional interrogation of metagenomic libraries, supporting early-stage discovery and target validation in enzyme engineering. The universal applicability of the GESS platform streamlines the identification of diverse enzymatic activities, reducing biological ambiguity and accelerating portfolio triage. This approach enhances predictive confidence at the inflection point between discovery and lead identification for biocatalyst development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional screening of metagenomic libraries for novel enzyme activities.
- Supports biological de-risking by linking substrate conversion to quantifiable fluorescence signals.
- Facilitates rapid triage of candidate enzymes for downstream validation.
- Improves predictive confidence in target selection by isolating active clones based on substrate specificity.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput workflow for multi-enzyme screening using flow cytometry.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP fluorescence linked to enzymatic activity.
- Enables scalable screening of large metagenomic libraries with minimal assay redesign.
- Prepares validated enzyme candidates for further biochemical and genetic characterization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enzyme discovery with translational workflows by enabling rapid identification of biocatalysts for industrial or therapeutic applications.
- Supports continuity from functional screening to gene identification and in vitro validation.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming activity in relevant biological systems early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening system integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless progression from metagenomic library construction to candidate selection and downstream validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening by linking substrate turnover to fluorescence-based detection.
- Screening: Delivers robust, quantitative outputs suitable for comparative analysis across enzyme classes.
- Analytics: Provides flow cytometry-based statistical outputs for confident hit selection and false positive exclusion.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from discovery to preclinical enzyme characterization when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to a wide range of enzyme targets by substrate selection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales enzyme screening workflows for reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation in enzyme discovery portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme candidates for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metagenomic library construction and flow cytometry operation.
- Demands access to FACS instrumentation and fluorescence detection infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and substrate selection.
- Adaptable to diverse enzyme classes by modifying substrate inputs and detection thresholds.
- Dependent on robust negative and positive control design to minimize false positives.
