Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Het algemene doel van deze methodologie is om meerdere enzymen te evalueren met behulp van een enkel high-throughput screeningsysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie en bio-engineering over metagenomisch screening en enzymengineering. We hebben een genetisch enzymscreeningsysteem ontwikkeld dat bestaat uit de MPL-mutant die reageert op fenyleenverbindingen en de downstream GFP-reporter.

Zodra een metagenomisch gen de enzymactiviteit toont die voor ons interessant is door te reageren met het aangeboden substraat, activeert een fenyleenverbinding van het reactieproduct de Dmp-mutant en activeert de GFP-reporterexpressie, die gemakkelijk kan worden vastgelegd door een fluorescentiemeter. Het grote voordeel van deze techniek is dat, in tegenstelling tot conventionele screeningtechnieken, deze enkele methode kan worden toegepast voor het screenen van meerdere soorten verschillende enzymen door het juiste substraat te gebruiken. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Kil Koang Kwon, een afgestudeerde student in ons laboratorium.

Na het construeren van een metagenomische bibliotheek in E.Coli met een fosmidvector met behulp van een fosmidbibliotheekproductiekit, transporteer je het pGESS(E135K)DNA naar de metagenomische bibliotheekcellen. Bewaar vervolgens de getransformeerde bibliotheekcellen bij min 70 graden Celsius en in 20 microliter aliquots. Om de valse positieven te verwijderen, ontdooi je eerst een aliquot van de metagenomische bibliotheekcel op ijs.

Vervolgens inoculeert u tien microliter van de ontdooide cellen in twee milliliter lysogeenaarde bevattende ampicilline en chlooramfenicol in een ronde bodembuis van 14 milliliter bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende vier uur. Ondertussen stel je de juiste parameters in op de FACS-machine voor het lezen van de metagenomische bibliotheekcellen in de standaard FACS-software. Aan het einde van de incubatie, breng je vijf microliter cellen over in één milliliter PBS in een ronde bodembuis van vijf milliliter.

Laad vervolgens het verdunde bibliotheekmonster en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 1500 gebeurtenissen per seconde. Om een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log-geschaald zijverstrooiingsoppervlak verspreidingsplot op een Global Worksheet te genereren, creëer je een dot-plot en teken je een polygoongat rond de enkele gebeurtenissen die de bacteriepopulatie bevatten. Om een celtelling versus log-geschaald FITC-gebied histogram te plotten, open je een histogram en pas je de FITC-spanning aan zodat de piek van de klokvormige verdeling minder dan tien tot de twee van het FITC-gebied is.

Vervolgens open je een andere dot-plot om een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log FITC-gebied plot te maken en stel je een R2-sorteringsgat in tussen plus vijf en min vijf procent van de cellen vanuit het centrum van de verdeling. Wanneer alle poorten zijn ingesteld, plaats je een verzamelbuis met 1,2 milliliter antibioticum aangevuld lysogeenaarde bij de uitlaat van de FACS-instrument en sorteer je eenmaal tien tot de zesde van de poorten cellen in de bouillon. Aan het einde van de sorteerprocedure, sluit je de verzamelbuis af en roer je voorzichtig de cellen door.

Om de metagenomische enzymen van belang te screenen, incubeer je de gesorteerd cellen bij 37 graden Celsius en 200 RPM tot de OD600 0,5 bereikt, voeg je vervolgens één microliter van de kopie-inductieoplossing toe om het intracellulaire fosmid-kopienummer te versterken. Na drie uur bij 37 graden Celsius en 250 RPM, combineer je 0,5 milliliter van de cellen met het juiste substraat in een ronde bodembuis van 14 milliliter tot een eindconcentratie van 100 micromolar. Vervolgens incubeer je de controle- en experimentele monsters bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende nog eens drie uur.

Terwijl de monsters schudden, stel je de FACS-machineparameters in zoals net gedemonstreerd. Vervolgens voeg je vijf microliter cellen van elk monster toe aan afzonderlijke ronde bodembuizen van vijf milliliter die elk een milliliter PBS bevatten. Laad vervolgens de monstercellen en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde.

Maak een log-geschaald voorwaarts verstrooiingsoppervlak versus log-geschaald zijverstrooiingsoppervlak verspreidingsplot en pas de R1-verspreidingspoort aan om de enkele gebeurtenis bacteriecellen te omvatten. Creëer vervolgens een log-geschaald voorwaarts verstrooiing versus log-geschaald FITC-gebied verspreidingsplot en stel een R2-sorteringspoort in zodat minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd. Laad vervolgens de monsterbuis en pas de gebeurtenissnelheid aan tot 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde, indien nodig.

Plaats vervolgens een verzamelbuis met 0,5 milliliter lysogeenaarde bij de uitlaat van de FACS-instrument en verzamel eenmaal tien tot de vierde van de cellen binnen de R1- en R2-gates. Wanneer alle cellen zijn geïsoleerd, sluit je de verzamelbuis af en roer je voorzichtig de cellen door. Verspreid vervolgens 0,5 milliliter van de verzamelde monsters op twee agarplaten van 90 millimeter bevattende lysogeenaarde aangevuld met antibiotica en incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius.

In deze figuur wordt het gedemonstreerde screeningprotocol geïllustreerd, inclusief de verwijdering van de valse positieven door negatieve sortering, en de selectie van de positieve hits met behulp van de R1 en R2 sorteerpoorten. De hits kunnen vervolgens worden geëvalueerd door de monsterfluorescentie te vergelijken met en zonder het substraat. In deze representatieve p-nitrofenolacetaat gemedieerde screening was de fluorescentie van de met substraat behandelde cellen hoger dan die van de controlecellen, waardoor vijf lipasekandidaten in dit experiment werden bevestigd.

Het is belangrijk om te onthouden dat deze techniek kan worden toegepast op het screenen van een breed scala aan enzymen door een geschikt substraat en een rationconcentratie te kiezen. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals next generation sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de identificatie en karakterisering van de enzymkandidaat