Name: Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer intravitale beeldvorming van neutrofielen priming met IL-1β-DsRed reporter muizen. Deze methode combineert fluorescentie, in vivo labelen en intravitale microscopie voor real-time visualisatie van immuunresponsen in zeldzame ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of Toledo goedgekeurd. 1. fenotypering van pIL1-DsRed Muizen LET OP: Offspring worden gegenereerd door heterozygote pIL1-DsRed muizen fokken met wild-type (WT) C57BL6 muizen. Drie tot vier weken oude pups worden beschouwd als klaar voor fenotypering. Submandibulaire bloeden muizen volgt een gevestigde protocol met kleine aanpassingen 23. <ol><li> Isolatie van witte bloedcellen uit het bloed in zijn geheel van de Muis Pups <ol><li> Voeg 20 ul heparine elk 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Verwerven van een pup uit de kooi. Noteer het identificatielabel van de pup. Het is niet verplicht om pups voor bloedafname verdoven van de submandibulaire ader. </li><li> Houd de pup bij de hals nekvel en doorboren de submandibulaire ader in the wang zakje met behulp van een 5 mm lancet. Toepassen voldoende kracht om een ​​kleine punctie te creëren, zodat druppels bloed stralen vanaf het punt van penetratie. Gebruik een nieuwe naald voor elke pup. </li><li> Verzamel 3-5 druppels bloed per pup in een heparine bevat microcentrifugebuis. Reinig de prikplaats en toe te passen druk om hemostase te vergemakkelijken. </li><li> Zet pup in de nieuwe kooi en te observeren gedurende 30 minuten alvorens terug te keren de kooi om het dier faciliteit. </li><li> Verzamel bloed van volwassen muizen van een bekend fenotype als positieve en negatieve controles. </li><li> Voeg 500 pl rode bloedcellen lyserende buffer aan elke buis, vortex buizen en incubeer gedurende 5-10 min op ijs. </li><li> Voeg langzaam 400-500 ul foetaal runderserum (FBS) onder de celsuspensies in elke buis. Een duidelijke interface kan worden waargenomen tussen de bovenlaag celsuspensie en de onderste laag van FBS. </li><li> Dop en centrifugeer monsters bij 1500 x g gedurende 5 min. </li><li> Herhaal stap 1.1.7 - 1.1.9 naar bontther verwijderen rode bloedcellen. Niet herhalen als lysis voldoende is de eerste keer. De pellet zou moeilijk te onderscheiden zijn na centrifugeren. </li></ol></li><li> Lipopolysaccharide (LPS) stimulatie en cultuur <ol><li> Resuspendeer cellen in 200 ul van complete Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium. </li><li> Breng de celsuspensie een flowcytometrie buis. </li><li> Voeg LPS werkoplossing door 10 gl LPS stockoplossing (1 mg / ml) met 990 ul volledig RPMI 1640 medium. </li><li> Voeg 20 ul van 10 ug / ml LPS werkoplossing 200 gl celsuspensie. </li><li> Cap buizen los en incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li><li> Flowcytometrieanalyse <ol><li> Open het data acquisitie programma voor flowcytometrie. Opzetten overname sjabloon voorafgaand aan de overname te proeven. </li><li> Klik op de Dot-Plot gereedschap in het palet tool. Teken een forward verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) plot. Stel de FSC en SSC spanning parameters lineaire schaal. </li><li> Selecteer de laagste drempel van FSC en SSC toegestaan ​​door de cytometer. Solliciteer drempels 200 en 50 voor FSC en SSC, respectievelijk. </li><li> Binnen het FSC vs SSC plot, trekken een poort G1 die monocyten, granulocyten en dendritische cellen bevat, en sluit puin, rode bloedcellen en lymfocyten. </li><li> Klik op de Histogram functie in het palet tool. Teken een FL2 (rode fluorescentie kanaal) histogram. Gebruik een negatieve controle monster naar de basislijn van FL2 signalen en een positieve controle sample ingesteld op een poort te vestigen op alle DsRed positieve gebeurtenissen bevatten. </li><li> Op het paneel Fluidics controle van de cytometer, zet de vloeistof in op &quot;RUN&quot; en het debiet &quot;HI&quot; (ongeveer 60 pl / min). Acquire 10.000 events voor elk monster. </li><li> Bepaal pup fenotype door meting van het percentage DsRed positieve cellen van de poort G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Inductie van huidontsteking in pIL1-DsRed Muizen <ol><li> Verdoven muizen door intraperitoneale (ip) injectie van een anestheticum cocktail bevattende 100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine en 1 mg / kg acepromazine. Adequaat verdoofde muizen niet laten zien achterpoot terugtrekking tot teen knijpen. </li><li> Toepassen ontharingsmiddelen crème op het dorsale oppervlak van beide oren van de muis. Wacht 30 sec tot 1 min. Veeg oor oppervlak met water bevochtigde katoen en laat aan de lucht drogen. </li><li> Meet de dikte van het oor met behulp van micrometer en de muis te vervangen in een aparte kooi. Observeren tot herstel van de anesthesie (~ 15-30 min). Om ontsteking van de huid veroorzaakt door de ontharing product te verhelpen, laat de muis om te rusten voor 3 dagen voordat verdere experimenten wordt uitgevoerd. </li><li> Bereid 1,25% (w / v) OX door het oplossen van 16,7 mg van OX in 1 ml aceton en mengen van 750 ui OX / acetonoplossing met 250 ui olijfolie. Bereid drageroplossing door het mengen van 750 ui aceton en 250# 181; l olijfolie. </li><li> Re-verdoven de muis door ip injectie van anesthesie cocktail (2.1). Meet de oordikte als voorheen. </li><li> Solliciteer 12,5 ul van 1,25% OX op elke zijde van rechteroor. Solliciteer 12,5 ul van aceton / olijfolie oplossing olie voertuig op elke zijde van de linker oor. </li><li> Houd de muis los van kooi-mates tot volledig hersteld om belediging aan zijn oren te voorkomen door andere muizen, vervang dan de muis in zijn oorspronkelijke kooi en terug te keren naar huis dier faciliteit. OPMERKING: verwijdering van het haar kan leiden tot lichte ontsteking van de huid gevolgd door verandering van de dikte van het oor. Deze minor ontsteking zal 3 dagen later opgelost worden bevestigd door de normale dikte van het oor. Na topische toediening voor 24 uur, OX-behandelde oren tonen significante (p &lt;0,01) vergeleken zwelling drageroplossing alleen behandelde oren. </li></ol> 3. Etikettering van neutrofielen in pIL1-DsRed Muizen LET OP: In vivo labeling van neutrofielen door lage dosis f-luorescence geconjugeerd neutrofielen-specifieke mAb volgt op een recent ontwikkelde protocol 19. Retro-orbitale injecties worden uitgevoerd volgens een vastgesteld protocol met een paar wijzigingen 24. <ol><li> Bereid anti-Ly6G mAb werkoplossing door verdunnen van 10 pl 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-Ly6G mAb (kloon 1A8) in 90 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Transfer 100 ul anti-Ly6G mAb werkoplossing (50 ug / ml) in een U-100 insulinespuit met 28 gauge naald. </li><li> Verdoven volwassen pIL1-DsRed muis door ip injectie van het eerder beschreven anestheticum cocktail (2,1). Plaats de verdoofde muis buik naar beneden op een schone werkende board. </li><li> Pas lichte neerwaartse druk op de huid dorsale en ventrale een muis oog op de oogbol uit het stopcontact gedeeltelijk uitsteken. </li><li> Plaats het naald, afschuinen beneden onder een hoek van ongeveer 30 ° bij de binnenste ooghoek in de retro-orbitalesinus. LET OP: De operator kan de druk, de penetratie en opgelucht weerstand zodra de naald inserts in de sinus voelen. </li><li> Langzaam en vloeiend Injecteer 100 ui van anti-Ly6G mAb werkoplossing (5 ug mAb / muis / injectie) in de muis. Verwijder de naald snel. Een kleine hoeveelheid bloeden suggereert een succesvolle injectie. </li><li> Onmiddellijk van toepassing 1,25% OX en oplossing voertuig op de rechter en linker muisknop oren. </li><li> Na 8 uur, het beheer van 100 ul van vers bereide anti-Ly6G mAb werkende oplossing (5 ug mAb / muis / injectie) via retro-orbitale injectie in dezelfde muis. </li><li> De bloedvaten te visualiseren, onmiddellijk voor beeldvorming, bestuurt 100 pl 30 mg / ml fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd dextran (150 kDa) door middel van retro-orbitale injectie. </li></ol> 4. Intravitale Imaging van neutrofielen Priming in PIL-1-DsRed Muizen <ol><li> Verdoven muis met ip injectie van anesthesie cocktail (2.1).0; Breng veterinaire zalf om de muis ogen om uitdroging te voorkomen, terwijl onder verdoving voor de beeldvorming. <ol><li> Bereid 1 ml halve dosis anestheticum cocktail van verdunning 500 ul originele anestheticum cocktail met een gelijk volume PBS. </li><li> Transfer halve dosis verdoving cocktail tot 1 ml spuit met een naald vlinder 27. </li><li> Breng de naald van de vlinder in de muis buik intraperitoneaal en bevestig de vlinder vleugel aan de buik van tapen. </li></ol></li><li> Plaats een glazen dekglaasje in het midden van de afbeeldeenheid. Tape de randen van het dekglaasje om het te houden op zijn plaats. </li><li> Een druppel PBS op het ventrale oppervlak van de muis oor en op het dekglaasje. </li><li> Positie verdoofd muis met haar oor over het dekglaasje. Monteer de punt van het oor, dorsale zijde naar beneden, door daartussen het oor tussen het dekglaasje en een glasplaatje, ook op zijn plaats gehouden via tape. </li><li> Schakel een multi-laser fluorescentie confocale microscoop en alle daarmee verband equipment. Schakel de kamer lichten aan het omgevingslicht blootstelling te minimaliseren. </li><li> Open de afbeelding acquisitie software. Selecteer de laser kanalen voor de detectie van fluorescerende kleurstoffen in het menu Dye List. </li><li> Stel de focus op de ontstoken oorhuid door waarneming van groene signalen van de bloedvaten en rode signalen van de DsRed + cellen door oculair. </li><li> Voer een snelle scan met een scansnelheid van 2 ps / pixel en de resolutie van 512 × 512 pixels. Selecteer een pseudocolor voor elk kanaal in de Live View-menu. Pas de focus knop om het einde te stellen en start plaats van het scannen. </li><li> Voer langzaam scans met een scansnelheid van 4-8 usec / pixel en de resolutie van 800 × 800 of 1024 × 1024 pixels. Regel de hoogspanning, gain en offset op elk kanaal om de intensiteit van de signalen te maximaliseren terwijl het vermijden van verzadiging (rode pixels). Er moeten enkele rode pixels in elk kanaal. </li><li> Maak drie-dimensionaal beeld sets door het scannen van ee oorhuid beginnen oppervlakkig in het stratum corneum en verloopt naar beneden met x, y, z volumes van 317 um x 317 um x 30 urn (40X objectief), 635 um x 635 um x 30 urn (20X objectief) of 1270 micrometer x 1270 micrometer x 50 micrometer (10X objectief) bij 2 micrometer z-stappen. OPMERKING: Het stratum corneum is de buitenste laag van de epidermis en gemakkelijk gelokaliseerde worden op de sterke autofluorescentie signaal. </li><li> In time-lapse imaging experimenten, opnemen driedimensionale beelden om de 2 of 4 min voor maximaal 8 uur. </li><li> Tussenpozen, een muis begint te herstellen van de anesthesie, merkte op basis van waarneming van spiertrekkingen snorharen, beheren 5-10 ul van halve dosis verdoving cocktail met vlinder naald. LET OP: Wees voorzichtig met de verdoving dosis - overdosering kunnen muis dood veroorzaken. Alternatief zou inhalatie-anesthesie in een pot worden toegepast op muis voor kortdurende anesthesie en eenneuskegel kan worden gebruikt voor lange termijn beeldvorming. </li><li> Verwijder de verdoofde muis van de fase beeldvorming is voltooid. Maak tape en verwijder de vlinder naald uit de buik van de muis. Breng de muis naar een aparte kooi in het huis dier faciliteit. LET OP: Voor de korte termijn imaging (&lt;1 uur), muizen volledig herstellen van de anesthesie snel in 1-3 uur. Voor langdurige imaging (~ 8 uur), muizen herstellen langzaam, met een typische herstelperiode van 12-16 uur. Zo wordt orale toediening water aangeraden na ten minste een paar keer tijdens de herstelperiode tot ernstige uitdroging te voorkomen. </li><li> Proces imaging datasets, volgen individuele cellen, het genereren van trekkende paden, en het berekenen van de richting en snelheid van celmigratie met behulp van software voor beeldanalyse 25. </li></ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangensconflicten.

Het doel van deze studie is om een ​​technologie te ontwikkelen voor het monitoren van het proces van neutrofiel priming in levende dieren, die nog niet is vervuld door de huidige beschikbare technieken. Om dit doel te bereiken, worden drie gevestigde methoden uitgevoerd: 1) inductie van huidontsteking in IL-1β-promoter gedreven DsRed reportermuizen als maat voor priming, 2) in vivo labeling van neutrofielen met lage doses van fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb, en 3) intravitale microscopie confocale bee...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende en kortstondige leukocyten in omloop. Ze zijn snel aangeworven om de sites van de infectie of letsel, waar ze dienen als professionele fagocyten door de afgifte van reactieve zuurstof en stikstof tussenproducten, samen met korrels die antimicrobiële peptiden en proteasen 1. Bij rekrutering, neutrofielen worden &quot;geprimed&quot; door verschillende middelen waaronder microbiële producten, chemoattractanten en inflammatoire cytokines, wat resulteert in sterk verhoogde fagocyt-functionaliteit bij aankomst op de plaats van de ontsteking 2. De mechanismen van neutrofiel priming zijn uitgebreid bestudeerd in vitro 3,4; echter, heeft dynamische controle van het proces in vivo niet mogelijk geweest tot nu toe. Recent is intravitale imaging een belangrijke techniek voor het visualiseren en kwantificeren van de dynamica van cellulaire biologische processen in levende organismen worden. Intravital beeldvorming kan worden uitgevoerd via conventionele foton excitatie microscopie (bijvoorbeeld, confocale) of multifoton microscopie benaderingen 5. Na verloop van tijd, zijn substantiële verbeteringen gerealiseerd in deze techniek waardoor verhoogde beeldresolutie, betere beeldvorming diepte, verminderde weefsel photodamage en verbeterde beeldstabilisatie 6,7. Gezien de unieke mogelijkheid om dynamische visualisatie van cellulaire migratie en interactie in de tijd mogelijk te maken, is intravitale microscopie is uitgebreid toegepast op diverse gebieden van onderzoek in de immunologie 8. Intravitale beeldvorming maakt immunologen beter te begrijpen en contextualiseren immuunreacties op zowel het cellulair en moleculair niveau in levende diermodellen. Recente ontwikkelingen in de transgene als knock-in reporter muizen hebben verstrekt handige tools voor het bewaken van het dynamische gedrag van neutrofielen in levende dieren. Lysozym M promoter aangestuurde versterkt groen fluorescent proteïne knock-inmuizen werden breed gebruikt om beweeglijkheid van neutrofielen, monocyten en macrofagen karakteriseren in verschillende ontstekingsprocessen zoals extravasatie, bacteriële infecties en steriele ontstekingen 9-15. Verder zijn transgene muizen die een cytoplasmatische fluorescentie-energieoverdracht biosensor toegepast bij het ​​bestuderen van de activiteiten van neutrofielen extracellulair gereguleerde kinase mitogen en proteïne kinase A in ontstoken darm 16. Een muizenmodel met hoge specificiteit voor fluorescentie expressie in neutrofielen is de Catchup knock-in muizen, waarin Cre recombinase produceert en het fluorescerende eiwit tdTomato, die zelf is gekoppeld om expressie van lymfocyt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisatie van Ly6G-deficiënte neutrofielen via dit model heeft aangetoond dat deze cellen uitoefenen normale functioneren met steriele of infectieuze ontstekingen in vivo context. Transgene muizen die de DsRed fluorescerende pProtein gen onder controle van de muis interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) werden gebruikt om de beweeglijke gedrag van IL-1β cellen zichtbaar - vermoedelijk neutrofielen, inflammatoire monocyten en geactiveerde macrofagen omvatten - opkomende in ontstoken huid 18. In vivo kan de etikettering dienen als een alternatieve aanpak voor het traceren van de cellulaire en moleculaire gedrag van neutrofielen in ontstoken weefsel. Na intraveneuze injectie van lage doses van fluorescent gemerkt anti-Gr-1 monoklonaal antilichaam (mAb), de werving cascade van Gr-1 + neutrofielen werd gevisualiseerd in de muis huidletsels die besmet zijn met Staphylococcus aureus 19. In vivo toediening van conjugaten met streptavidine geconjugeerd 705 nm quantum dots en gebiotinyleerd anti-Ly6G mAb specifiek label circulerende neutrofielen 20. Bovendien endocytose van dergelijke conjugaten in neutrophil vesicles maakt het volgen van snelle vesicle transport in neutrofielen migreren in het interstitium. In vivo labeling met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen tegen P-selectine glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1), L-selectine (CD62L), integrine αM (CD11b ) en chemokine (CXC motief) receptor 2 (CXCR2) in een TNFa-geïnduceerde inflammatoire model heeft de regulerende mechanismen in het spel toegelicht tijdens de vroege ontsteking 21. Gepolariseerde neutrofielen uitsteken PSGL-1 verrijkte uropods om met CD62L aanwezig op geactiveerde bloedplaatjes, waardoor de herverdeling van CD11b en CXCR2, receptoren die neutrofielen migratie rijden en initiëren van de ontsteking. IL-1β is een van de handtekening genen die verhoogd is geprimed 22 neutrofielen. In pIL1-DsRed reportermuizen, DsRed fluorescentiesignalen (bijv. Activering van IL-1β promoter) positief correleren met IL-1β mRNA expressie en IL-1β eiwitproductie. &lt;sup&gt; 18 Om het proces van neutrofiel priming controleren, werd een intravitale microscopie methode ontwikkeld waarbij inductie van huidontsteking met oxazolon (OX) in pIL1-DsRed muismodel na in vivo labeling van neutrofielen met fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb. Via dit model is het mogelijk om het gedrag en functie van geprimede neutrofielen in diermodellen van verschillende ziekten en aandoeningen te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Heparine natrium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Haarverwijderingscrème</td><td>Church &amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-muis Ly6G antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulinespuit met 28 G naald</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infuusset (27 G naald)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravitale imaging van neutrofielen priming gebruik van il-1β-promoter gedreven dsred reporter muizen

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de menselijke bloedsomloop en worden snel aangeworven om inflammatoire sites. Priming is een situatie voordoet die de fagocytische functionaliteit van neutrofielen verhoogt. Hoewel uitgebreide studies van het bestaan ​​en het belang van neutrofielen priming tijdens infectie en schade hebben onthuld, betekent visualiseren dit proces in vivo zijn niet beschikbaar geweest. De geleverde protocol maakt bewaking van het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren door de combinatie van drie methoden: 1) DsRed reporter signaal - gebruikt als maat voor priming 2) in vivo neutrofiel labeling - bereikt door injectie van fluorescentie-geconjugeerd anti-lymfocyt antigen 6G (Ly6G) monoklonaal antilichaam (mAb) en 3) intravitale confocale beeldvorming. Verschillende kritische stappen zijn betrokken bij dit protocol:-oxazolon geïnduceerde muis oor ontsteking van de huid, geschikte sedatie van de dieren, herhaalde injecties van anti-Ly6G mAb en prevention focus drift tijdens de beeldvorming. Hoewel enkele beperkingen waargenomen, zoals de grens van continue beeldvorming tijd (~ 8 uur) in een muis en het lekken van fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran van bloedvaten in de ontstekingstoestand Dit protocol verschaft een basiskader voor intravitale beeldvorming van geprimede neutrofiel gedrag en functie, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot het onderzoek van andere immuuncellen in muizen inflammatiemodellen.

Screening van pIL1 DsRed-muizen uitgevoerd op basis van de fenotypische DsRed fluorescentiesignaal door hun perifere bloed leukocyten middels flowcytometrie. LPS stimulatie is bekend dat IL-1β induceren in myeloïde cellen zoals neutrofielen, monocyten en dendritische cellen 26-28. Aldus worden geïsoleerde leukocyten geïncubeerd met LPS gedurende 4 uur voorafgaand aan flowcytometrie analyse. Vervolgens wordt gating ingesteld circulerende myeloïde cellen op basis van celgrootte ...

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Het algemene doel van deze procedure is om een technologie te presenteren voor het monitoren van het proces van priming van neutrofielen bij levende dieren. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen op het gebied van immunologie te beantwoorden, zoals de visualisatie van het gedrag en de functie van het primen van neutrofielen in diermodellen van zeldzame ziekten en aandoeningen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het drie gevestigde methodologieën combineert, inclusief fluorescente reporters in virale labelen en intravitale beeldvorming.Fokkerij heterozygote pIL1-DsRed muizen met wild-type C57Black zes muizen. Na drie tot vier weken, fenotypeer hun pups. Bereid voor elke pup een buis van 1,5 milliliter met 20 microliter heparine.Om bloed te verzamelen, houd een pup bij de nek en prik de submandibulaire ader in de wangzak met een lancet van 5 millimeter. Slechts een kleine punctie is nodig. Verzamel drie tot vijf druppels bloed per buis.Na de verzameling, zorg ervoor dat het bloeden stopt en observeer de dieren gedurende 30 minuten voordat ze naar de dierfaciliteit worden teruggeplaatst. Voeg aan elke monsterbuis 500 microliter rode bloedcel lyseringsbuffer toe. Daarna, schud de buizen en incubeer ze gedurende vijf tot 10 minuten op ijs.Na de incubatie, voeg langzaam 400 tot 500 microliter foetaal bovien serum toe onder de celsuspensies in elke buis. Er moet een duidelijke interface tussen de lagen ontstaan. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 1.500 Gs gedurende vijf minuten om cel pellets te verzamelen.Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen in 200 microliter compleet RPMI-1640 medium. Breng vervolgens elke suspensie over naar een flowcytometriebuis en voeg 20 microliter vers gemaakte LPS werkoplossing toe aan elke buis. Incubeer de monsters gedurende vier uur voordat flowcytometrie wordt uitgevoerd.Om te beginnen, verdoof de muis met een intraparetoneale injectie van een verdovingscocktail en bevestig adequate sedatie met een teenknijptesti. Breng vervolgens haarverwijderingscrème aan op de dorsale oppervlakte van beide oren, veeg het binnen een minuut af en was de huid met water. Meet de dikte van het oor waar de toepassingen zijn gemaakt met een micrometer.Later, plaats de muis terug in zijn eigen kooi nadat hij is hersteld van de anesthesie, en laat de muis minstens drie dagen rusten voor verdere testen. Na drie dagen, verdooft de muis opnieuw en meet de oordikte opnieuw om er zeker van te zijn dat het niet geïrriteerd is. Breng vervolgens 12,5 microliter van 1,25% oxazolon aan op elke zijde van het rechteroor en breng 12,5 microliter van de aceton olijfolie voer oplossing aan op elke zijde van het linkeroor.Observeer zoals altijd de herstel van de muis van de anesthesie. 24 uur later, meet de dikte van het oor opnieuw onder anesthesie om ervoor te zorgen dat de oxazolon geïnduceerde huid ontsteking heeft plaatsgevonden. Om te beginnen, breng 100 microliter anti-lyse XG monocolonale antilichaam over in een U100 insulinesyringe met een 28 gauge naald.Verdoof vervolgens een behandelde muis zoals eerder beschreven. Met de muis buik omlaag, breng zachte neerwaartse druk uit op de huid dorsaa en ventraal aan een oog om het oogbol gedeeltelijk uit te steken. Breng vervolgens voorzichtig de naald, snede naar beneden, ongeveer 30 graden naar de mediale canthus en steek de naald voorzichtig in de retro orbitale sinus.De penetratiedruk zal worden verlicht wanneer de naald de sinus binnenkomt. Daarna, spuit de inhoud en verwijder de naald snel. Een kleine hoeveelheid bloeden suggereert een succesvolle injectie.Breng nu onmiddellijk 1,25% oxazolon en voer oplossing aan op de rechter en linker muizenoren zoals eerder. Acht uur later, toedien een tweede dosis van hetzelfde antilichaam in elke muis. Ook, om de bloedvaten te visualiseren, toedien retro orbital 100 microliter fitc dextran.Voor deze procedure, verdoof eerst de muis zoals eerder. Breng vervolgens veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging tijdens het beeldvormen te voorkomen. Plaats vervolgens een glazen dekglas in het midden van een beeldvormingsfase, en zet de randen van het dekglas vast met tape.Voeg ook een druppel PVS toe aan het dekglas. Plaats nu de oor van de muis over het dekglas, dorsale zijde naar beneden. Bevochtig vervolgens de ventrale oppervlakte van het muizenoor met een druppel PVS.Monteer vervolgens de punt van het oor met een glazen dia bovenop en zet de dia vast met tape. Schakel nu een multi laser fluorescentie confocale microscoop en de bijbehorende apparatuur in. Schakel de kamerlichten uit om blootstelling aan omgevingslicht te minimaliseren.Neem vervolgens driedimensionale beelden op met behulp van de confocale microscoop. Voor time lapse beeldvormingsexperimenten, neem driedimensionale beelden elke twee tot vier minuten gedurende maximaal acht uur op. Let ondertussen op knipperende snorharen, wat aangeeft dat de muis begint te herstellen van de anesthesie.In dergelijke situaties, toedien vijf tot tien microliter van een halve dosis verdovingscocktail via een vlindernaald. pIL-1-DsRed muizen werden gescreend op fenotypische DsRed fluorescentie geproduceerd in perifere bloed leukocyten via flowcytometrie. Circulerende myeloide cellen van wild-type muizen drukken minimaal DsRed tot expressie, terwijl dezelfde cellen van pIL1-DsRed muizen onderscheidbare DsRed signalen tot expressie brengen.IL-1 bèta promotor activering is een marker van neutrofiel priming, en kan het beste worden gevisualiseerd in levende pIL-1DsRed muizen. Vervolgens werd een huidsensibilisator, oxazolon, topisch aangebracht op het rechteroor. Later werden de neutrofielen gelabeld vóór en na een tweede toepassing van de oxazolon sensibilisator via retro orbitale injectie.Evenzo werd fitc dextran geïnjecteerd om bloedvaten te lokaliseren. Veel dubbel gelabelde cellen werden gevonden in de extravasculaire ruimte

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

This video demonstrates an in vivo technique to assess a test antigen by inducing skin inflammation in a murine model. The test antigen—a hapten in an oil/acetone solution—is topically applied to the skin of the mouse ear, and inflammation of the skin is assessed after an adequate period.

A Technique to Assess the Immune Response against an Antigen by Inducing Skin Inflammation

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

De migratie van neutrofielen is gebaseerd op de snelle en continue hermodellering van het plasmamembraan als reactie op chemoattractant en zijn interacties met de extracellulaire micro-omgeving. Hierin wordt een procedure beschreven op basis van intravitale subcellulaire microscopie om de dynamiek van membraanremodellering te onderzoeken bij neutrofielen die in het oor van verdoofde muizen worden geïnjecteerd.

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Leer intravitale beeldvorming van neutrofielen priming met IL-1β-DsRed reporter muizen. Deze methode combineert fluorescentie, in vivo labelen en intravitale microscopie voor real-time visualisatie van immuunresponsen in zeldzame ziekten.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Meer video's verkennen