Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters

Het algemene doel van Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging, of RSEPRI, is het verschaffen van kwantitatieve informatie over zuurstofconcentratie, pH, redoxstatus en de concentratie van signaleringsmoleculen die nuttig zijn voor biomedisch onderzoek. EPRI is een instrument dat kan worden gebruikt om kernvragen in kankeronderzoek met betrekking tot de tumoromgeving te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van rapid-scan EPR-imaging is dat er in een veel kortere tijd meer informatie kan worden verzameld, met een grotere variëteit aan sonde-moleculen vergeleken met continuous wave of CW EPR-imaging.

Moleculen die gevoelig zijn voor de redoxstatus of de pH vormen een goed voorbeeld van waar rapid-scan EPRI echt uitblinkt. Begin deze procedure met de berekening van de rapid-scan experimentele condities zoals vastgesteld in het tekstprotocol. Een belangrijk onderdeel van rapid-scan is het begrijpen van de afhankelijkheid van het signaal van de bandbreedte van de resonator en experimentele condities zoals de veegbreedte van de scanfrequentie.

Om het experiment echt te optimaliseren, moet u deze drie aspecten begrijpen. De driver van de rapid-scan spoel heeft twee versterkers. Bij het selecteren van een condensator moet de condensatorbox in balans zijn met een gelijke capaciteit aan elke zijde van de box.

De twee zijden staan in serie. Schroef de bovenkant van de condensatorbox los en plaats aan beide zijden condensatoren met de bepaalde waarde. Plaats de bovenkant van de condensatorbox terug en schroef deze vast om te zorgen dat deze op zijn plaats blijft.

Pas met behulp van het voorpaneel van de driver voor de resonerende spoel de uitgangsfrequentie aan totdat de sinusvormige golfvorm de maximale amplitude heeft. Om de radicalen voor te bereiden, haalt u N-15 PDT uit de vriezer en laat u de container op kamertemperatuur komen. Weeg 1,4 milligram N-15 PDT af met een analytische balans.

Voeg 1,4 milligram N-15 PDT toe aan 15 milliliter gedeïoniseerd water voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolair. Combineer vervolgens 50 milligram BMPO met vijf milliliter water in een kwartsirradiatiebuis van 16 millimeter. Voeg 100 microliter 300 millimolair waterstofperoxide toe.

Bestraal het mengsel in de 16 millimeter kwartsbestralingsbuis gedurende vijf minuten met een mediumdruk ultravioletlamp van 450 watt. Breng met een glazen transferpipet 2,5 milliliter van de bestraalde BMPO-OH-oplossing over vanuit de kwartsbestralingsbuis naar één zijde van een 16 millimeter kwartsmonsterbuis met een scheidingswand van drie millimeter. Breng de resterende 2,5 milliliter bestraalde BMPO-OH over naar de andere zijde van de kwartsmonsterbuis met de scheidingswand.

Een tweede kritische stap is het begrijpen van de vermogensverzadigingscurve. Naarmate de scansnelheid toeneemt, heeft u toegang tot hogere vermogens en grotere signaalamplituden voordat uw signaal verzadigd raakt. Grotere signaalamplituden zijn een andere manier om uw acquisitietijd te verkorten.

Stel eerst de resonator af met een waterig monster van het nitroxideradicaal door het monster van 15 milliliter 0,5 millimolair N-15 PDT in water in een 16-millimeter kwartsbuis voor elektronenspinresonantie te plaatsen. Plaats de kwartsbuis in de detectiezijde van de cross-loop rapid scan elektronenspinresonantie- of RSEPR-resonator. Wijzig de frequentie van de bron van het instrument totdat deze overeenkomt met de frequentie van de detectiezijde waarin het monster zich bevindt.

Wijzig nu de frequentie van de excitatiezijde zodat deze overeenkomt met de frequenties van de experimentele bron en de detectiezijde van de resonator. Wijzig de frequentie van de excitatiezijde door een variabele condensator binnen de resonatorholte te draaien. Schakel de spectrometer in om de instrumentenconsole en de hoofdmagneet in te stellen, en kies een experiment dat transiënte gegevens registreert met de tijd op de abscisse.

Voer een vermogensverzadigingscurve uit op een standaard nitroxideradicaalmonster onder dezelfde experimentele omstandigheden die gebruikt zullen worden om radicalen te bestuderen die gevoelig zijn voor pH of redoxstatus. Zodra het systeem is ingesteld, worden gradiënten handmatig of via een computerprogramma toegepast voor het beeldexperiment. De EPR-signaalintensiteit is direct proportioneel aan het microgolfveld in de resonator dat ervoor zorgt dat de spin van het ene energieniveau naar het volgende gaat.

Dit microgolfveld wordt B1 genoemd. B1 is proportioneel aan de vierkantswortel van het microgolfvermogen. Wanneer het microgolfvermogen wordt verviervoudigd, verdubbelt B1. In deze figuur wordt het vermogen verviervoudigd van 8 naar 32 milliwatt, en B1 verdubbelt van 18 naar 36 milliGauss.

Een verzadigingscurve voor het vermogen kan worden opgesteld door de relatieve amplitude uit te zetten als functie van de wortel uit het microgolfvermogen, of, indien de efficiëntie van de resonator bekend is, B1. Het lineaire deel van deze curve geeft het vermogensgebied aan waarin het EPR-signaal niet verzadigd of vervormd is. Een van de voordelen van een rapid-scan experiment is dat het lineaire vermogensbereik is uitgebreid, weergegeven door de gekleurde stippen, in vergelijking met het reguliere CW-experiment, weergegeven door de zwarte stippen. Hier wordt een tweedimensionale spectrale ruimtelijke afbeelding getoond van phantoms bestaande uit een BMPO-OH-adduct, gescheiden door drie millimeter bij een concentratie van vijf micromolair.

Een doorsnede van de afbeelding toont de spectrale vorm bij 250 megahertz. Deze afbeelding toont het N-14 nitranylradicaal, dat gebruikt kan worden voor het vangen van stikstofmonoxide in vivo in een fantoom, waarbij een wand van 1,5 millimeter dik twee monsterkamers scheidt. De spectrale vorm bij 250 megahertz wordt hier getoond.

De tweedimensionale afbeelding van pH-gevoelige triarylmethylradicalen weerspiegelt het verschil in spectrale kenmerken wanneer de pH van de fosfaatbuffer gelijk is aan 7,0 of wanneer de pH gelijk is aan 7,4. Deze afbeelding toont N-15 dinitroxide in een phantom met twee compartimenten en een spacer van 10 mm. Aanvankelijk bevatten beide compartimenten 0,5 mM probe.

Toevoeging van glutathion aan het dinitroxide verbreekt het gereduceerde linkergebied en produceert twee mononitroxiden, een verandering die wordt weerspiegeld in de tweedimensionale afbeelding. De ontwikkeling van rapid-scan EPR vormt een complete paradigmaverschuiving in ons vermogen om moleculen met ongepaarde elektronen te bestuderen. Vandaag heeft u de toepassing hiervan op in vivo EPR gezien, maar het biedt ook prachtige mogelijkheden voor laagtemperatuurstudies van verbindingen met metalen en vele andere soorten systemen.

Voor alle monsters die we tot nu toe hebben bestudeerd, hebben we een verbetering in de signaal-ruisverhouding behaald van ten minste een grootteorde en soms zelfs meer.