Name: Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer een universeel genetisch enzymscreeningsysteem voor hoge doorvoer om lipase, cellulase en alkalische fosfatase te identificeren via substraatwisseling. Deze methode verhoogt de efficiëntie in enzymtechniek en metagenomisch onderzoek aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), het Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 en het KRIBB Research Initiative Program.

1. Voorbereiding van de Metagenomic Bibliotheek met PNP GESS <ol><li> De bouw van een metagenomic bibliotheek in E. coli met gebruikmaking van een vector fosmid fosmid bibliotheek productie kit volgens de fabrikant protocol 5. </li><li> Aliquot 100 ul van de bibliotheek voor opslag bij -70 ° C, hetgeen een bron van metagenomic bibliotheek cellen. Opmerking: De optische dichtheid van een monster gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD 600) van deze bibliotheek stock ongeveer 100. </li><li> Ontdooien 100 pl van de stock metagenomic bibliotheek op ijs en beënt in een kolf van 500 ml bevattende 50 ml Luria-Bertani (LB) en 12,5 ug / ml chlooramfenicol gevolgd door 37 ° C incubatie gedurende 2 uur. </li><li> Oogst de cellen in een 50 ml conische buis door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet snel in 50 ml ijskoud gedestilleerd water (DW) en gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C weer. </li><li> Resuspend de pellet in 50 ul ijskoude DW met 10% (v / v) glycerol. Gebruik 50 gl van deze cel aliquot voor elektroporatie. </li><li> Plaats het mengsel van elektrocompetente cellen 50 pl en pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in een ijskoude elektroporatie cuvette en electroporate (1,8 kV / cm, 25 uF) het mengsel. </li><li> Snel voeg 1 ml super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium en resuspendeer de cellen voorzichtig. </li><li> Breng de cellen in 14 ml ronde bodem buis met behulp van een pipet en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Spread 500 ul van de cellen teruggewonnen op een LB 20 x 20 cm vierkante plaat met 12,5 ug / ml chloramfenicol en 50 ug / ml ampicilline. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 12 uur. </li><li> Schraap de kolonies met behulp van een cel schraper en het verzamelen van de cellen in een 50 ml conische buis met behulp van ijskoude cel opslagmedia. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude cel opslagmediaom een OD 600 te bereiken van 100. </li><li> Aliquot 20 ul van de cellen voor opslag bij -70 ° C. </li></ol> 2. Het verwijderen van valse meldingen van de Metagenomic Library <ol><li> Ontdooi de voorraad metagenomic bibliotheek cellen (vanaf stap 1,13) dat metagenomic DNA fosmid en pGESS (E135K) op ijs. </li><li> Inoculeer 10 ul van de cellen in 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol in een 14-ml ronde bodem buis. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm gedurende 4 uur. </li><li> Ondertussen zet de FACS machine en open de standaard FACS software. Gebruik de volgende instellingen: nozzle tip diameter, 70 micrometer; Forward Scatter Area (FSC-A) gevoeligheid, 300 V-logaritmische versterking; Side Scatter Area (SSC-A) gevoeligheid, 350 V-logaritmische versterking; Fluoresceïneisothiocyanaat Area (FITC-A) gevoeligheid, 450 V-logaritmische versterking; drempel parameter, FSC-A waarde 5. Opmerking: Typisch instellingen worden gegevenvoor FACS in de tabel van Materialen genoemd apparaat. Pas de instellingen voor andere FACS apparaten. </li><li> Verdun het metagenomic bibliotheek cellen uit stap 2.2 door toevoeging van 5 ul van het monster op een 5-ml ronde bodem buis met 1 ml PBS. </li><li> Leg het verdunde bibliotheek monster op de laad-poort van de FACS instrument en klik op de knop Load op de Overname Dashboard van de FACS software. </li><li> Pas de incidentie tot 1.000 - 1.500 evenementen / sec door te klikken en regelen van het debiet knoppen op het dashboard. </li><li> Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald SSC-A scatter plot op een wereldwijde werkblad door te klikken op de Dot Plot-knop in de werkbalk. Pas de scatter poort R1 aan de singlet evenementen (bacteriële populatie) met de Polygon Gate knop in de werkbalk te omvatten. </li><li> Plot een histogram met celgetal vs. log geschaald FITC-A op het werkblad door te klikken op de knop Histogram. Dan pas de FITC spanning van de Cytometab ter instellingen op het infovenster controle zodanig dat de piek van de klokvormige verdeling kleiner dan 10 2 van FITC-A. </li><li> Maak een log geschaald FSC-A vs. de log-FITC Een perceel door te klikken op de Dot Plot-knop op de wereldwijde werkblad. Stel een sortering poort R2 op perceel via de veelhoek Gate knop op de werkbalk zodat de poort zich tussen + 5% en -5% van de cellen van het centrum van de verdeling (totaal 10% cellen rond de piek van de bell- vormige curve). </li><li> Plaats een verzamelbuis met 1,2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 6 cellen die zowel aan de R1 en R2 poorten. </li><li> Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex. </li></ol> 3. Metagenomic Enzyme Screening <ol><li> Incubeer de gesorteerde cellen (uit stap 2,11) bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de OD600 0,5 bereikt. </li><li> Voeg 1 ui kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. </li><li> Cellen voorbereiden voor het sorteren, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen en een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, p-nitrofenyl-β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) in een 14 ml rondbodem buis bij een eindconcentratie van 100 uM. <ol><li> Een controlemonster, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen uit stap 3.2 in een 14-ml ronde bodem buis. Voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 3,3. </li></ol></li><li> Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur. </li><li> Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als stap 2.3. </li><li> Voeg 5 ul van de cellen (voor het sorteren) en controlecellen twee 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk. </li><li> Plaats de buis met controlecellen op thij het laden haven van de FACS en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Stel de gebeurtenis Rate 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het beheersen van Flow Rate knoppen op het dashboard. </li><li> Maak log schaal FSC-A versus log schaal SSC-A scatterplot op de pagina puntenplot knop op de globale werkblad van de software en stel de spreiding poort R1 de singlet gebeurtenissen omvatten (bacteriepopulatie) via de veelhoek Gate knop op de werkbalk. </li><li> Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald FITC-A scatterplot door te klikken op de Dot Plot-knop op het werkblad en stel een sortering poort R2 op het perceel met de Polygon Gate knop op de werkbalk, zodat er minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd binnen de R2 gate. </li><li> Vervang de monsterbus met de sortering monsterbuis en stel de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het regelen van het debiet knoppen op het dashboard. </li><li> Leg een verzameling buis met 0,5ml LB bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 4 cellen die voldoen aan zowel de R1 en R2 poorten. Opmerking: De sorteercriterium kan van boven 0,1% tot 5% van FITC-A variëren in de R2 gate. In dit protocol werden de top 1% van de cellen verzameld als positieven. </li><li> Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex. </li><li> Spreid de 0,5 ml verzamelde monsters op twee agarplaten (90 mm petrischalen) bevattende LB, 50 ug / ml ampicilline, 12,5 ug / ml chlooramfenicol en incubeer de plaat bij 37 ° C overnacht. </li><li> Voer zo nodig extra ronden van het sorteren voor FITC-A verrijking door het herhalen van Steps 3,1-3,14. </li></ol> 4. Hit Selection en enzymactiviteit Bevestiging <ol><li> Flowcytometrieanalyse <ol><li> Uit de bebroede plaat bij stap 3.14, selecteer een kolonie toont geen fluorescentie met behulp van een kolonie picker onder de observatie van 488 nm golflengte van een LED-verlichting. </li><li> Inoculeer de geselecteerde kolonie in een 14-ml ro-und bodem buis met 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de OD600 0,5 bereikt. </li><li> Voeg 2 pl kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. </li><li> Bereid een 14 ml rondbodem buis en voeg 1 ml van de gekweekte cellen (stap 4.1.3). Voeg een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, blz -nitrophenyl- β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) bij een uiteindelijke concentratie van 100 uM. <ol><li> Voor een controle, voeg 1 ml gekweekte cellen uit stap 4.1.3 in een 14 ml rondbodem buis en voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 4.1.4. </li></ol></li><li> Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur. </li><li> Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als Step 2.3. </li><li> Voeg 5 ul van de controle- en behandelde substraat cellen 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk. </li><li> Plaats de buis met controle cellen op de laadhaven van de FACS apparaat en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard. </li><li> Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A. </li><li> Vervang de monsterbus met het substraat behandelde monster buis. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard. </li><li> Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A. </li><li> Vergelijk de fluorescentie van beide groepen van cellen door het uitzetten van een histogram van het aantal cellen versus de log schaal FITC-A. </li></ol></li><li> Andere assays voor enzymactiviteit bevestigen <ol><li> Voor verdere identificatie van de geselecteerde kandidaten enzym, extraheren fosmid DNA met behulp van standaard-extractie proprocedures van het commerciële kits extractie en analyse van de nucleotidesequentie of de in vitro enzymactiviteit 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+screening+methods-biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li>
<li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li>
<li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li>
<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40(2012).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li>
<li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li>
<li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts%3A+application+and+engineering+for+industrial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Crc.+Cr.+Rev.+Biotechn%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li>
<li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-induced+gene+expression%2C+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li>
<li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+bio-transformations+with+%C3%A0+la+carte+genetic+traps%3A+translating+dehydrochlorination+of+lindane+%28gamma-hexachlorocyclohexane%29+into+lacZ-based+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li>
<li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li>
<li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het verhogen van de productie-efficiëntie van biokatalysatoren is een sleutel voor het succes van de bio-chemische gebaseerde industrie 9 en metagenoom wordt beschouwd als een van de beste natuurlijke enzym bron. In dit opzicht is het essentieel om screening nieuwe enzymen van de metagenoom waarbij meeste genetische middelen niet onderzocht 10. Verschillende screeningswerkwijzen ontwikkeld die direct detecteren enzymproducten via transcriptionele activators 11, 12 maar deze technieken ve...

Een recent ontwikkelde high-throughput assay eencellige techniek maakt nieuwe enzymen te screenen van een grote bibliotheek genetische basis van hun functionele activiteiten 1. Bij de enkele cel niveau worden eiwitten die transcriptie gebruikt voor reportergenexpressie te activeren door het aftasten van kleine moleculen die worden geproduceerd als gevolg van een doel enzymactiviteit. Een eerste benadering betrof de isolatie van een fenol-afbrekende operon van Ralstonia eutropha E2 met de substraat-geïnduceerde genetische expressiescreenen (SIGEX) methode, waarbij het ​​substraat induceert de expressie van een reporter proteïne 2. Nhar van Pseudomonas putida werd gebruikt om benzaldehyde dehydrogenase 3 selecteren en LysG van Corynebacterium glutamicum werd gebruikt voor high-throughput screening van een nieuwe-L-lysine producerende stam van diverse mutante bibliotheken 4. Voorheen, een genetische enzym screening systeem (GESS) werd voorgesteld als een algemeen geldend screening platform 5. Dit systeem maakt gebruik van de met fenol herkennen dimethylfenol regulator DMPr, P. putida. DMPr (E135K) en een mutant van DMPr, kan ook worden toegepast in GESS (pNP-GESS) voor de detectie van p-nitrofenol (pNP). In aanwezigheid van het doel enzymen produceren fenolverbindingen, GESS in E. coli-cellen geeft een fluorescentiesignaal, zodat de snelle isolatie van afzonderlijke cellen met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Maar de expressie van metagenomic enzym lijkt zwakker dan die van conventionele recombinant-enzymen; Daarom GESS ontworpen om fenolverbindingen met maximale gevoeligheid gedetecteerd door het onderzoeken van de combinatie van ribosomale bindingsplaats (RBS) en terminatorsequenties met optimale bedrijfstoestand 5. Een van de fundamentele voordelen van GESS is dat deze enkele methode theorie maakt de screening van over dan 200 verschillende typen enzymen in de BRENDA gegevensbank (Tabel 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) door eenvoudigweg gebruik verschillende substraten. Er werd aangetoond dat cellulase, lipase en methyl parathion hydrolase (MPH) kunnen worden gedetecteerd onder toepassing pNP-GESS met geschikt substraat p-nitrofenyl butyraat, p-nitrofenyl cellotrioside en methyl parathion respectievelijk 5. Recent werd aangetoond dat een alkalische fosfatase (AP), die één van de nieuwe enzymen geïdentificeerd middels pNP-GESS, is de eerste thermolabiele AP in koude aangepast marine metagenomes 6. Hier, details van de screening wordt gepresenteerd pNP-GESS detecteren van de activiteiten van drie verschillende soorten enzymes- lipase, cellulase, en alkalische fosfatase; en snel vast kandidaatcomponenten enzymen uit een bibliotheek metagenomic 5,6. De werkwijzen omvatten metagenoom voorbewerking met PNP GESS en de exploitatie van een flow cytometrie sorter. Terwijl het verkregen treffers moeten worden gesequenced voor verdere identificatie Dit protocol omvat de procedure bij het trapje enzym bevestiging activiteit met flowcytometrie.

<table><tbody><tr><td>CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid library production kit&nbsp;</td></tr><tr><td>CopyControl Induction Solution</td><td>Epicentre</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid copy induction solution</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Electrocompetent cell</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid vector</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Electroporation cuvette en electroporeersysteem</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Flow Cytometry (FACS-apparaat)</td></tr><tr><td>AZ100M</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscoop&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td></td><td>LED-verlichter</td></tr><tr><td>50-ml conische buis</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml ronde bodembuis&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml ronde bodembuis</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenylfosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substraat</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl β-D-cellobioside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substraat</td></tr><tr><td>p-nitrofenylbutyraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876&nbsp;</td><td>Substraat</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Trypton 10 g/L, Gistextrakt 5 g/L, Natriumchloride 10 g/L</td></tr><tr><td>Super Optimal bouillon (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Trypton 20 g/L, Gistextrakt 5 g/L, Natriumchloride 0,5 g/L, Magnesiumsulfaat 2,4 g/L, Kaliumchloride 186 mg/L</td></tr><tr><td>Super Optimal bouillon met Catabool onderdrukking (SOC)</td><td></td><td>SOB, 0,4 % glucose</td><td></td></tr><tr><td>2x Gistextrakt Trypton (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Pancreasdigest van Caseïne 16 g/L, Gistextrakt 10 g/L, Gistextrakt 5 g/L</td></tr><tr><td>Celopslagmedia</td><td></td><td></td><td>2x YT-bouillon, 15% Glycerol, 2% Glucose</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>Een DNA-vector die dmpR, egfp-genen bevat met hun geschikte promotoren, RBS en terminator. Zie de referentie 5 in het manuscript voor meer details.</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit genetische screening enzyme system

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

De recente ontwikkeling van een high-throughput single-cell assay techniek maakt het mogelijk om nieuwe enzymen te screenen op basis van functionele activiteiten uit een grootschalige metagenomische bibliotheek1. We stelden eerder een genetisch enzymscreeningsysteem (GESS) voor dat gebruikmaakt van dimethylfenolregulator geactiveerd door fenol of p-nitrofenol. Aangezien een grote hoeveelheid natuurlijke enzymatische reacties deze fenolische verbindingen produceren uit fenol afgeleide substraten, kan dit enkele genetische screeningsysteem theoretisch worden toegepast om meer dan 200 verschillende enzymen in de BRENDA-database te screenen. Ondanks de algemene toepasbaarheid van GESS, vereist het toepassen van het screeningsproces een specifieke procedure om de maximale flowcytometrie signalen te bereiken. Hier beschrijven we het ontwikkelde screeningsproces in detail, dat metagenoompre-processing met GESS en de werking van een flowcytometrie sorter omvat. Drie verschillende fenolische substraten (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-β-D-cellobioside, en fenylfosfaat) met GESS werden gebruikt om respectievelijk drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) te screenen en te identificeren. De geselecteerde metagenomische enzymactiviteiten werden alleen bevestigd met de flowcytometrie, maar DNA-sequencing en diverse in vitro analyse kunnen worden gebruikt voor verdere genidentificatie.

De drie fenolische substraten werden onderzocht om nieuwe metagenomic enzymen uit een metagenoom bibliotheek van de oceaan-tidal flat sedimenten in Taean, Zuid-Korea te identificeren aan de hand van de voorgestelde protocol. Voor de bankconstructie, gemiddeld 30 - 40 kb werden metagenoom sequenties ingevoegd in fosmids, die zijn gebaseerd op de E. coli F factor replicon en gepresenteerd als een enkel exemplaar in een cel. Merk op dat fosmids zijn op grote schaal gebruikt voor he...

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Het algemene doel van deze methodologie is om meerdere enzymen te evalueren met behulp van één enkel high-throughput screeningsysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van micro-organismen en bio-engineering over metagenomische screening en enzymengineering. We hebben een genetisch enzymscreeningsysteem ontwikkeld dat bestaat uit de MPL-mutant die reageert op fenyleenverbindingen en de bijbehorende downstream GFP-reporter.Zodra een metagenomisch gen de enzymactiviteit vertoont waarin we geïnteresseerd zijn door te reageren met het verstrekte substraat, activeert een fenyleenverbinding van het reactieproduct de Dmp-mutant en triggert dit de expressie van de GFP-reporter, wat eenvoudig kan worden vastgesteld met een fluorescentiemeter. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, in tegenstelling tot conventionele screeningstechnieken, deze enkele methode toepasbaar is voor het screenen van meerdere typen verschillende enzymen door gebruik te maken van het juiste substraat. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Kil Koang Kwon, een promovendus in ons laboratorium.Nadat een metagenomische bibliotheek in E.Coli is geconstrueerd met een fosmidevector met behulp van een fosmidebibliotheek-productiekit, wordt het pGESS(E135K)DNA in de cellen van de metagenomische bibliotheek getransporteerd. Bewaar vervolgens de getransformeerde bibliotheekcellen bij -70 °C in aliquots van 20 µL. Om fout-positieven te verwijderen, wordt eerst een aliquot van de metagenomische bibliotheekcellen op ijs ontdooid.Inoculeer vervolgens tien µL van de ontdooide cellen in twee mL lysogenate-bouillon bevattend ampicilline en chloramphenicol in een 14 mL rondbodembuis bij 37 °C en 200 RPM gedurende vier uur. Stel ondertussen in de standaard FACS-software de juiste parameters van de FACS-machine in voor het uitlezen van de metagenomische bibliotheekcellen. Breng aan het einde van de incubatie vijf µL cellen over in één mL PBS in een vijf mL rondbodembuis.Laad vervolgens het verdunde library-monster en stel de eventrate in op 1000 tot 1500 events per seconde. Om een scatterplot van het log-geschaalde forward scatter area versus het log-geschaalde side scattered area op een Global Worksheet te genereren, maakt u een dot-plot en trekt u een polygon gate rond de singlet-events die de bacteriële populatie bevatten. Om een histogram van het celgetal versus het log-geschaalde FITC-area te plotten, opent u een histogram en stelt u het FITC-voltage zo in dat de piek van de klokvormige verdeling minder is dan tien tot de macht twee van de FITC-area.Open vervolgens een ander dot-plot om een log-geschaald plot van forward scatter area tegenover log FITC-area te maken en stel een R2-sorteerpoort in tussen plus vijf en min vijf procent van de cellen vanuit het centrum van de distributie. Wanneer alle poorten zijn ingesteld, plaatst u een opvangbuis met 1,2 milliliters antibioticum-gesupplementeerd lysogenate-bouillon bij de uitgang van het FACS-instrument en sorteert u 1 × 10⁶ van de geselecteerde cellen in de bouillon. Sluit na afloop van de sortering de opvangbuis af en vortex de cellen voorzichtig.Om de metagenomische enzymen van belang te screenen, worden de gesorteerde cellen geïncubeerd bij 37 °C en 200 RPM totdat de OD600 0,5 bereikt, waarna één µL copy-inductie-oplossing wordt toegevoegd om het intracellulaire fosmide-kopiegetal te verhogen. Na drie uur bij 37 °C en 250 RPM worden 0,5 mL van de cellen gecombineerd met het juiste substraat in een 14 mL rondbodembuis tot een uiteindelijke concentratie van 100 µM. Vervolgens worden de controle- en experimentele monsters nogmaals drie uur geïncubeerd bij 37 °C en 200 RPM.Terwijl de monsters schudden, stelt u de parameters van de FACS-machine in zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg vervolgens vijf µL cellen van elk monster toe aan individuele ronde reageerbuisjes van 5 mL die één mL PBS bevatten. Laad daarna de monstercellen en stel de event-rate in op 1000 tot 3000 events per seconde.Maak een scatterplot van het logaritmisch geschaalde forward scatter area tegenover het logaritmisch geschaalde side scatter area en pas de R1 scattergate aan om de singlet event bacteriële cellen te omvatten. Maak vervolgens een scatterplot van de logaritmisch geschaalde forward scatter tegenover de logaritmisch geschaalde FITC-area en stel een R2 sorteergate in zodat minder dan 0,1% van de negatieve cellen wordt gedetecteerd. Laad nu de monsterbuis en pas de event rate indien nodig opnieuw aan naar 1000 tot 3000 events per seconde.Plaats vervolgens een opvangbuis met 0,5 milliliters lysogenaatbouillon bij de uitlaat van het FACS-instrument en verzamel 1 × 10⁴ van de cellen binnen de R1- en R2-gates. Wanneer alle cellen zijn geïsoleerd, sluit de opvangbuis af en vortex de cellen voorzichtig. Verspreid daarna 0,5 milliliters van de verzamelde monsters over twee agarplaten van 90 millimeter met lysogenaatbouillon aangevuld met antibiotica en incubeer de platen gedurende één nacht bij 37 degrees Celsius.In deze figuur wordt het gedemonstreerde screeningsprotocol geïllustreerd, inclusief het verwijderen van vals-positieven door middel van negatieve sortering en de selectie van positieve hits met behulp van de R1- en R2-sorteringsgates. De hits kunnen vervolgens worden geëvalueerd door de fluorescentie van het monster met en zonder het substraat te vergelijken. In deze representatieve screening gemedieerd door p-nitrofenylacetaat was de fluorescentie van de met substraat behandelde cellen hoger dan die van de controlecellen, wat vijf lipase-kandidaten in dit experiment bevestigt.Ondanks de brede distributies van deze drie cellulosekandidaten worden duidelijke verschillen in de gemiddelde FITC-intensiteit van de populaties waargenomen. Deze vier fosfatasekandidaten vertonen daarnaast hoge fluorescentieniveaus in vergelijking met de controlecellen. Bovendien kan de alkalische fosfataseactiviteit van vectoren met geïnserteerde orf's worden bevestigd via flowcytometrie, waarbij een sterker fluorescentiesignaal wordt waargenomen voor de enzym-hit dan voor de cellen die het lege plasmide dragen.Het is belangrijk om te onthouden dat deze techniek kan worden toegepast voor de screening van een breed scala aan enzymen door een geschikt substraat en een passende concentratie te kiezen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals next generation sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de identificatie en karakterisering van de enzymkandidaat op een high-throughput manier te beantwoorden. Na de ontwikkeling heeft deze high-throughput enzymscreeningstechniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van enzymengineering om verschillende metagenomische enzymen te verkennen zonder dat voorafgaande kennis van de enzymspecificiteit vereist is.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het op een metogeen circuit gebaseerde high-throughput screeningsysteem met een breed scala aan enzymdoelen kunt gebruiken.

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Source: Kim, H. et. al., Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a genetic screening method to detect enzyme expression using metagenomic fosmid libraries and chromogenic substrates. Flow cytometry identifies and isolates single cells producing colored products, enabling high-throughput selection of active enzyme-expressing cells.

Detection of Target Enzyme Expression in Genetically Modified Bacterial Cells

In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Leer een universeel genetisch enzymscreeningsysteem voor hoge doorvoer om lipase, cellulase en alkalische fosfatase te identificeren via substraatwisseling. Deze methode verhoogt de efficiëntie in enzymtechniek en metagenomisch onderzoek aanzienlijk.

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Meer video's verkennen