Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters In Vivo
26 september 2016
Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.
Het algemene doel van Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging, of RSEPRI, is om kwantitatieve informatie te verschaffen over zuurstofconcentratie, pH, redoxstatus en concentratie van signaalmoleculen die nuttig zijn voor biomedisch onderzoek. EPRI is een hulpmiddel dat kan worden gebruikt om belangrijke vragen in kankeronderzoek te beantwoorden met betrekking tot het tumoromgeving. Het grote voordeel van rapid-scan EPR-beeldvorming is dat je meer informatie kunt verzamelen in een veel kortere tijd, met een grotere verscheidenheid aan sondevoedingsmiddelen in vergelijking met continue wave of CW EPR-beeldvorming.
De moleculen die gevoelig zijn voor redoxstatus of pH zijn een goed voorbeeld van waar rapid-scan EPRI echt uitblinkt. Begin deze procedure met de berekening van de experimentele omstandigheden voor rapid-scan zoals bepaald in het tekstprotocol. Een belangrijk onderdeel van rapid-scan is om de afhankelijkheid van het signaal te begrijpen op de resonatorbandbreedte en experimentele omstandigheden zoals de breedte van de frequentieveeg van de scan.
Om het experiment echt te optimaliseren, moet je alle drie begrijpen. De rapid-scan spoeldriver heeft twee versterkers. Bij het selecteren van een condensator, moet de condensatorbox worden uitgebalanceerd met een gelijke capaciteit aan elke kant van de doos.
De twee kanten zijn in serie. Schroef de bovenklep van de condensatorbox los en plaats condensatoren aan beide kanten die gelijk zijn aan de bepaalde waarde. Plaats de bovenkant van de condensatorbox terug en schroef deze vast om ervoor te zorgen dat deze blijft zitten.
Gebruik de voorkant van de geregelde spoeldriver om de uitgangsfrequentie aan te passen tot de sinusvormige golfvorm de maximale amplitude heeft. Om de radicalen voor te bereiden, haal de N-15 PDT uit de vriezer en laat de container op kamertemperatuur komen. Weeg 1,4 milligram N-15 PDT af met een analytische balans.
Voeg 1,4 milligram N-15 PDT toe aan 15 milliliter gedeïoniseerd water voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolair. Combineer vervolgens 50 milligram BMPO met vijf milliliter water in een 16 millimeter kwartsbestralingbuis. Voeg 100 microliter 300 millimolair waterstofperoxide toe.
Bestraal het mengsel in de 16 millimeter kwartsbestralingbuis met een middelhogedruk 450 watt ultraviolette lamp gedurende vijf minuten. Gebruik een glazen transferpipet om tweeënhalve milliliter van de bestraalde BMPO-OH-oplossing over te brengen uit de kwartsbestralingbuis en in één kant van een 16 millimeter kwartsmonsterbuis met een drie millimeter verdeler. Breng de resterende tweeënhalve milliliter van bestraalde BMPO-OH over in de andere kant van de kwartsmonsterbuis met de verdeler.
Een tweede kritieke stap is om de vermogensverzadigingscurve te begrijpen. Naarmate de scansnelheid toeneemt, krijgt u toegang tot hogere vermogens en grotere signaalamplitudes voordat uw signaal verzadigd raakt. Grotere signaalamplitudes is een andere manier om uw acquisitietijd te verminderen.
Stel eerst de resonator af met een waterige monster van de nitroxide radicale door de 15-milliliter monster van 0,5 millimolair N-15 PDT in water in een 16-millimeter kwarts elektronenparamagnetisch resonantiebuis te plaatsen. Plaats de kwartsbuis in de detectiezijde van de cross-loop rapid scan elektronenparamagnetische resonantie of RSEPR-resonator. Wijzig de frequentie van de instrumentbron tot deze overeenkomt met de frequentie van de detectiezijde die het monster bevat.
Verander nu de frequentie van de excitatiezijde om deze te laten overeenkomen met de frequenties van de experimentbron en detectiezijde van de resonator. Verander de frequentie van de excitatiezijde door een variabele condensator in de resonatorholte te draaien. Zet het instrumentconsole en de hoofdmagneet in door de spectrometer aan te zetten en een experiment te kiezen dat transiente gegevens met tijd op de as registreert.
Voer een vermogensverzadigingscurve uit op een standaard nitroxide radicaalmonster onder dezelfde experimentele omstandigheden die zullen worden gebruikt om radicalen te bekijken die gevoelig zijn voor pH of redoxstatus. Zodra het systeem is ingesteld, worden gradiënten handmatig of via een computerprogramma toegepast voor het beeldvormingsexperiment. EPR-signaalintensiteit is direct evenredig met het microgolfveld in de resonator dat de spin van het ene energieniveau naar het volgende laat gaan.
Dit microgolfveld wordt B1 genoemd. B1 is evenredig met de vierkantswortel van microgolfvermogen. Wanneer het microgolfvermogen wordt verviervoudigd, wordt B1 verdubbeld. In deze afbeelding wordt het vermogen verviervoudigd van acht tot 32 milliwatt, en B1 wordt verdubbeld van 18 tot 36 milliGauss.
Een vermogensverzadigingscurve kan worden opgesteld door de relatieve amplitude uit te plotten als functie van de vierkantswortel van microgolfvermogen, of als de resonator-efficiëntie bekend is, B1. Het gebied van deze curve dat lineair is, toont het vermogensgebied waarin het EPR-signaal niet verzadigd of vervormd is. Een van de voordelen van een rapid-scan-experiment is dat de lineaire vermogensbereik wordt uitgebreid, weergegeven door de gekleurde punten, in vergelijking met het reguliere CW-experiment weergegeven door de zwarte punten. Hier wordt een tweedimensionaal spectraal ruimtelijk beeld van fantomen weergegeven, bestaande uit een BMPO-OH-additief gescheiden door drie millimeter op een concentratie van vijf micromolair.
Een doorsnede door het beeld toont de spectrale vorm bij 250 megahertz. Dit beeld toont de N-14 nitranyi radicale die kan worden gebruikt voor het vangen van stikstofmonoxide in vivo in een fantoom, waar een een-en-een-halve millimeter dikke wand twee monsterkamers scheidt. De spectrale vorm bij 250 megahertz wordt hier getoond.
Het tweedimensionale beeld van pH-gevoelige triarylmethylradicalen weerspiegelt het verschil in spectrale kenmerken wanneer de fosfaatbuffer pH gelijk is aan zeven punt nul, of de pH gelijk is aan zeven punt vier. Dit beeld toont N-15 dinitroxide in een tweekamerige fantoom met een 10 millimeter tussenruimte. Aanvankelijk bevatten beide compartimenten 0,5 millimolair sonde.
Toevoeging van glutathion aan de dinitroxide breekt de gereduceerde schakelregio en produceert twee mononitroxiden, een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe elektronparamagnetische resonantie (EPR)-methode, bekend als rapid scan EPR (RS-EPR), voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming. RS-EPR biedt voordelen ten opzichte van traditionele continuous wave (CW)-technieken, met name in de context van in vivo beeldvormingsapplicaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomedische beeldvorming
- Elektronenspinresonantie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging (RSEPRI) levert kwantitatieve gegevens over diverse biologische parameters.
- Het is bijzonder nuttig voor het beoordelen van tumoromgevingen in kankeronderzoek.
- De techniek maakt een snellere gegevensverwerving mogelijk in vergelijking met traditionele methoden.
- Het kan gebruikmaken van een bredere variëteit aan sonde-moleculen die gevoelig zijn voor de redoxstatus en pH.
Doel van de studie
- Om beeldvormingstechnieken voor biomedisch onderzoek te verbeteren.
- Om gedetailleerde informatie te verschaffen over zuurstofconcentratie, pH en signaleringsmoleculen.
- Om het begrip van de tumoromgeving te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Berekening van experimentele condities voor rapid-scan.
- Beoordeling van de signaalafhankelijkheid van de resonatorbandbreedte.
- Evaluatie van experimentele condities, zoals de veegbreedte van de scanfrequentie.
- Toepassing van RS-EPR bij 250 MHz, met potentieel voor andere frequenties.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van de superioriteit van RS-EPR ten opzichte van CW EPR bij beeldvorming.
- Vermogen om meer informatie te verkrijgen binnen een korter tijdsbestek.
- Succesvolle beeldvorming van moleculen die gevoelig zijn voor redoxstatus en pH.
- Potentieel voor bredere toepassingen in in vivo beeldvorming.
Conclusies
- RS-EPR vormt een significante vooruitgang in EPR-beeldvormingstechnieken.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar kanker en andere biomedische gebieden.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing ervan uitbreiden over verschillende frequenties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Rapid-scan EPR-imaging maakt een kwantitatieve real-time beoordeling mogelijk van fysiologisch kritische parameters zoals zuurstofspanning, pH, redoxstatus en reactieve signaleringsmoleculen in levende systemen. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanische risicoreductie in het onderzoek naar oncologie en inflammatoire ziekten door directe uitlezingen te verschaffen van micro-omgevingscondities die de therapeutische respons en resistentie beïnvloeden. De verbeterde gevoeligheid, ruimtelijke resolutie en acquisitiesnelheid van de methode vergroten het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen, wat vroegere go/no-go-beslissingen in workflows voor targetvalidatie en lead-optimalisatie faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de dynamiek van oxygenatie, pH en redox in ziekte-relevante modellen in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs van micro-omgevingsbiomarkers om pathway-activiteit en target engagement te verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door veranderingen in het probesignaal te correleren met functionele fenotypen, wat het vertrouwen in de relaties tussen target en ziekte vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare spectraal-ruimtelijke beelden van radicaal-reportermoleculen die gevoelig zijn voor fysiologische stimuli.
- Kwantitatieve output: Levert concentratie-afhankelijke signaalveranderingen voor zuurstof, pH en redoxsoorten, wat dosis-responsprogramma's en inhibitorprofilering mogelijk maakt.
- Herbruikbaarheid van het platform: Compatibel met diverse sonde-moleculen (bijv. BMPO-OH voor •OH, nitranyl voor NO•, triarylmethyl voor pH) in meerdere experimentele opstellingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Beeldt direct tumorhypoxie, acidose en oxidatieve stress in—belangrijke kenmerken van kankerprogressie en therapieresistentie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase en preklinische validatie door dezelfde biomarkers over verschillende modellen heen te monitoren.
- Risicogebaseerde vooruitgang: Maakt longitudinale tracking van veranderingen in de micro-omgeving mogelijk om doseringsschema's en combinatiestrategieën te informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Rapid-scan EPR past binnen het continuüm van ontdekking, van het testen van doelwithypothesen via lead-identificatie tot preklinische effectbeoordeling, vooral wanneer modulatie van de micro-omgeving een werkingsmechanisme of resistentiefactor is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door te visualiseren hoe genetische of farmacologische verstoringen de parameters voor zuurstof, pH of redox in cellulaire en weefselmodellen veranderen.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor verbindingen die hypoxische signalering, antioxidant-paden of pH-regulerende enzymen moduleren via meetbare EPR-verschuivingen.
- Analytica: Biedt kwantitatieve, ratiometrische metingen van de signaalintensiteit en spectrale vorm van de probe, waardoor vergelijking tussen condities en tijdspunten mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met in vivo relevantie door dezelfde radicaalreporters af te beelden in fantomen en levende systemen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Fungeert als een niet-destructieve plug-and-play beeldmodules die compatibel is met bestaande preklinische beeldvormingssuites en aanpasbaar is aan diverse probe-chemieën.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door ambiguïteit in micro-omgevingsbijdragen aan het fenotype te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en doorvoer door snellere acquisitie en een hogere signaal-ruisverhouding vergeleken met CW-EPR.
- Strategische waarde: Optimaliseert de triage van het portfolio door verbindingen die falen vanwege ongunstige micro-omgevingsinteracties vroeg in de ontwikkeling te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde toewijzing van middelen mogelijk door prioriteit te geven aan agentia met gunstige effecten op tumoroxygenatie, pH-normalisatie of redoxbalans.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in EPR-spectroscopie, radicaalchemie en de verwerking van biologische monsters.
- Toegang tot een rapid-scan EPR-spectrometer met cross-loop resonator en gradiëntmogelijkheden voor 2D-imaging is noodzakelijk.
- Standaardisatie van sondevoorbereiding, kalibratie en omgevingscontroles (temperatuur, vochtigheid) over verschillende locaties is vereist.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende radicaalreporters (bijv. pH-gevoelig versus redox-gevoelig) en weefseltypes (fantoom, ex vivo, in vivo).
- Praktische beperkingen omvatten de stabiliteit van de sonde, biobeschikbaarheid en potentiële achtergrondsignalen van endogene radicalen in complexe biologische matrices.
