Name: Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe je terminatorsterkte snel kwantificeert met Golden Gate Assembly en de PGR-Blue plasmid. Deze methode valideert bio-informatica-geïdentificeerde sequenties in minder dan een week.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen graag Malcolm Campbell en Todd Eckdahl erkennen met de Genome Consortium voor Active Teaching (GCAT) en de HHMI-Science Education Alliance - Phage Jagers Voortschrijdende Genomics en Evolutionaire Science programma (SEA-fagen). Dit project werd ondersteund door subsidies van het National Center for Research Resources (P20RR016460) en het National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) van de National Institutes of Health. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Science Foundation in het kader van subsidie ​​# IIA-1457888. Daarnaast institutionele (Ouachita Baptist University) fondsen werden verstrekt door de JD Patterson Summer Research Fellowship.

1. Het ontwerpen en bestellen Oligonucleotiden met de juiste Sticky Ends <ol><li> Identificeren van potentiële rho-onafhankelijke terminators door middel van genomische analyse met behulp van programma&#39;s die online vrij beschikbaar. 7 </li><li> Bij het ​​werken met dubbelstrengig DNA, bepaalt de oriëntatie van de terminator te testen. 7 De PGR-Blue plasmide wordt alleen gecontroleerd terminators geligeerd in de 5 &#39;tot 3&#39; richting op de bovenste (voorwaartse streng). <ol><li> Omzetten van een bodem (omgekeerde) streng terminator zijn teruggedraaid aanvulling op de reeks heroriënteren voor het testen in PGR-Blue met behulp van gratis online software, bijvoorbeeld, aap. </li></ol></li><li> Nadat de oriëntatie bepaald correct is, voeg de sticky end &quot;5&#39;-CGAC-3 &#39;&quot; het 5&#39; uiteinde van de bovenste streng. Voeg het kleverig einde &quot;5&#39;-CCGC-3 &#39;&quot; aan het 5&#39;-uiteinde van de onderste streng. 8 Hierdoor zullen geligeerd inzetstuk in de juiste ingevoegdoriënteren met behulp van GGA. </li><li> Zodra sequenties worden bepaald, te gelasten enkelstrengs oligonucleotiden commercieel. </li></ol> 2. gloeien Oligonucleotiden (geldt alleen voor gevriesdroogde DNA) <ol><li> Resuspendeer individuele oligonucleotiden nuclease vrij water tot een concentratie van 100 uM. </li><li> Voeg 10x annealing buffer: 1 M NaCI en 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing buffer kan meerdere weken bewaard bij 4 ° C. Zodra annealing buffer gemaakt en oligonucleotiden worden geresuspendeerd, begint het gloeien 8. </li><li> Voor elke terminator te testen, voeg 16 ul van ultrazuiver water om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 2 pl 10x annealing buffer aan elke microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1 pl van de bovenste streng oligonucleotide (100 uM) van het gewenste terminator. </li><li> Voeg 1 pl van de onderste streng oligonucleotide (100 uM) van het gewenste terminator. </li><li> Maak een kokend water bath met behulp van een 1000 ml beker die ongeveer 400 ml water uit de kraan en leg ze op een hete plaat. </li><li> Plaats de microcentrifugebuizen uit stap 2.6 in een vlotter en kook 4 min. Na 4 min, zet het vuur bord, maar laat de buis en drijven in het waterbad langzaam afkoelen O / N (18 uur) 8. Bewaar de gegloeide terminators bij -20 ° C. </li></ol> 3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Cost Efficient) <ol><li> Maak een 40 nm verdunning van de gegloeide terminators. Voeg 124 gl nuclease vrij water tot 1 pl versmolten terminators mengsel (100 uM). <ol><li> Centrifuge monsters gedurende 30 seconden bij 10.000 xg en bewaar op ijs. </li></ol></li><li> In een nieuwe buis geschikt is voor de thermocycler wordt gebruikt, voeg 6 ul van nuclease vrij water. </li><li> Voeg 1 pl commerciële DNA Ligase buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT en 10 mM ATP]. Voer alle volgende stappen op ijs. </li><li> Toevoegen1 pl PGR-Blue (35-50 ng / ul) plasmide bestemming aan de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1 pl van de 40 nM uitgegloeid afsluitweerstanden aan de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 0,5 ul commerciële high-fidelity BsaI restrictie endonuclease om de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 0,5 pl commerciële DNA ligase aan de microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer het reactiemengsel bij 10.000 xg gedurende 120 sec. Plaats vervolgens de buis rechtstreeks in de thermocycler. </li><li> Voer het thermocycler programma: 20 cycli van 1 min bij 37 ° C gevolgd door 1 min bij 16 ° C, gevolgd door 1 cyclus van 15 minuten bij 37 ° C. Gebruik monsters direct of vries en bewaar bij -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Time Efficient) <ol><li> Voeg 124 ul van nuclease vrij water tot 1 pl van de 100 uM onthard terminators gemaakt in stap 2. Deze verdunt de terminator DNA-concentratie tot 40 nM.Voer deze stap in een nieuwe gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> In een nieuwe buis geschikt is voor de thermocycler, voeg 14 ul van nuclease vrij water. Zorg ervoor dat de nieuwe buis dienovereenkomstig gelabeld. </li><li> Voeg 2 pl Commercial Master Mix Buffer aan de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1 pl PGR-Blue plasmide (35-50 ng / ul) aan de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 2 ul van het 40 nM uitgegloeid afsluitweerstanden aan de microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1 ui van Commercial Master Mix aan de microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de 40 nM buis bij 10.000 xg gedurende 120 sec. Plaats vervolgens de buis rechtstreeks in de thermocycler. </li><li> Voer het thermocycler programma: 1 cyclus van 60 minuten bij 37 ° C gevolgd door 1 cyclus van 15 minuten bij 55 ° C. Gebruik monsters direct of vries en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 5. Transformatie en Colony Selection <ol><li> Bereid Luria Base (LB) agar Petri platen die 1 mM concentration ampicilline (Amp) en een 10 mM concentratie van arabinose (ARB). Maak minstens 10 ml 1 M L -arabinose voorraadoplossing omdat deze voorraadoplossing worden gebruikt in latere stappen. </li><li> Gebruik een hoog-efficiënte (10 augustus-10 september transformanten / ug) chemisch competente E. coli (JM109) cellen voor transformatie. 9 voor het beste resultaat voeg 3-5 ul van de ligatiereactie 50 pi competente cellen. Bij gebruik van chemisch competente cellen, volgt de transformatie protocol specifiek voor de cellen die worden gebruikt. </li><li> Spread helft (25 pl) van de getransformeerde cellen op voorverwarmd LB (Amp / arb) agarplaten met een steriel L-vormige &quot;hockey stick&quot; en incubeer O / N bij 37 ° C. Door hoge snelheid van afbraak van ampicilline, niet incuberen bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Voer kolonie selectie op basis van kleur door visuele inspectie. Een succesvolle ligatie moet wit / geel in zichtbaar licht en fluoresceren groene under blauw (450 nm) of UV-licht. 20 uur - een mislukte ligatie zal een kolonie die is blauw van kleur onder zichtbaar licht na 18 te produceren. </li></ol> 6. Controle en kwantificering van Terminator <ol><li> Bereid 5 ml steriel LB-bouillon buizen met 1 mM ampicilline en 10 mM arabinose. Het aantal buizen nodig is afhankelijk van het aantal terminators getest plus controles (cellen met ampicillineresistentie die niet fluoresceren en cellen die de ongesneden PGR-Blue plasmide). </li><li> Onder zichtbaar licht pick 2-3 wit / geel kolonies (stap 5.4) met behulp van een steriele lus. Laat de monsters te incuberen in bouillon op een schudinrichting bij 37 ° C en 160 rpm gedurende 16-18 uur. Mis deze monsters niet incubeer gedurende meer dan 24 uur. <ol><li> Gebruik desgewenst een spectrofotometer optische celdichtheid te bepalen bij 600 nm (OD 600) voldoende celgroei waarborgen. In het algemeen, een OD 600 van ~ 0,8-1,0 waargenomen na 16-18 h groei. </li></ol></li><li> Gebruikeneen steriele 96-putjes plaat voor de resterende stappen. Het uitvoeren van deze stappen in een aseptische omgeving en in drievoud. Voeg 199 ul steriel LB + Amp / arabinose bouillon (1 mM ampicilline / 10 mM arabinose) in elk putje. Onder meer ruimte op het bord voor drie afzonderlijke controles. <ol><li> Gebruik de volgende drie knoppen: Een goed (1) met LB + Amp / arabinose bouillon alleen en een goed (2) voor niet-getransformeerde competente cellen (blanco) om te dienen als een blanco. Voor kwantificering (3) van de terminator sterkte, cellen die ongesneden originele PGR of met PGR-Blue geligeerd met een niet-beëindiging sequentie worden opgenomen (referentiesignaal voor de kwantificering). Zie figuur 1 voor plaatlezer lay-out. </li></ol></li><li> Pipet 1 pi van de celoplossing van de O / N bouillon in afzonderlijke putjes van de 96-well plaat. </li><li> Seal-platen met een ademende deksel en schud gedurende 18-20 uur bij 37 ° C en 160 rpm. </li><li> Met behulp van een plaat lezer, bepalen OD 600 door het lezenabsorptie bij 600 nm. Meet GFP fluorescentie als volgt: 395 excitatie en emissie 509. Meet RFP fluorescentie als volgt: 575 excitatie en emissie 605. Na 18-20 uur, dient de OD 600 ongeveer 0,5 zijn. </li><li> Om te normaliseren voor variatie in groei, gebruik maken van de vergelijking: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> voor zowel GFP en RFP. </li><li> Na normalisatie Bepaal relatieve sterkte terminator met de vergelijking <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De belangrijkste stap in dit protocol is de juiste oligonucleotide ontwerp voorafgaand aan de bestelling. De oligonucleotiden moet de juiste sticky ends toegevoegd aan de 5 &#39;einden van zowel de bovenste en onderste strengen zodat GGA opname mogelijk. Bovendien is het belangrijk om de oriëntatie van links gerichte terminators (terminators die transcriptie op de onderste streng te stoppen) te veranderen overeenkomstig recht tegenover (eindigt transcriptie op de bovenste streng) terminatoren omdat GFP en RFP expressie ...

Grote projecten in de synthetische biologie vereisen het gebruik van zeer effectieve transcriptie-terminators om de genexpressie te reguleren. Identificatie van nieuwe terminators vereist bioinformatica-analyse van nieuwe genomen. Echter, naarmate er steeds meer bioinformatica-software wordt ontwikkeld, elk met een uniek algoritme voor voorspelling, ontstaan er meer verschillen tussen de veronderstelde resultaten. Omdat dit proces enigszins subjectief is en in silico wordt uitgevoerd, hebben deze voorspellingen biologische bevestiging nodig.1 Bovendien vereist de hoeveelheid veronderstelde terminators die door in-silico analyse zijn geïdentificeerd, het gebruik van kloneringsstrategieën die in een relatief korte tijd kunnen worden voltooid.
De PGR-Blue plasmide is een aanpassing van de PGR plasmide die is herontworpen om Golden Gate Assembly (GGA) te gebruiken om de kloneringsprocedure te vereenvoudigen door alle reactiestappen tegelijkertijd in één microcentrifugebuis uit te voeren.2,3 Kleurselectie werd in de plasmide opgenomen om het gemakkelijker te maken om positieve koloniën te identificeren. Een succesvolle ligatie zou wit/geel moeten zijn in zichtbaar licht en groen moeten fluoresceren onder blauw (450 nm) of ultraviolet (UV) licht wanneer gekweekt op platen die arabinose bevatten. Omdat ongesneden pGR-blue een blauw chromoproteïne (amilCP) bevat, zijn koloniën die een ongewijzigde plasmide bevatten blauw onder zichtbaar licht. Deze vereenvoudiging en het gestroomlijnde protocol stellen onderzoekers in staat om binnen drie tot vier dagen door te gaan van bioinformatica-identificatie naar biologische bevestiging. De ontwerpaard van dit systeem kan zowel in het onderzoekslab als in educatieve omgevingen gunstig zijn.
De pGR-Blue plasmide maakt kwantificering van de terminatorsterkte mogelijk.4 Een enkele arabinose-inductible promotor wordt gebruikt om groen fluorescent proteïne (GFP) en rood fluorescent proteïne (RFP) te produceren. De terminator wordt gekloond in de plasmide na de GFP-sequentie maar vóór de RFP-sequentie, waardoor de transcriptie van het RFP-proteïne wordt gestopt. De sterkte van de terminator wordt bepaald door de verhouding van geproduceerd GFP tot geproduceerd RFP.
Het Vision and Change5 rapport suggereerde dat Science, Technology, Engineering and Math (STEM) onderwijs onderzoeksgerichte ervaringen in de klas zou moeten opnemen.6 Dit vereist echter de ontwikkeling van protocollen die door studenten met beperkte vaardigheden in een gedefinieerde tijdsperiode kunnen worden uitgevoerd. Hoewel het protocol in slechts drie dagen kan worden voltooid, is het ook zo ontworpen dat elke grote stap in een afzonderlijke wekelijkse (2-3 uur) labperiode kan worden voltooid om een Course Research Experience (CRE) te creëren. Wanneer op deze manier gebruikt, zal de procedure tussen de drie en zes weken duren en is geschikt voor zowel inleidende als geavanceerde cursussen in Genetica, Celbiologie of Bioinformatica.

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Steriele vellen)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Alleen steriele vellen</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Het niet-HF enzym werkt, maar is minder hittebestendig. </td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerciële Master Mix waarnaar wordt verwezen in het protocol.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Rond Microcentrifuge drijvend rek</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline natriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinose zal het pBAD-promotore niet induceren</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Broth, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Plate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix &amp; Go Competent Cells - Strain JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Gebruik het aanbevolen transformatieprotocol van het bedrijf</td></tr><tr><td>ApE: een plasmide-editor-software</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (Kristallijn/Biologisch, Gecertificeerd)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële oligonucleotide synthese</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Steriele)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>mycobacteriophage "Bernal13"</td><td>Genebank</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Vrije Water</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Steriele, L-vormige Hockey-Stick Cell</td><td>Life Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: een webtool voor de voorspelling van Rho-onafhankelijke transcriptie-terminators.</td><td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid verificatie van terminators met behulp van de pgr-blue plasmid en golden gate assembly

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

Het doel van dit protocol is om de snelle verificatie van bioinformatica geïdentificeerde terminators mogelijk te maken. Verder is het plasmide (pGR-Blue) specifiek ontworpen voor dit protocol en maakt het de kwantificering van terminator-efficiëntie mogelijk. Als bewijs van concept werden zes terminators bioinformatica geïdentificeerd in de mycobacteriofaag Bernal13. Eenmaal geïdentificeerd, werden terminators vervolgens gemaakt als oligonucleotiden met de juiste sticky ends en aan elkaar geannealeerd. Met behulp van Golden Gate Assembly (GGA) werden terminators vervolgens gekloneerd in pGR-Blue. Onder zichtbaar licht zien valse positieve kolonies er blauw uit en positief getransformeerde kolonies zijn wit/geel. Na inductie van een arabinose-induceerbare promotor (pBad) met arabinose, kan de koloniaalsterkte worden bepaald door de verhouding te meten van geproduceerd groen fluorescent eiwit (GFP) tot geproduceerd rood fluorescent eiwit (RFP). Met pGR-Blue kan het protocol in slechts drie dagen worden voltooid en is het ideaal in een educatieve omgeving. Bovendien tonen de resultaten aan dat dit protocol nuttig is als middel om in silico voorspellingen van terminator-efficiëntie te begrijpen met betrekking tot de regulatie van transcriptie.

Dit protocol cellen die PGR-Blauw met een terminator geligeerd tussen GFP en RFP behulp Golden Gate Samenstel (figuur 2) te produceren. Positieve kolonies die geligeerd insert kan worden geselecteerd op basis van kleur. In zichtbaar licht zal positieve kolonies wit / geel en valse positieven zal blauwe kolonies produceren na 18-20 uur incubatie bij 37 ° C (figuur 3). Na kolonie selectie, kan e...

Dit protocol maakt gebruik van Golden Gate Assembly en de plasmide pGR-blue om snel de sterkte van terminatoren te kwantificeren die in silico gevonden worden.

Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

Het algemene doel van dit synthetisch biologieprotocol is om snel de functionaliteit van terminatoren te bepalen en de sterkte van terminatoren te kwantificeren in een in-vitro systeem dat gebruikmaakt van Golden Gate-assemblage. Dit protocol wordt gebruikt om terminatoren die in silico via bio-informatica zijn gevonden, te testen in een biologische setting. Dit maakt een snelle en eenvoudige bevestiging van bio-informatisch geïdentificeerde terminatoren mogelijk in een laboratoriumsetting.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de snelheid. We kunnen in minder dan een week gaan van bio-informatische identificatie naar biologische bevestiging. Daarbij kunnen we ook verifiëren of een terminator inderdaad een terminator is en kunnen we de sterkte van de terminatie kwantificeren.Over het algemeen zullen personen in het begin moeite hebben met deze techniek, omdat het contra-intuïtief klinkt om het restrictie-enzym samen met een ligase in dezelfde buis toe te voegen. Wij maken echter gebruik van type 2S restrictie-endonucleasen, waarbij de herkenningsplaats voor het enzym gescheiden is van de eigenlijke knipplaats. Zodra de terminator in het pGR blue-plasmide is geligeerd, is dit een permanente ligatie.Door het restrictie-enzym en de ligase echter in dezelfde buis te houden en meerdere cycli te doorlopen, kunnen we een hoge kloon-efficiëntie bereiken. Begin deze procedure door de individuele oligonucleotiden opnieuw op te lossen in nucleasevrij water bij een concentratie van 100 µM, en bereid vervolgens een 10x annealingsbuffer. Label daarna een 1,5 ml microcentrifugebuisje voor elke terminator die getest zal worden.Voeg aan elke buis 16 µL ultrapuur water, 2 µL 10x annealingsbuffer en telkens 1 µL van de top- en bottomstrand-oligonucleotiden van de gewenste terminators toe. Het is zeer belangrijk om te controleren of de bestelde oligonucleotiden de juiste kleverige uiteinden (sticky ends) hebben. Omdat ze eenmaal aan elkaar zijn geanneald, is het essentieel om te garanderen dat de terminator in de juiste oriëntatie staat.Als de terminator in de verkeerde oriëntatie staat, kan pGR blue niet verifiëren of het een functionele terminator is. Plaats vervolgens de microcentrifugebuisjes in een drijver en kook ze gedurende vier minuten in een waterbad. Schakel na vier minuten de warmteplaat uit, maar laat de buisjes gedurende de nacht in het water staan om langzaam af te koelen.Bewaar de geannealeerde terminators bij 20 °C. Om een verdunning van 40 nM van de geannealeerde terminators te maken, ontdooi deze eerst op ijs en voeg vervolgens in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml 124 µL nucleasevrij water toe aan 1 µL van de geannealeerde terminators. Centrifugeer de monsters 30 seconden bij 10.000x g.Bewaar de monsters na het centrifugeren op ijs. Voeg 6 µL nucleasevrij water toe aan een nieuwe, geschikte thermocyclerbuis. Voeg vervolgens één µL commerciële DNA-ligasebuffer toe.Voer alle volgende stappen op ijs uit. Voeg vervolgens 1 µL toe met 35 tot 50 ng/µL van het pGR blue-bestemmingsplasmide, 1 µL van de 40 nM geannealeerde terminators, 0,5 µL commercieel high-fidelity BSA1-restrictie-endonucleasen en 0,5 µL commercieel DNA-ligase. Centrifugeer het reactiemengsel bij 10.000x g gedurende 120 seconden.Plaats de buis vervolgens direct in de thermocycler en voer het volgende programma uit: 20 cycli van 1 minuut bij 37 °C, gevolgd door 1 minuut bij 16 °C en daarna één cyclus van 15 minuten bij 37 °C. Bevries en bewaar de monsters na afloop van de run bij -20 °C, of ga direct over tot transformatie.Transformeer de ligatiereacties in chemisch competente e. coli-cellen met behulp van een geschikt transformatieprotocol. In dit geval worden JM109-cellen getransformeerd via zippy-transformatie.Verspreid met een L-vormige glazen hockeystick 25 µL van de getransformeerde cellen over voorverwarmde LB-agarplaten die 1 mM ampicilline en 10 mM arabinose bevatten. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C. Incubeer ze niet langer dan 24 uur.Ampicilline degradeert snel. Inspecteer de volgende dag de kleur van de kolonies. Een succesvolle ligatie zou wit of geel moeten zijn bij zichtbaar licht en zal groen fluoresceren onder blauw of UV-licht.Een mislukte ligatie zal een kolonie produceren die blauw van kleur is onder zichtbaar licht. Bereid voor elk van de terminators en controles een reageerbuis voor met 5 milliliters steriel LB-bouillon met 1 millimolar ampicilline en 10 millimolar arabinose. Bij het uitvoeren van dit protocol is het bij pGR zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de juiste controles aanwezig zijn.De eerste controle moet enkel LB-bouillon zijn. De volgende controle moet bestaan uit cellen die resistent zijn tegen ampicilline, maar niet fluoresceren onder blauw licht. Deze dienen als blanco.De volgende controle is een pGR-plasmide dat niet is doorgesneden, waardoor er geen terminator aanwezig is; dit dient als nulmeting voor de terminatorsterkte. De laatste buis is bestemd voor uw monster. Selecteer onder zichtbaar licht met een steriele entlus 2 tot 3 witte of gele kolonies en breng deze over naar het LB-bouillon. Laat de monsters incuberen op een schudder bij 37 °C bij 160 rpm gedurende 16 tot 18 uur.Bepaal de volgende dag met een spectrophotometer de optische celdichtheid van elk monster bij 600 nanometers. Over het algemeen wordt na deze tijd een OD 600 van 0,8 tot 1,0 verwacht. Plaats een steriele 96-wellplaat in de zuurkast.Bereid voor elk monster of controle 3 wells voor met 199 µL steriel LB-bouillon met ampicilline en arabinose. Pipetteer vervolgens 1 µL van de celoplossing uit de overnight-bouillons in individuele wells van de 96-well plaat. Sluit de platen af met een ademende cover en schud ze daarna 18 tot 20 uur bij 37 °C en 160 rpm.Gebruik de volgende dag een plaatlezer om de OD 600 te bepalen, welke ongeveer 0,5 zou moeten zijn. Meet daarnaast de GFP-fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 395 nanometer en een emissie van 509 nanometer. Meet de RFP-fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 575 nanometer en een emissie van 605 nanometer.Normaliseer met behulp van Excel de variatie in groei door de fluorescentie te delen door de OD 600. Bepaal na normalisatie de relatieve terminatorsterkte door de GFP-terminatorfluorescentie gedeeld door de GFP-controlefluorescentie te delen door de RFP-terminatorfluorescentie gedeeld door de RFP-controlefluorescentie. De vermeende terminatoren T1 tot en met 6, die bio-informatisch zijn geïdentificeerd in de microbacteria-faag bernal 13, werden geanalyseerd zoals beschreven in deze video.Deze resultaten tonen de relatieve fluorescentie. Alle resultaten werden genormaliseerd met behulp van cellen die ongesneden, ongemodificeerde PGR bevatten als controle. T3 bleek een sterke terminator te zijn.Alle resultaten vertegenwoordigen individuele kolonies die in triplikaat zijn gekweekt en zijn gemiddeld voor de visuele weergave. De foutenbalken vertegenwoordigen de afwijkingen tussen de gemiddelde datapunten. Om de beste referentiecontrole te bepalen voor het kwantificeren van de terminatorsterkte, werden ruwe gegevens vergeleken met gebruik van het oorspronkelijke pGR-plasmide zonder terminator, en pGR blue gekloneerd met een sequentie waarvan bekend is dat deze geen terminator is.Zoals hier te zien is, vertoonden beide controles vergelijkbare niveaus van GFP- en RFP-expressie en, belangrijker nog, produceerden zij vergelijkbare GFP- RFP-ratio's. Al deze resultaten zijn representatief voor individuele koloniën die in triplikaat zijn gekweekt en waarvan het gemiddelde is weergegeven voor de visuele representatie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek slechts 72 uur in beslag nemen, inclusief de tijd voor bestelling en verzending.Het is belangrijk om op te merken dat pGR blue alleen werkt in e.coli. Bovendien, aangezien we slechts naar een klein stukje van de terminator kijken, hebben we geen inzicht in andere regulerende elementen die de transcriptie kunnen beheersen. Om de resultaten die u met dit protocol met behulp van pGR blue behaalt te verifiëren, kunnen aanvullende methoden worden gebruikt, zoals kwantitatieve PCR.Daarnaast kan het pGR-insert worden uitgesneden en geligeerd in een plasmide naar keuze.

rapid-verification-terminators-using-pgr-blue-plasmid-golden-gate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

Dit protocol beschrijft een methode voor het afleiden van DNA-strengverplaatsingspoorten vanuit plasmiden en het testen ervan met behulp van fluorescentie-kinetische metingen. De poorten kunnen modulair worden samengesteld tot meercomponentensystemen om het gedrag van formele chemische reactienetwerken (CRN) te benaderen, wat een nieuw gebruik van CRN's als moleculaire programmeertaal aantoont.

Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Hier presenteren we een protocol om een gen van belang dat betrokken is bij plasmide-conjugatie uit te schakelen en vervolgens het effect van het ontbreken ervan te analyseren met behulp van paringstests. De functie van het gen wordt verder onderzocht tot een specifiek gebied van zijn sequentie met behulp van deletie- of puntmutaties.

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.

Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

Leer hoe je terminatorsterkte snel kwantificeert met Golden Gate Assembly en de PGR-Blue plasmid. Deze methode valideert bio-informatica-geïdentificeerde sequenties in minder dan een week.

Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly

Meer video's verkennen