Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Het algemene doel van dit experiment is om geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPC's, te genereren uit fibroblast-achtige synoviocyten geïsoleerd uit het synoviale weefsel van een ontstoken reumatoide gewricht. Momenteel kunnen iPSC's worden gegenereerd uit verschillende menselijke primaire cellen. We hebben met succes iPSC's gegenereerd uit menselijke fibroblast-achtige synoviocyten, wat de belangrijkste pathologische cellen zijn van reumatoide gewrichten.

Dit kan helpen bij het onderzoeken van de pathologie van reumatoïde artritis. Dit tijdschrift kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de degeneratie van IPSC's, met behulp van RA-FLS's. Begin met het plaatsen van het synoviale weefsel in een schaal van 100 millimeter en was het weefsel met 5 milliliter PBS aangevuld met antibiotica.

Verwijder het gelige vetweefsel en botresten. Breng vervolgens het bijgesneden weefsel over naar één put van een zesputsplaat met 5 milliliter DMEM aangevuld met FBS en gebruik schaar om het weefsel fijn te snijden tot de stukken klein genoeg zijn om een wegwerppipetpunt te doorboren. Breng het medium over naar een conische buis van 50 milliliter en voeg vervolgens 5 milliliter vers DMEM plus FBS toe aan de put om eventuele resterende weefsels te verzamelen en breng de inhoud van de hele put over naar de buis.

Voeg vervolgens ijs-ontdooid collagenase toe tot een eindconcentratie van 0,01% aan de buis en sluit de buis af met parafilm voor incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius met schudden. Na vier uur vult u de buis met vers DMEM plus FBS tot een eindvolume van 50 milliliter en verzamelt u de weefselfragmenten door centrifugatie. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en suspendeer vervolgens de cellen in 40 milliliter vers medium voor een tweede centrifugatie.

Suspendeer de tweede pellet in 25 milliliter vers DMEM plus FBS en laat de grote weefselklontjes bezinken. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe schaal van 100 millimeter en incubeer de synoviocyten gedurende 14 dagen bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Om de synoviocytencultuur uit te breiden, gooit u het gebruikte medium weg en wast u de cellen in 5 milliliter PBS.

Verwijder het PBS en dissocieer de cellen met 1 milliliter EDTA in de cellenkweekincubator gedurende 2 minuten. Aan het einde van de incubatie tikt u zachtjes op de schaal om eventuele resterende adherante cellen los te maken en brengt u de resulterende celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie. Suspendeer de pellet in 30 milliliter DMEM en FBS en verdeel de cellen in 3 nieuwe schalen van 100 millimeter.

Geef de synoviocyten om de 3 dagen vers medium en verdeel de cellen in 3 nieuwe culturen bij 80%confluency zoals net gedemonstreerd. Op dag nul van de transductie, zie 3 x 10 tot de 4e FLS's per put op een zesputsplaat in vers groeimedium voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius in 5%CO2. De volgende dag ontdooit u 1 flacon Lenti-virus met 4 Yamanaka-factoren bij 4 graden Celsius en vervangt u het FLS-kweekmedium met FLS-groeimedium aangevuld met hexadimethrinebromide en ascorbinezuur.

Wanneer de inhoud van de flacon is ontdooid, voegt u 30 microliter lentivi-virus toe aan de cellen en mengt u voorzichtig om het virus homogeen te verdelen. Om de infectie te verbeteren, centrifugeert u de plaat en brengt u de cellen terug naar de incubatiekast en vervangt u het medium elke dag door vers FLS-groeimedium met natriumbutyraat en ascorbinezuur gedurende 3 dagen. Op de 4e dag vervangt u het medium door een mengsel van FLS-groei en iPSC-medium met natriumbutyraat en ascorbinezuur.

Op dag 5 voegt u 60 microliter vitronectin toe aan 6 milliliter PBS zonder calcium en magnesium en coat u 3 putten van een zesputsplaat met 2 milliliter van de oplossing per stuk gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur. Terwijl de vitronectin aan het uitharden is, wast u de getransduceerde cellen met PBS en los ze met EDTA zoals gedemonstreerd. Na het verzamelen van de gedissocieerde cellen door centrifugatie, suspendeer de pellet in 900 microliter vers medium.

Verwijder het overtollige vitronectin uit de putten en voeg 300, 150 en 100 microliter cellen toe aan individuele putten. Breng vervolgens de cellen terug naar de incubatiekast en vervang het medium dagelijks door vers iPSC-medium totdat de kolonies verschijnen. Om de kolonies te verzamelen, voegt u eerst 500 microliter iPCS-medium, aangevuld met ROCK-remmer, toe aan elke put van een vitronectin-gecoate 48-putsplaat.

Plaats vervolgens de FLS-culturen onder een dissectiemicroscoop op een schone werkbank en gebruik een pipetpunt van 10 microliter om rond een kolonie van belang te snijden. Gebruik een pipetpunt van 200 microliter om de geplukte kolonie over te brengen naar 1 put van de 48-putsplaat. Wanneer alle kolonies zijn verzameld, plaatst u de plaat in de cellenkweekincubator totdat de kolonies groot genoeg zijn voor overdracht.

Verdeel de cellen wanneer de kolonies uit het zichtbare veld van de microscoop zijn, zoals gezien bij 100x vergroting. In deze afbeelding kan de morfologie van de geïsoleerde FLS na een initiële kweek van 14 dagen worden waargenomen. De cellen vertonen de kenmerken van fibroblasten in het algemeen met een vergelijkbare expressie van de fibrotische markers vimentin en fibronectin en een lage expressie van de macrofaag-achtige synoviocytenmarker CD-68. 8 tot 11 dagen na de Yamanaka-factor lentivirale transductie beginnen kleine kolonies te verschijnen die kunnen worden verzameld en geamplificeerd voor 5 tot 10 passages.

Deze reumatoïde artritis iPSC's vertonen alkalische fosfatase-expressie, wat aangeeft dat ze ongedifferentieerd blijven. De cellen vertonen ook pluripotente markers zoals bevestigd door RT-PCR en immunofluorescentieanalyse. Reumatoïde artritis iPCS's vertonen een normaal chromosoompatroon van 44+XY zoals bepaald door karyotypering.

Verder, 12 we