Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly

Het algemene doel van het protocol voor synthetische biologie is om snel de functionaliteit van terminators te bepalen en de terminatorsterkte te kwantificeren in een in-vitro systeem dat gebruikmaakt van golden gate-assemblage. Dit protocol wordt gebruikt om terminators te testen die we in silico hebben gevonden met behulp van bio-informatica en ze in een biologische omgeving te testen. Dit maakt een snelle en eenvoudige bevestiging mogelijk van bio-informatisch geïdentificeerde terminators in een lab omgeving.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de snelheid. We kunnen van bio-informatische identificatie naar biologische bevestiging in minder dan een week. En door dit te doen, kunnen we ook verifiëren dat een terminator in feite een terminator is en we kunnen de terminatorsterkte kwantificeren.

Over het algemeen zullen individuen aanvankelijk worstelen met deze techniek, omdat het contra-intuïtief klinkt om het restrictie-enzym met een ligase in dezelfde buis toe te voegen. We gebruiken echter type 2S restrictie-endonucleasen en de herkenningsplaats voor het enzym is gescheiden van de werkelijke snijplek. Zodra de terminator is geligeerd in de pGR blauwe plasmide, is dit een permanente ligatie.

Door echter het restrictie-enzym en de ligase in dezelfde buis te hebben, door meerdere cycli te gaan, kunnen we een hoge kloonefficiëntie bereiken. Begin deze procedure door de afzonderlijke oligonucleotiden op te schorsen in nuclease-vrij water met een concentratie van 100 micromolar, bereid vervolgens 10x annealing buffer. Label vervolgens een 1,5 milliliter micro-centrifuge buis voor elke terminator die moet worden getest.

Voeg aan elke buis 16 microliter ultra-puur water toe, 2 microliter 10x annealing buffer en 1 microliter elk van de boven- en onderstrengkleurige oligonucleotiden van de gewenste terminators. Het is erg belangrijk om ervoor te zorgen dat de oligonucleotiden die je hebt besteld de juiste sticky ends hebben. Omdat zodra ze samengesmolten zijn, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de terminator in de juiste oriëntatie staat.

Als de terminator in de verkeerde oriëntatie staat, zal pGR blauw niet kunnen verifiëren of het een functionerende terminator is. Plaats vervolgens de micro-centrifuge buizen in een float en kook ze vier minuten in een waterbad. Na vier minuten, zet de warmteplaat uit maar laat de buis 's nachts in het water om langzaam af te koelen.

Bewaar de samengesmolten terminators bij 20 graden Celsius. Om een 40 nanomolare verdunning van de samengesmolten terminators te maken, ontdooi ze eerst op ijs en voeg vervolgens in een nieuwe 1,5-milliliter micro-centrifuge buis 124 microliter nuclease-vrij water toe aan 1 microliter van de samengesmolten terminators. Centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden bij 10.000x g.

Na het centrifugeren, bewaar de monsters op ijs. Voeg in een nieuwe, voor een thermocycler geschikte buis 6 microliter nuclease-vrij water toe. Voeg vervolgens een microliter commerciële DNA ligase buffer toe.

Voer alle volgende stappen op ijs uit. Voeg vervolgens 1 microliter met 35 tot 50 nanogram per microliter van de pGR blauwe bestemmingsplasmide toe, 1 microliter van de 40 nanomolare samengesmolten terminators, 0,5 microliter commerciële hoog-fidelity BSA1 restrictie-endonuclease en 0,5 microliter commerciële DNA ligase. Centrifugeer het reactiemengsel gedurende 120 seconden bij 10.000x g.

Plaats vervolgens de buis direct in de thermocycler en voer het volgende programma uit. 20 cycli van 1 minuut bij 37 graden Celsius, gevolgd door 1 minuut bij 16 graden Celsius en vervolgens een cyclus van 15 minuten bij 37 graden Celsius. Na de run, bevries en bewaar de monsters bij 20 graden Celsius of ga direct door met transformatie.

Transformeer de ligatiereacties in chemisch competente e. coli cellen met behulp van een geschikt transformatieprotocol. Hier worden JM109 cellen getransformeerd met behulp van zippy transformatie.

Verspreid met behulp van een L-vormige glazen hockeystick 25 microliter van de getransformeerde cellen op voorverwarmde LB agar platen met 1 millimolair ampicilline en 10 millimolair arabinose. Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius. Incubeer ze niet langer dan 24 uur.

Ampicilline degradeert snel. De volgende dag, inspecteer de kleur van de kolonies. Een succesvolle ligatie zou wit of geel zijn in zichtbaar licht en zal groen fluoresceren onder blauw of UV licht.

Een onsuccesvolle ligatie zal een kolonie produceren die blauw is in zichtbaar licht. Bereid voor elk van de terminators en controles een testbuis met 5 milliliter steriele LB bouillon met 1 millimolair ampicilline en 10 millimolair arabinose. Bij het uitvoeren van dit protocol, is het met pGR erg belangrijk om ervoor te zorgen dat de juiste controles op hun plaats zijn.

De eerste controle zou gewoon LB bouillon moeten zijn. De volgende controle moet cellen zijn die resistent zijn tegen ampicilline, maar niet fluoresceren onder blauw licht. Deze zullen als blanco dienen.

De volgende controle is een pGR plasmide dat niet is gesneden, dus het heeft geen terminator op zijn plaats en dit zal dienen als de basislijn voor terminatorsterkte en de laatste van je buizen zal zijn voor je monster. Gebruik onder zichtbaar licht een steriele lus om 2 tot 3 witte of gele kolonies te plukken en breng ze over naar de LB bouillon. Laat de monsters gedurende 16 tot 18 uur incuberen op een shaker bij 37 graden Celsius bij 160 rpm.

De volgende dag, gebruik een spectrofotometer om de optische celdichtheid van elk monster bij 600 nanometer te bepalen. Over het algemeen wordt na deze hoeveelheid tijd een OD 600 van 0,8 tot 1,0 verwacht. Plaats een steriele 96-well plate in de kap.

Bereid voor elk monster of controle 3 wells voor met 199 microliter steriele LB bouillon met ampicilline en arabinose. Pipet vervolgens 1 microliter van de celoplossing van de overnachtelijke bouillon in individuele wells van de 96-well plate. Vul de platen met een adembare deksel en schud ze vervolgens gedurende 18 tot 20 uur bij 37 graden Celsius en 160 rpm.

De volgende dag, gebruik een plate reader om de OD 600