Name: Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een kwantitatieve tube-vormingsassay voor angiogenese-onderzoek met HUVEC-cellen op verschillende extracellulaire matrices. Deze methode meet CXCR2-remmer effecten op endotheelcelnetwerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gefinancierd door het Fonds voor Medisch Onderzoek en Onderwijs, Wayne State University, Detroit, MI.

1. Cultuur van de Cel <ol><li> Zaad 3x10 5 HUVEC cellen in 10 ml compleet kweekmedium 10 in een 75 cm kolf. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 tot 70-80% confluentie. </li></ol> 2. buisje Formation Assay <ol><li> Ontdooi ofwel de groeifactor verminderde (GFR) extracellulaire matrix of normale extracellulaire matrix overnacht op ijs bij 4 ° C. Opmerking: Voor kortheidshalve &quot;extracellulaire matrix zullen voortaan worden gebruikt om zowel GFR en normale extracellulaire matrix referentie. De werkwijze te bereiden identiek. </li><li> Houd 96 putjes op ijs en voeg 50 ul gekoelde extracellulaire matrix per putje gebruikt voorgekoelde tips. Bereid drievoud van 5 putjes die alleen de normale extracellulaire matrix. Een volgende drievoud van 5 putjes die alleen GFR extracellulaire matrix. </li><li> Incubeer de 96-well plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Was de HUVECseenmaal met fosfaat gebufferde oplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 1-5 minuten, het controleren van de cellen elke minuut totdat de meeste cellen ronden. Verjagen de cellen door de kolf een keer te tikken. <ol><li> Voeg 5 ml basaal medium (dwz endotheliale celgroei medium zonder iets (bijvoorbeeld toevoegingen) toegevoegd) met 1% foetaal runderserum (FBS). Verzamel de cellen in de kolf door pipetteren en overbrengen naar een 15 ml buis. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer met 2 ml basismedium tellen van de cellen met een hemocytometer en pas de celconcentratie 2-3 x 10 5 cellen / ml. </li></ol></li><li> Bereid 100 ul van 10x de volgende concentraties van remmer CXCR2 SB225002 in basismedium: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM en 0 uM (controle). </li><li> Pipet 300 ul van de HUVEC suspensie in elk 5 MICRocentrifuge buizen. Voeg 33 ul van de remmer concentraties (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM en 0 uM) in een buisje elk de HUVECs en vortex. </li><li> Pipetteer 50 ul van elk van de celsuspensies (1-1,5 x 10 4 cellen) naar afzonderlijke putjes van extracellulaire matrix. Op ieder suspensie in drievoud en incubeer gedurende 4-16 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Na 4-16 uur, neem 4 foto&#39;s van de gevormde per putje met behulp van een omgekeerde microscoop camera 11 (oorspronkelijke vergroting x 100) buizen. </li></ol> 3. buisje Disruption Assay <ol><li> Bereid de extracellulaire matrix en platen volgens dezelfde specificaties als de Tube Formation Assay (stappen 2,1-2,3). </li><li> Bereid HUVEC suspensie zoals beschreven in de stappen 2.4- 2.4.2 van de Formatie Assay buis en monster in een 96-well plaat met de extracellulaire matrix bij 50 pl per putje. Opmerking: Plate genoeg putten so dat er 3 putten per behandeling met geneesmiddelen. </li><li> Kweek cellen op extracellulaire matrix gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Neem foto&#39;s voordat de start van de behandeling met geneesmiddelen. </li><li> Bereid 2x concentratie van de remmer CXCR2 SB225002 zoals beschreven in stap 2.5 de buisvorming assay en voeg 50 pl van elke concentratie per putje van de plaat met 96 putjes bevattende de HUVEC. Plate elke concentratie in drievoud. </li><li> Incubeer de plaat nog eens 2-12 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Neem 4 beelden van de gevormd in elk putje met behulp van een omgekeerde microscoop camera (oorspronkelijke vergroting x 100) 11 tubes. </li></ol> 4. kwantificeren Gegevens <ol><li> Evalueer buisvorming meegenomen in de afbeeldingen door meting van de totale buislengte van buizen vier willekeurige microscopische velden met de microscoop camera software. </li><li> Open de afbeelding in de microscoop camera software, en klik op &#39;Annotations en Metingen9 ;. Onder de rubriek &#39;lengte&#39;, selecteert u het gereedschap &#39;eenvoudige lijn&#39;. Klik op de afbeelding, dan trek een lijn langs de lengte van de buis, klik dan rechts op. Opmerking: de software automatisch de lengte van de lijn in pixels berekenen en zet de gegevens in een bestand. </li><li> Herhaal de procedure voor alle metrolijnen in het beeld door het selecteren van de functie &#39;eenvoudige lijn&#39;. Klik op de afbeelding, dan trek een lijn langs de lengte van de buis, klik dan rechts op. Opmerking: De software zal de lengte van elke lijn registreren en de gegevens op het scherm. </li><li> Na het meten van elke buis in de afbeelding, klikt u op &#39;Export&#39;, dan koos &#39;Lengte aan spreadsheet&#39;. Opmerking: De lengte gegevens worden geëxporteerd naar een spreadsheet. </li><li> Voeg alle van de buis lengtes van de spreadsheet om de totale lengte van de buis te krijgen. Bereken de gemiddelde lengte van de buizen op te nemen. Opmerking: vier replicaten aanbevolen met gemiddelde en de standaardafwijking bepaald. </li></ol> 5. Herstellen Cellen van de extracellulaire matrix Cultuur <ol><li> Cultuur en het uitvoeren van een buis formatie assay (zie punt 2) op een grotere schaal als een plaat met 96 putjes zal niet toegeven voldoende celgetal. Voor 12 putjes Gebruik 500 pi extracellulaire matrix en 500 ul van de celsuspensie HUVEC (1.5x10 5 cellen). </li><li> Incubeer de cellen gedurende 4-16 uur om buizen te vormen. Vervolgens zuig het celkweekmedium. Spoel de cellen met 1 ml koude 1x PBS zonder calcium en magnesium. </li><li> Voeg 1 ml ijskoude PBS-2,5 mM EDTA buffer op de cultuur en houden op ijs gedurende 10 min. </li><li> Los van de cellen en extracellulaire matrix mengsel uit de schotel met behulp van een 1000 ui pipet tip met tip afgesneden, en vervolgens over te dragen aan een koude 15 ml tube, was het goed met 4 ml ijskoude PBS-2,5 mM EDTA en in de buis gebracht . </li><li> Zet de buizen op ijs gedurende 1-4 uur en keer de buis een paar keer totdat alle extracellulairematrix is ​​opgelost. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 1620 xg bij 0 ° C </li><li> Resuspendeer de cel pellets met 1 ml koud PBS tot een 1.ml buis op ijs. </li><li> Centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 3000 xg bij 0 ° C en afvoeren van het supernatant. </li><li> Bewaar de cellen bij -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CXCR2+enhances+chemotherapeutic+response%2C+inhibits+mammary+tumor+growth%2C+angiogenesis%2C+and+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis.</a> Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+pericytes+participate+in+normal+and+tumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).</li>
<li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li>
<li>Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor-1+as+a+novel+target+for+the+antiangiogenic+treatment+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer.</a> PLoS One. 9 (3), 88830(2014).</li>
<li>Gu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Apurinic%2FApyrimidinic+Endonuclease+siRNA+Inhibits+the+Angiogenesis+Induced+by+X-Ray+Irradiation+in+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).</li>
<li>Manjunathan, R., Ragunathan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+chorioallantoic+membrane+as+a+reliable+model+to+evaluate+osteosarcoma-an+experimental+approach+using+SaOS2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line.</a> Biol Proced Online. 17, 10(2015).</li>
<li>Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+inhibitor%2C+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor%2C+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR%2Fsrc%2FVEGF+pathway+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett.+Aug%22%5BJournal%5D)">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li>
<li>Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+offer+new+insights+into+the+relationship+between+lipid+metabolism+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis.</a> Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).</li>
<li>Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf</a> (2015).</li>
<li>The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf">http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf</a> (2008).</li>
<li>de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR+for+retrovirus-like+particle+quantification+in+CHO+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.</a> Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).</li>
<li>50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/">http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/</a> (2015).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Bij het uitvoeren van deze test, is het essentieel om de extracellulaire matrix op ijs of bij 4 ° C te allen tijde, tenzij anders vermeld. Als de extracellulaire matrix opwarmen boven 4 ° C, zal polymeriseren, en de test wordt geruïneerd. Het is ook belangrijk dat alles wat in contact komt waarborgen (bijvoorbeeld pipetpunten, de plaat) met de extracellulaire matrix voorgekoeld voor bovengenoemde reden. Het aantal cellen geënt in elk putje slecht is, wordt te weinig cellen niet de verwachte web die in het controlemonster, te veel cellen grote celclusters of een monolaag vormen en de test niet geldig. Een andere belangrijke factor in het succes van deze test is de cel passage nummer van de HUVEC. De passage nummer moet altijd lager zijn dan tien, anders robuuste buis formatie mag niet optreden. Bovendien moet men ervoor zorgen dat het celkweekmedium gebruikt niet is verstreken of de cellen niet levensvatbaar zijn. Alternattend, kan men het medium en zijn onderdelen aliquot en bewaar ze bij -20 ° C te bewaren gedurende een periode na de vervaldatum. Natuurlijk is het nog steeds de voorkeur om het medium vóór gebruik de vervaldatum Zoals alle procedures, zijn er een aantal nadelen aan het uitvoeren van de endotheelcel vaatvorming assay. Een groot probleem is dat, omdat er verschillende soorten van endotheelcellen en dragermatrices, de resultaten van de test kan sterk variëren afhankelijk van het soort cel en matrix wordt gebruikt. De endotheelcellen gebruikt (HUVECs, HAECs of HMVECs) zijn primaire cellen, ze zijn duur om variabiliteit en hebben in vergelijking met onsterfelijk gemaakte cellen. De primaire cellen beperkt doorgangen voor gebruik, en zijn daarom niet geschikt voor langdurige angiogenese experimenten 14. Voor betrouwbare gegevensopslag moet men altijd dezelfde types voor de test. Net als bij andere in vitro assays, moeten de resultaten van een assay vaatvorming conbevestigd in vivo, omdat de resultaten van gecontroleerde en kunstmatige omstandigheden tweedimensionale weefselcultuur niet altijd worden weerspiegeld in het complex biosysteem van een levend organisme. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat dit type assay kan alleen worden gebruikt om endotheelcellen buisvorming tonen, en mag niet worden gebruikt om andere niet-endotheliale testen buis vormende cellen. Deze test is een vrij eenvoudige en snelle methode om angiogene potentieel van een verbinding te kwantificeren. Het vormt ook een platform voor verdere experimenten, zoals alleen, is het geen gegevens over de specifieke mechanisme waarmee de verbinding daadwerkelijk het vaartuig vormingsproces beïnvloedt verkregen. Echter, het gebruik van verschillende extracellulaire matrix is ​​een voorbeeld van hoe je een kader voor onderzoek vragen die niet vaak wordt gebruikt verder te creëren. Er zal gaan specifieke biochemische mechanismen van de compound die specifieke remmers die onderdelen van doelgerichte studiede angiogenese route. Een andere benadering kan zijn om RNA te extraheren uit de endotheelcellen en gebruik RT-PCR (Real Time PCR) 12 tot veranderingen in de genexpressie die de groei gedrag waargenomen in de assay kan veroorzaken analyseren. Toekomstige toepassingen van deze methode zijn getransfecteerde HUVEC knock-down assays voor specifieke stappen van de angiogenese route te creëren. Er zijn mogelijkheden om deze benadering van de lymfevatontwikkeling route bestuderen van toepassing. Door het veranderen van extracellulaire matrixcomponenten, kan de interactie tussen matrix en celprocessen ondersteunen angiogenese bij kanker nader worden toegelicht. De extractie van RNA en eiwitten door endotheelcellen onder deze specifieke omstandigheden aanvullende kwantificeerbare corresponderend met dataverwerking.

Om de voedingsstoffen die nodig zijn om te overleven verkrijgen maligne tumoren is toegang tot de bloedstroom van de patiënt. Die toegang krijgen tumorcellen vrijkomen chemische signalen die de groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren om de tumor, waardoor kaping het normale fysiologische proces dat angiogenese 2. Het is ook via de bloedvaten aangemaakt via angiogenese dat metastase (dat wil zeggen de verspreiding van kanker naar andere organen) optreden. Omdat het proces van angiogenese is zo belangrijk om de progressie van een dergelijke grote verscheidenheid aan kankers, is een aantrekkelijk doel in antikanker therapie onderzoek 3. Eén methode gebruikt om angiogenese te kwantificeren het vermogen van de endotheliale progenitor cel buizen vormen meten wanneer geplaatst op een extracellulaire matrix. Vanwege de vorming van deze buizen is een belangrijke eerste stap in angiogenese, testing omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld aan- of afwezigheid van een bepaald compound), die kunnen stimuleren of remmen de vorming van de buis geeft inzicht in de specifieke stappen die kunnen worden gericht op angiogenese te remmen. De endotheelcel buisvorming assay is een van de meest gebruikte 4 in vitro werkwijzen die de cellen in staat buizen te vormen meet. Het is een eenvoudige test, die weinig componenten en een korte kweekperiode 5. Misschien nog belangrijker is echter dat de opgedane dergelijke analysegegevens meetbaar. Een voorbeeld van het gebruik van de vaatvorming bepaling omvat het vergelijken van de ontwikkeling van buizen uit vasculaire endotheelcellen gekweekt op extracellulaire matrix vs. groeifactor verlaagd (GFR) extracellulaire matrix. De extracellulaire matrix is ​​een basale membraan-materiaal geïsoleerd uit cellen en sarcoom belangrijkste componenten laminine, type IV collageen, groeifactoren en proteoglycanen. Enkele verbindingen hebben verschillende effecten op het vermogen van de cel om buizen te vormen wanneer ineen door verlaging groeifactoren en verminderde heparansulfaatproteoglycanen (HSPG). HSPGs zijn een component van de extracellulaire matrix die aanzienlijk GFR extracellulaire matrix wordt verminderd. Als voorbeeld, indien de hypothese dat angiogenese remmers, zoals SB225002, welke blokken het CXCR2 receptor aanzienlijk zwakker vermogen vaatvorming als HSPGs overvloedig onderbreken, dan een vergelijking tussen buisvorming activiteit in de extracellulaire matrix en GFR extracellulaire matrix belang in het verkennen van de mogelijkheid van angiogenese remming via de controle van HSPGs. Andere tests die vaak worden gebruikt om de effecten van verbindingen op angiogenese te bepalen in vivo. Bekende voorbeelden hiervan zijn de chick chorion-membraan (CAM) assay 6 met behulp van kippeneieren, en de in vivo Matrigel plug angiogenese assay 7 met behulp van muizen. Terwijl in vivo methoden meten angiogenese in tRIE afmetingen en zijn representatief voor het menselijk lichaam vergeleken met de in vitro assay buisvorming ondervinden zij tekortkoming dat er beduidend meer tijd en aanzienlijk moeilijker uit te voeren. Zowel de CAM-bepaling en de extracellulaire plug assay Neem minstens een week 8 te doen, terwijl in vergelijking, de vaatvorming assay worden uitgevoerd in een enkele dag en het vereist niet het gebruik van dieren. Het is belangrijk op te merken dat de endotheelcellen die in dit rapport zijn humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Deze cellen spelen een belangrijke rol in vasculaire ontkiemen en groei van bloedvaten en voldoende analoog aan endotheelcellen in kankers worden gebruikt voor anti-angiogenese activiteit evalueren zowel in vitro als in vivo experimenten 9. Andere cellen zoals primaire microvasculaire endotheliale cellen kan ook worden gebruikt. Het is ook belangrijk op te merken dat naast het hebben lagereHSPGs niveaus van de GFR extracellulaire matrix heeft ook de niveaus van veel componenten in vergelijking met normale extracellulaire matrix. Dit omvat, maar is niet beperkt tot: EGF, IGF-1, PDGF en TGF-beta. Die het uitvoeren van experimenten bestuderen de betekenis van deze verbindingen ten opzichte van angiogenese interessant kunnen gebruik GFR extracellulaire matrix.

<table><tbody><tr><td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td><td>Fisher</td><td>NC9525043</td><td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 basismedium gemengd met BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortison, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&beta; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbinezuur en Heparine. Deel het medium en zijn componenten in porties in en bewaar ze bij -20&nbsp;&deg;C, verwarm in 37&nbsp;&deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10&nbsp;ml; LDEV-Free</td><td>Fisher</td><td>CB-40230</td><td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellulaire matrix, bewaar in -20&nbsp;&deg;C, verwarm in 4&nbsp;&deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML; 10&nbsp;ml; LDEV-Free</td><td>Fisher</td><td>CB-40234</td><td>extracellulaire matrix, bewaar in -20&nbsp;&deg;C, verwarm in 4&nbsp;&deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>Fisher</td><td>559405</td><td>CXCR2-remmer, bewaar in -20&nbsp;&deg;C, verwarm op kamertemperatuur voor gebruik.</td></tr><tr><td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&nbsp;</td><td>ScienCell Research Laboratories&nbsp;</td><td>8000</td><td>kweek het volgens referentie&nbsp; 10.</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>bewaar in 4&nbsp;&deg;C, verwarm in 37&nbsp;&deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Omgekeerd onderzoeksmicroscoop.&nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td><td>Nikon</td><td></td><td>Omgekeerd onderzoeksmicroscoop software</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>wetenschappelijke 2D-grafiek- en statistieksoftware, om IC50 te berekenen.</td></tr></tbody></table>

strategische endotheelcellen tube formation assay: het vergelijken van extracellulaire matrix en growth factor verlaagde extracellulaire matrix

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Maligne tumoren hebben een bloedvoorziening nodig om te overleven en zich te verspreiden. Deze tumoren halen het benodigde bloed uit de bloedbaan van de patiënt door het proces van angiogenesis te kapen, waarbij nieuwe bloedvaten worden gevormd uit bestaande bloedvaten. De CXCR2 (chemokine (C-X-C motief) receptor 2) receptor is een transmembraan G-eiwit-gekoppeld molecuul dat in veel cellen wordt aangetroffen en nauw verbonden is met angiogenesis1. Specifieke blokkering van de CXCR2 receptor remt angiogenesis, zoals gemeten door verschillende tests zoals de endotheliale buisvormingstest. De buisvormingstest is nuttig voor het bestuderen van angiogenesis omdat het een uitstekende methode is om de effecten die een bepaalde verbinding of omgevingsomstandigheid kunnen hebben op angiogenesis te bestuderen. Het is een eenvoudige en snelle in vitro test die kwantificeerbare gegevens genereert en relatief weinig componenten vereist. In tegenstelling tot in vivo tests, vereist het geen dieren en kan het in minder dan twee dagen worden uitgevoerd. Dit protocol beschrijft een variatie van de extracellulaire matrix die de endotheliale buisvormingstest ondersteunt, die de CXCR2 receptor test.

Aanzienlijke, gezond endotheel vaatvorming kan eenvoudig worden afgezet geremde buisvorming in het microscopiebeelden. Gezonde vorming buis verschijnt als een georganiseerd netwerk van de capillair-achtige structuren (Figuur 1). Ter vergelijking remde vaatvorming manifesteert zich als verspreide cellen (figuur 2). Vaatvorming analysegegevens wordt gekwantificeerd door meting van de totale buislengte van capillaire buisjes (tabel 1). Naast de totale lengte van de buis, kan de gemiddelde lengte van de buis, het totale aantal buisjes, of het totale aantal tak punten worden gemeten. Gestructureerde buis formatie levert een grotere netto lengte van de buis dan verspreid geremd buis groei. In figuur 3, een dosisresponscurve maakt berekening van IC 50 onder dezelfde omstandigheden op HUVECs GFR extracellulaire matrix en CXCR2 inhibitor SB225002. Figuur 1. Endotheliale t Ube formatie op extracellulaire matrix en groeifactor verminderde (GFR) extracellulaire matrix. Twee beelden tonen succesvol buisvorming op extracellulaire matrix (A) en GFR extracellulaire matrix (B). Het netwerk van onderling verbonden buizen toont duidelijk aan dat de groei van buizen gezond deze HUVEC. Schaal bar = 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Figuur 2. Remming van de buis formatie op extracellulaire en de groei-factor verminderd (GFR) extracellulaire matrix door een CXCR2 remmer SB225002 (5,6 pm). Twee beelden tonen buisformatie die wordt geremd door een inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 uM) met extracellulaire matrix (A) en GFR extracellulaire matrix (B). De geïsoleerde klompjes HUVEC cellen gezien in dit beeld toont dat de cellen waren niet in staat de noodzakelijke verbinding met elkaar vormen van een koker. Schaal bar = 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Figuur 3. dosis responscurve groei-factor gereduceerd (GFR) extracellulaire matrix. De x-as geeft buislengte en de Y-as de concentratie van een inhibitor CXCR2. De dosis respons curve blijkt dat de HUVEC reactie op de remmer CXCR2 op GFR extracellulaire matrix is ​​dosisafhankelijk. De IC 50 (helft van de maximale remmery concentratie) werd berekend door software 13 en kan worden vergeleken met een dosis respons curve voor extracellulaire matrix, bijvoorbeeld. IC50 is de concentratie van de remmer die de respons tot 50% afneemt. Fout balken geven standaarddeviatie. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Growth Factor Reduced (GFR) extracellulaire matrix en remmer (4 replica elk) </td><td> Totale Tube lengte Average (pixels) (1 pixel = 0,34 pm) </td><td> Standaardafwijking </td><td> P Waarde </td></tr><tr><td> GFR extracellulaire matrix controle </td><td> 2447 </td><td> 168,174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR extracellulaire matrix + 0,56 uM SB225002 </td><td> 1422,5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR extracellulaire matrix + 1,1 uM SB225002 </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR extracellulaire matrix + 5,6 uM SB225002 </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR extracellulaire matrix + 11 uM SB225002 </td><td> 393,75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Kwantificeren totale buislengtes Groei-factor gereduceerd (GFR) extracellulaire matrix onder verschillende omstandigheden. Een gedeelte van een tafel met behulp totale buislengten opgenomen in monsters gekweekt op GFR extracellulaire matrix met variërende concentraties remmer CXCR2. De gegevens geven aan dat de CXCR2 remmer remt vaatvorming. Inbegrepen zijn bijbehorende waarden zoals gemiddelde van vier herhalingen, standaarddeviatie en P-waarde. Gemeten in pixels tonende gegevens die worden geëxporteerd. IC 50 kan worden berekend met behulp van statistische software 13. (1 pixel = 0,34 pm)

Dit manuscript beschrijft een buisvormingstest om de effecten van een bepaalde verbinding of omstandigheid op angiogenesis te kwantificeren door gebruik te maken van de vorming van endotheelcellen in een gecontroleerde omgeving.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Het algemene doel van dit experiment is om de afhankelijkheid van buikvorming door endotheelcellen van angiogene chemokines te kwantificeren, gebruikmakend van twee verschillende extracellulaire matrices die componenten bevatten die binden aan diverse angiogene moleculen. Deze methode kan sleutelvragen binnen het vakgebied van kankerangiogenese beantwoorden, zoals waarom angiogenese wordt ondersteund door alternatieve routes via veranderingen in de extracellulaire matrix. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze kwantificeerbaar is en minder variabelen gebruikt.De procedure wordt gedemonstreerd door mevrouw Donghong Ju, een onderzoeksmedewerker in het laboratorium. Om met deze procedure te beginnen, wordt ofwel GFR extracellulaire matrix, ofwel normale extracellulaire matrix, gedurende de nacht ontdooid bij 4 °C. Houd de 96-well cultuurplaat op ijs en voeg met vooraf gekoelde pipetpunten 50 µL gekoelde extracellulaire matrix per well toe.Bereid triplicaten van vijf wells voor die alleen de normale extracellulaire matrix bevatten, gevolgd door triplicaten van vijf wells die alleen GFR extracellulaire matrix bevatten. Incubeer de plaat vervolgens 30 minuten bij 37 °C. Was na 30 minuten de HUVEC één keer met PBS, zonder calcium en magnesium, en voeg één milliliter 0,5% Trypsin EDTA toe.Incubeer de cellen vervolgens gedurende één tot vijf minuten bij 37 graden Celsius en controleer ze elke minuut totdat de meeste cellen zijn afgerond. Los de cellen vervolgens los door tegen de fles te tikken. Voeg daarna vijf milliliters Basaal medium met één procent FBS toe aan de fles.Overbreng de cellen naar een buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder na vijf minuten het supernatant en resuspendeer de cellen in twee ml Basaal medium.Tel de cellen met een hemocytometer en stel de celconcentratie in op twee tot drie maal 10⁵ cellen per milliliter. Bereid vervolgens 100 µL van vijf verschillende 10X concentraties CXCR2-remmer in basaal medium voor. Pipetteer 300 µL van de HUVEC-suspensie in elk van de vijf afzonderlijke microcentrifugebuisjes.Voeg vervolgens 33 µL van de 10X-remmer van elke concentratie toe aan de buisjes met HUVEC en vortex deze. Pipetteer daarna 50 µL van elke cel-suspensie in afzonderlijke wells van de extracellulaire matrix. Zaai elke suspensie in triplikaat en incubeer gedurende vier tot 16 uur bij 37 °C.Maak vervolgens vier foto's per put met een camera van een omgekeerde microscoop. Bereid bij deze procedure de extracellulaire matrix en de platen voor volgens dezelfde specificaties als bij de tube-formatie-assay. Bereid daarna de HUVEC-suspensie en verdeel deze over een 96-wellplaat met de extracellulaire matrix in aliquoten van 50 microliters per put.Kweek vervolgens de cellen gedurende vier uur op de extracellulaire matrix bij 37 °C. Neem daarna afbeeldingen op voordat de behandeling met het geneesmiddel wordt gestart. Bereid vervolgens vijf verschillende 2X-concentraties van de CXCR2-remmer in basaal medium.Voeg 50 µL CXCR2-remmer van elke concentratie toe aan elk van de 96 wells met HUVEC. Incubeer de plaat vervolgens nog twee tot 12 uur bij 37 °C. Maak daarna met een camera op een omgekeerde microscoop vier afbeeldingen van elke well.Om de buisvorming vastgelegd in de afbeeldingen te evalueren, meet u de totale buislengte in vier willekeurige microscopische velden met de software van de microscoopcamera. Doe dit door de afbeelding in de software van de microscoopcamera te openen en op Annotaties en Metingen te klikken. Selecteer onder het gedeelte Lengte de eenvoudige lijntool.Klik op de afbeelding, trek vervolgens een lijn langs de lengte van de buis en klik met de rechtermuisknop om de berekening uit te voeren. Herhaal daarna deze procedure voor alle buislijnen in de afbeelding door de tool voor eenvoudige lijnen te selecteren. Klik op de afbeelding, trek een lijn langs de lengte van de buis en klik vervolgens met de rechtermuisknop.De software registreert de lengte van elke lijn en geeft de gegevens op het scherm weer. Nadat elke buis in de afbeelding is gemeten, klikt u op Export en kiest u vervolgens Length to Spreadsheet om de lengtegegevens naar een spreadsheet te exporteren. Tel alle buislengtes uit de spreadsheet bij elkaar om de totale buislengte te verkrijgen.Bereken en noteer vervolgens de gemiddelde lengte van de buisjes. Kweek de cellen in deze procedure en voer een tube formation assay uit in de 12-wellplaat. Incubeer de cellen gedurende vier tot 16 uur om de buisjes te laten vormen.Aspireer daarna het celkweekmedium en spoel de cellen af met één milliliter koude 1XPBS zonder calcium en magnesium. Voeg vervolgens één milliliter ijskoude PBS-buffer met 2,5 millimol EDTA toe aan de kweek en bewaar deze gedurende 10 minuten op ijs. Los na 10 minuten het mengsel van cellen en extracellulaire matrix los van de schaal met behulp van een 1.000-microliterpipetpunt waarvan de punt is afgeknipt.Breng de cellen vervolgens over naar een koude buis van 15 milliliter. Was het putje met vier milliliter ijskoud PBS en voeg dit toe aan dezelfde buis. Plaats de buis vervolgens gedurende één tot vier uur op ijs en keer de buis een aantal keer om totdat de extracellulaire matrix is opgelost.Centrifugeer het daarna 10 minuten bij nul graden Celsius. Resuspendeer vervolgens de celpellet met één milliliter koud PBS in een 1,5 milliliter buis op ijs. Centrifugeer het opnieuw vijf minuten bij nul graden Celsius.Verwijder vervolgens het supernatant en bewaar de cellen bij 80 graden Celsius. Deze twee afbeeldingen tonen een succesvolle endotheliale buisvorming op de normale extracellulaire matrix en de GFR extracellulaire matrix. Het onderling verbonden netwerk van buisjes laat duidelijk zien dat de groei van de buisjes in deze HUVEC gezond is.Deze twee afbeeldingen tonen de remming van buikvorming door een CXCR2-remmer, SB225002, bij 5,6 micromolair op de normale extracellulaire matrix en de GFR-extracellulaire matrix. De geïsoleerde clusters HUVEC die in deze afbeelding te zien zijn, tonen aan dat de cellen niet in staat waren om de noodzakelijke buisjes te vormen om met elkaar verbinding te maken. Deze grafiek laat zien dat de HUVEC-respons op de CXCR2-remmer op GFR-extracellulaire matrix dosisafhankelijk is.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals QRTPCR of RNA-sequencing, worden uitgevoerd met gebruik van de geprepareerde cellen. Gegevens zoals de gemiddelde buislengte, het totale aantal buizen of het totale aantal vertakkingspunten kunnen uit de beelden worden verkregen om het angiogenese-proces onder experimentele condities te karakteriseren.

strategic-endothelial-cell-tube-formation-assay-comparing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een buis formatie test wordt gebruikt om de vasculaire activiteit van tumorcellen te evalueren.

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.

Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie Angiogenese

We beschrijven een eenvoudige celgebaseerde bioassay voor het detecteren, kwantificeren en volgen van de activiteit van leden van de vasculaire endotheliale groeifactor familie van liganden. De test maakt gebruik van chimère receptoren tot expressie gebracht in een factor-afhankelijke cellijn die een semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van receptorbinding en verknoping verschaffen door het ligand.

Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Hier evalueren we de effecten van het water extract van Ruta graveolens op de vorming van een vat netwerk door gebruik te maken van een buis vormings test op een opgestijfde kelder matrix.

HUVEC-buis-formatie test om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).

Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay

Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer een kwantitatieve tube-vormingsassay voor angiogenese-onderzoek met HUVEC-cellen op verschillende extracellulaire matrices. Deze methode meet CXCR2-remmer effecten op endotheelcelnetwerken.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix (Video) | JoVE Journal

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Meer video's verkennen