Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Het algemene doel van deze procedure is de niet-invasieve afname van synoviaal vocht en beenmerg bij minivarkens om mesenchymale stamcellen te verzamelen voor gebruik in regeneratie- en immunomodulatiestudies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van MSC-therapie in de otologie, zoals het vaststellen van de aanwezigheid van MSC's in synoviaal vocht en hoe deze te karakteriseren in vergelijking met MSC's uit beenmerg. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de sleuteleigenschappen van MSC's afgeleid van synoviaal vocht en beenmerg bij minivarkens effectief kunnen worden vastgesteld, wat nuttig zal zijn voor toepassingen bij patiënten.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van diverse gewrichtsaandoeningen, aangezien de populatie van uit synoviaal vocht afgeleide MSC's in de gewrichtsholte bij atletische patiënten significant is toegenomen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de regeneratieve geneeskunde, kan deze ook worden toegepast op andere studies, zoals onderzoek naar auto-immuunziekten. Omdat MSC's van minivarkens autoloog zijn, zou immunosuppressie van belang kunnen zijn voor mensen.

Naast de andere wetenschappers zullen Hyeon-Jeong Lee en Won-Jae Lee uit mijn derde jaar de procedure demonstreren. Begin met het positioneren van een geanestheseerd minivarken om toegang te krijgen tot de crista iliaca. Onthaar vervolgens een gebied van 15 vierkante centimeter op de crista iliaca met een scheermes of trimmer.

Schrob vervolgens de blootgestelde huid afwisselend drie keer met povidonjodium en 70% ethanol. Wanneer de huid volledig is opgedroogd, worden steriele doeken aangebracht. Voorbehandel nu een spuit van 10 mL met heparine, gebruikmakend van een spoeling van 3 tot 4 mL.

Dit voorkomt dat het beenmerg stolt tijdens de extractie. Bevestig vervolgens, precies op de crista iliaca, een beenmergextractor stevig aan de met heparine gecoate spuit en extraheer ten minste 5 mL beenmerg. Om de cellen uit het geëxtraheerde beenmerg te isoleren, wordt dit eerst verdund met een gelijk volume DPBS in een conische buis van 15 mL bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens drie milliliter dichtheidscentrifugatiemedium over in een tweede conische buis van 15 milliliter. Breng daarna voorzichtig vier milliliter van het verdunde beenmerg over op het dichtheidscentrifugatiemedium om twee oplossingslagen te creëren. Centrifugeer de buis nu 40 minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur.

De gewenste MNC's worden verzameld in de centrale witte laag. Aspireer alleen deze laag. Breng de MNC-laag over in een conische buis van 15 milliliter en verdun deze met zeven tot acht milliliter DPBS.

Centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 500 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was de gecentrifugeerde cellen twee keer met 10 mL DPBS, waarbij de vorige centrifugeercyclus wordt herhaald. Na de twee wasbeurten suspenderen we de MNC's in 2 mL ADMEM.

Breng de cellen vervolgens over naar een weefkweekschaaltje van 35 millimeter en incubeer ze bij 38,5 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Aspireer na 48 uur het medium samen met de niet-gehechte MNC's. Voeg vervolgens twee milliliter vers ADMEM toe en zet de incubatie voort, waarbij het medium elke drie dagen wordt ververst.

Wanneer de cellen een confluentie van 70 tot 80% bereiken, wordt de cultuur gewassen met verse DPBS. Dissocieer vervolgens de cellen met één milliliter 0,25% Trypsin-EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C. Verzamel de cellen in tien milliliter ADMEM en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter.

Centrifuge de cellen vervolgens 5 minuten bij 300 Gs bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Suspendeer de geoogste MNC's nu in één milliliter vers ADMEM en meet de dichtheid ervan. Sluit af door tussen de 1/2 en driekwart miljoen cellen uit te platen in T25-flasks met vier milliliter ADMEM.

Incubeer de kolfjes op dezelfde wijze als de platen en ververs het medium elke drie dagen. Bereid een huidsectie van 15x10 centimeter over het femurgewricht voor, zoals is gedaan bij de voorbereiding voor de collectie van beenmerg. Palpeer vervolgens de patella en de tibiacresten onder de huid om het synoviale gewricht te identificeren, en breng een spuit van drie milliliter met een 23-gauge naald precies in het gewricht in.

Onttrek met een zachte zuigkracht tussen 1/2 en één milliliter vloeistof en trek de naald onmiddellijk terug. Als het volume aan synoviaal vocht te klein is, spoel de holte dan met DPBS om synoviaal vocht samen met DPBS te verzamelen. Het te gebruiken volume DPBS varieert afhankelijk van de grootte van de synoviaalholte.

Het optimale volume aan synoviaal vocht is beperkt in een gezond gewricht. Het volume varieert afhankelijk van de grootte en de pathologische toestand van het gewricht. Om de cellen uit het synoviaal vocht te isoleren, wordt het vocht bij kamertemperatuur verdund met een gelijk volume DPBS in een conische buis van 15 milliliter.

Vervolgens verwijderen we het debris door de verdunning te filteren via een nylon cell strainer van 40 micron. Voeg daarna nog tien milliliter DPBS toe en centrifugeer de suspensie 10 minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en was de cellen twee keer met DPBS.

We suspenderen het gewassen celpellet in twee milliliters ADMEM. Vervolgens gaan we over tot het kweken van de cellen zoals gedemonstreerd is met de MSC's. MSC's werden succesvol geïsoleerd uit het beenmerg en de gewrichtssynoviale gewrichten van de minivarkens en in vitro uitgebreid.

De morfologie van MSC's afgeleid van synoviaal vocht is vergelijkbaar met die van MSC's afgeleid van beenmerg: beide hebben een fibroblastische spoelvorm en zijn homogeen adherent. De MSC's vertoonden een positieve expressie bij alkalische-fosfatasekleuring nadat de derde subcultuur was voltooid. Vervolgens werden de oppervlaktemarkers in beide culturen geanalyseerd.

Zoals verwacht vertoonden beide typen MSC's een significante expressie van CD29, CD44 en Vimentine. Daarentegen waren de expressies van CD34 en CD45 negatief en laag. Deze resultaten waren identiek aan die verkregen uit verschillende MSC's, waaronder cellen geïsoleerd uit synoviaal vocht.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u op niet-invasieve wijze synoviaal vocht en beenmerg kunt aspireren om hun MSC's uit minivarkens te isoleren, en hoe u de vergelijking en fenotypering van deze MSC's kunt uitvoeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het doelpunt op de crista iliaca en het synoviale gewricht te lokaliseren door middel van zorgvuldige palpatie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals in modellen voor artrose of reumatoïde artritis, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of niet alleen MSC's uit beenmerg, maar ook MSC's uit synoviaal vocht, een vergelijkbaar vermogen hebben voor kraakbeen- of botinitiatie en immunosuppressie.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de autologe therapie van gewrichtsaandoeningen vooruitgeholpen door bij te dragen aan de karakterisering van MSC's afkomstig uit aangevallen of ontstoken gewrichten bij patiënten met artritis.