Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR

Het algemene doel van deze procedure is om hoog opbrengst en kwaliteit DNA en RNA te extraheren uit kustmariene sedimenten en vervolgens 16S ribosomale RNA genen en transcripten te kwantificeren. Deze methode die DNA en RNA extractie uit mariene sedimenten beschrijft, gevolgd door kwantitatieve PCR, is een sleutelstap in de moleculaire analyse van microbiële abundantie en diversiteit in het milieu. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om DNA en RNA uit hetzelfde monster te co-extraheren, wat vervolgens kan worden gebruikt voor downstream-analyse, zoals kwantitatieve PCR.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Enrico Tatti van NUI Galway en Duncan Sweeney, een PhD-student van de University of Essex. Om DNA en RNA te co-extraheren uit kustsediment na het voorbereiden van RNA-vrije materialen en het verzamelen van kustsedimentmonsters volgens het tekstprotocol, breng je 0,5 gram sediment over naar een lyseerbuis met twee milliliter kralen. Voeg 500 microliters CTAB-fosfaatbuffer en 500 microliters fenol:chloroform:isoamylalcohol toe aan de buis en draai vijf tot 10 keer om het monster te homogeniseren.

Vortex gedurende 2,5 minuten op volle snelheid voordat je bij 16.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten centrifugeert. Trek vervolgens in een afzuigingskast de bovenste waterige laag af en breng deze over in een nieuw steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Plaats de monsters vervolgens op ijs en voeg 500 microliters ijskoud chloroform:isoamylalcohol toe.

Keer vervolgens de buis om totdat een emulsie zichtbaar is en centrifugeer zoals eerder. Trek in een afzuigingskast de bovenste waterige laag af en plaats deze in een nieuw steriele 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens twee volumes van 30%PEG natriumchloride-oplossing toe om de nucleïnezuren te precipiteren en meng goed.

Incubeer gedurende twee uur op ijs of laat de monsters overnacht bij vier graden Celsius. Na de incubatie, centrifugeer de monsters bij 16.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een micropipet en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.

Laat ongeveer 10 microliters PEG-oplossing in de buis en voeg een milliliter ijskoud 70%ethanol toe. Gebruik na het centrifugeren een micropipet om langzaam het ethanol te verwijderen, zorg ervoor dat het pellet niet wordt aangeraakt. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf seconden en verwijder het resterende ethanol.

Laat het pellet vijf minuten aan de lucht drogen voordat je 50 microliters DEPC-behandeld water gebruikt om het op te schorten. Neem een ​​aliquot van 15 microliter voor DNA en 30 microliter voor RNA. De meest kritische stap is om ervoor te zorgen dat de DNA/RNA pellet niet wordt losgemaakt tijdens het verwijderen van het supernatant en dat er geen resterend ethanol aanwezig is voordat het pellet in water wordt opgeschort, omdat dit downstream moleculaire reacties remt.

Om het DNA in het RNA-monster te verteren, voeg je drie microliters DNase I-buffer en 1,5 microliters DNase I toe aan de 30 microliter nucleïnezuur-aliquot. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Meng het DNase-inactivatiereagens door 30 seconden te vortexen.

Voeg vervolgens 4,8 microliters van de oplossing toe aan het monster en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, tik af en toe op de bodem van de buizen om de oplossing te mengen. Na het centrifugeren van het monster, breng je het supernatant dat RNA bevat over naar een nieuwe buis, zorg ervoor dat je het precipitaat niet overbrengt. Om de RNA-kwaliteit te controleren, verdun je twee microliters RNA, één op tien, door 18 microliters steriele RNase-vrije gedeïoniseerd water toe te voegen.

Voeg in afzonderlijke PCR-reacties één microliter van onverdund of één op tien verdund RNA toe aan een steriele 0,5 milliliter PCR-buis. Volg de tabel in het tekstprotocol en voeg de PCR-reactiecomponenten toe om het 16S ribosomale RNA-gen te versterken. Neem een ​​positieve controle, een PCR-remmercontrole en een negatieve controle op.

Voer vervolgens de PCR-reacties uit met de volgende amplificatieparameters. Om eerste-streng cDNA van RNA te genereren, voeg je de reactiereagentia toe aan een 0,2 milliliter PCR-buis volgens het tekstprotocol. Incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius.

Plaats de monsters vervolgens gedurende ten minste één minuut op ijs voordat je ze gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius incubeert. Voeg na de incubatie de reagentia in de tabel hier vermeld toe volgens het tekstprotocol en incubeer gedurende 50 minuten bij 55 graden Celsius. Deactiveer vervolgens de reactie gedurende 10 minuten bij 72 graden Celsius.

Na het genereren van DNA- en RNA-standaarden voor qPCR volgens het tekstprotocol, ontdooi je omgevings-DNA en cDNA-monsters, standaarden en qPCR-reagentia op ijs. Verdun de nucleïnezuurstandaarden en bereid een verdunning van één op tien van de omgevings-DNA en cDNA van onverdund tot 10 tot min drie. Maak een mastermix voor het totale aantal reacties plus 10% en meng goed.

Voeg 19 microliters mastermix en één microliter template toe in drievoud aan elke put in een 96-puts optische qPCR-plaat. Gebruik een qPCR-optische deksel om de plaat af te dekken. Centrifugeer de plaat vervolgens kort en laad deze in de verwarmingsmodule van de qPCR-machine.

Open vervolgens de qPCR-managersoftware, klik op het tabblad Protocol, klik op Nieuw maken en voeg de volgende amplificatievoorwaarden toe. Stel het monstervolume in op 20 microliter, klik op OK en sla het protocol op. Kies nu het tabblad Plaat.

Klik vervolgens onder Bewerken geselecteerd op Selecteer fluorofoor. Voeg de reporterkleurstof toe voor de juiste sonde en klik op OK. Markeer de putten die de standaarden bevatten, selecteer Standaard in het menu Voorbeeldtype en kies Replicareeks om de replicaatgrootte te veranderen in drie en klik op Toepassen.