Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

Het algemene doel is om een algemene benadering te bieden voor de ontwikkeling van een op aptamer-goud-nanodeeltjes gebaseerde colorimetrische test voor de detectie van doelmoleculen, en om benaderingen te bieden om de langetermijnopslag te verbeteren en valse positieve reactiepercentages te verminderen. Deze methoden beantwoorden belangrijke vragen op het gebied van colorimetrische tests met goudnanodeeltjes en aptameren, zoals de reproduceerbaarheid van de tests in het veld voor langetermijnopslag en het verminderen van het percentage valse positieve reacties. Deze tests kunnen vatbaar zijn voor problemen met de houdbaarheid en valse positieve reacties.

In dit werk verbeteren we beide van deze problemen. Reinig een 500-milliliter Erlenmeyer-kolf en grote roerstaaf met vijf milliliter geconcentreerd salpeterzuur en 15 milliliter geconcentreerd zoutzuur in een chemisch veiligheidskapje. Maak het hele oppervlak van de kolf nat met de zuurwas.

Spoel vervolgens de kolf af met nuclease-vrij water en laat de kolf drogen. Voeg 100 milliliter van een millimolair gouddriechloride toe. Gebruik een stuk aluminiumfolie om de bovenkant van de met zuur gereinigde Erlenmeyer-kolf te bedekken en verwarm met continu roeren op een hotplate tot het kookt.

Voeg vervolgens 10 milliliter 38,8 millimolair natriumcitraat toe. De kleur zal veranderen van helder of grijs naar donkerblauw of zwart, en uiteindelijk naar donkerrood gedurende enkele minuten. Blijf roeren met het vuur uit gedurende 10 minuten.

Laat de goudnanodeeltjessuspensie afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 110 microliter DEPC toe met continu roeren. Bedek de hele kolf met aluminiumfolie en laat de DEPC-behandeling een nacht incuberen. De volgende dag autoclaveer je de goudnanodeeltjessuspensie.

Koel vervolgens af tot kamertemperatuur en filter door een 0,22 micron poriëncelluloseacetaatmembraan. Bewaar de gefilterde, autoclaveerbare goudnanodeeltjesstockoplossing in het donker bij vier graden Celsius. Bereken de goudnanodeeltjesconcentratie zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier werd de concentratie berekend op 10 nanomolair met een grootte van 15 nanometer, zoals bepaald door dynamische lichtverstrooiing. Koop of synthetiseer de cocaïnebindende aptamersequenties met behulp van standaard fosforamidietfysica. Na het zuiveren van de aptameren met behulp van standaard desalting, reconstitueer oligonucleotiden in nuclease-vrij water bij een 100 micromolair of één millimolair stockoplossing.

Gealiquoteerde gezuiverde aptameren kunnen gedurende enkele maanden worden bewaard bij 20 graden Celsius. Combineer het DNA met de 10 nanomolair stock goudnanodeeltjesoplossing, waarbij het volume goudnanodeeltjes naar wens wordt gevarieerd, om voldoende monsters te hebben voor de uit te voeren test. Incubeer het mengsel gedurende drie tot vier uur bij kamertemperatuur en bescherm het tegen licht.

Voeg een gelijk volume van 20 millimolair HEPES, twee millimolair magnesiumchloride en pH 7,4-buffer toe en plaats het monster gedurende een nacht in het donker bij vier graden Celsius. De initiële zoutconcentratie die nodig is om de kleurreactie van de test te induceren door zouttitratie, wordt bepaald met de testblank. Voeg 20 microliter methanol toe aan 180-microliter aliquots van de aptamer-goudchloride-test in een 96-wellplaat.

Een kritieke stap in de uitvoering van deze tests is om de natriumchlorideconcentratie te bepalen om de goudnanodeeltjes te destabiliseren zodra het doel is toegevoegd. Titreer de monsters met toenemende volumes van stocknatriumchlorideoplossing en bepaal het equivalentiepunt. Bepaal hier de natriumchloridevolume dat nodig is om de kleinste kleurverandering te veroorzaken door visuele observatie.

Optimaliseer de testreactie, voeg 20 microliter van analytmoleculen verdund in methanol toe aan 180-microliter aliquots van aptamer-goudnanodeeltjes-assay in een 96-wellplaat bij kamertemperatuur. Voeg onmiddellijk de natriumchlorideconcentratie toe die in de vorige stap is bepaald om de kleurreactie van de test te starten. Verkrijg de grootst mogelijke kleurverandering door de natriumchlorideconcentratie te verhogen of te verlagen en de doelrespons te vergelijken met de blanco respons.

Gebruik de natriumchlorideconcentratie die de grootste responsverschil biedt. Observeer of meet de testrespons 150 seconden na toevoeging van natriumchloride. Analyseer de absorptie bij 650 nanometer en 530 nanometer, met behulp van een spectrofotometer.

Plot de resultaten als de verhouding van de absorptie verkregen bij 650 nanometer en 530 nanometer als functie van de analytconcentratie. Normaliseer de testrespons naar het blanco signaal. Bereid de aptamer-goudnanodeeltjestestcomponenten voor zoals eerder in de video beschreven.

Maak aparte oplossingen met een gram per milliliter trehalose en een gram per milliliter sucrose in nuclease-vrij water om de cryogengeoplossing te maken. Een kritieke stap bij het invriezen van deze tests is het bepalen van de hoeveelheid trehalose- en sucrose-oplossingen die aan de monsters moet worden toegevoegd om volledige en gelijkmatige bevriezing te garanderen. Maak een oplossing die 19,2 milligram per milliliter trehalose en 4,8 milligram per milliliter sucrose bevat met de 60 MN4 DNA per goudnanodeeltje-test bij een eindvolume van 200 microliter in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.

De uiteindelijke cryogengeoplossingsconcentraties zullen variëren met DNA-dekking. Bevries de monsters snel met behulp van een 146 graden Celsius vriezer of in vloeibaar stikstof. Bewaar de monsters ingevroren tot gebruik.

Voor dit werk laat je de monsters overnacht in de 146 graden Celsius vriezer en breng je ze daarna over naar een 20 graden Celsius vriezer voor langetermijnopslag. Hier worden representatieve resultaten van natriumchloride-titratiecurven voor onbehandelde en DNA-aptamer-behandelde goudnanodeeltjes getoond. De initiële natriumchlorideconcentratie die in de test werd gebruikt, werd bepaald door titratie.

Representatieve resultaten van de aptamer-goudnanodeeltje-colorimetrische test voor cocaïne en controlemoleculen worden hier getoond. De grafieken onthullen het effect dat het verhog