Name: Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer myotone dystrofie 1 modelleren in C2C12 myoblastcellen via transfectie en transductie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar spierziekten en ziektepathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Tom Cooper van het Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan van de University of Wisconsin-Madison en Didier Trono van de Universiteit van Genève voor reagentia. Dit werk wordt ondersteund door een startfonds van de Universiteit van Houston (YL), een American Heart Association-subsidie (YL, 11SDG5260033) en de National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12 Cell Culture <ol><li> Onderhouden C2C12 muis myoblasten in 100 mm platen in kweekmedium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM)) aangevuld met 20% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. Sta C2C12 cellen gepasseerd tot ongeveer 50 worden - 60% confluent. </li><li> Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA op de cellen los. Plaats de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min. </li><li> Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groeimedium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Voeg 1 ml gesuspendeerd cel in nieuw 100 mm plaat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 2. C2C12 celtransfectie / transductie en selectie <ol><li> C2C12 plasmide transfectie <ol><li> 24 uur voorafgaand aan transfectie, plate 7,0 x 10 5 C2C12 cellen in één putje van een zes-well plaat voor elke transfectie. Opmerking: Dit leidt tot 50-60% confluentie op het moment van transfectie. </li><li> Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen. </li><li> Voeg 2 ug plasmide DNA (GFP-CUG5 of GFP-CUG200) in 200 ul voorverwarmde serum vrij medium en vortex kort. Voeg 6 ul transfectiereagens aan het medium toe en meng onmiddellijk voor 30 sec met een vortex. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verander het medium van C2C12 cellen aan 2,5 ml serumvrije groeimedia. Voeg het transfectiemengsel aan de cellen na incubatie. Zet de platen een 5% CO2, 37 ° C incubator. </li><li> Houd de cellen in transfectiemengsel / serumvrije groeimedia voor 4 uur of tot overnacht. Verander media terug naar de groei media de volgende dag of wanneer cytotoxiciteit is duidelijk. Opmerking: Cytotoxiciteit wordt beoordeeld door microscopische inspectie van het ceLLS. Let op de veranderingen in de cel morfologie en cel onthechting. Zolang er geen openlijke cytotoxiciteit, overnacht incubatie in serumvrije groeimedia verhoogt transfectie. </li><li> Selecteer de cellen 48 uur na transfectie door toevoeging van 1,2-1,6 mg / ml G418 voor ~ 10 dagen tot de controlecultuur (getransfecteerd zonder de plasmiden) geen levende cellen hebben. Verander het medium elke twee dagen met groeimedium aangevuld met G418. </li><li> Handhaaf de G418 resistente cellen in groeimedium en 5% CO2 bij 37 ° C voor daaropvolgende experimenten. </li></ol></li><li> Retrovirus voorbereiding en C2C12 retrovirale transductie <ol><li> Bereid HEK 293 kweekmedium door toevoeging DMEM hoge glucose met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. <ol><li> Ongeveer 24 uur voorafgaand aan transfectie, plaat 4,0 x 10 6 ecotropische HEK 293-cellen gebaseerde verpakking in een 100 mm plaat (80% confluentie op transfectie) containing celkweekmedium. </li></ol></li><li> Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen. </li><li> Meng 15 ug plasmide DNA (pMSCV-Puro of pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml serumvrij groeimedium. Vortex kort. Voeg 30 ul transfectiereagens uit stap 2.2.2 in het DNA / serumvrije groeimedium buis en meng goed met behulp van vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Voeg transfectiemengsel druppelsgewijs aan het ecotrope HEK 293-cellen gebaseerde verpakking. Zwenk de platen en terug te keren ze terug naar de 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur, veranderen de media om 10 ml voorverwarmde vers groeimedium. </li><li> Oogst de supernatant (bevattende retrovirus) 48 uur na transfectie met een pipet breng de supernatant in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en terug naar de incubator. Houd de supernatant bij 4 ° C. Opmerking: De media wordt voorzichtig toegevoegd aan tHij kant van de put zodat niet de cel monolaag verstoren. </li><li> Oogst de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en het zwembad met de bovenstaande vloeistof uit 2.2.5. Centrifugeer bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min om celafval te verwijderen. </li><li> Breng het supernatant in een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Gebruik retrovirus C2C12 transduceren op dit punt, door een stap 2.2.9 of aliquot en bewaar de bovenstaande vloeistof bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Ontdooi de retrovirus uit 2.2.7 bij kamertemperatuur in een bevroren voorraad hier wordt gebruikt. Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli. </li><li> Plaat C2C12 cellen op dezelfde dag van transductie streven naar 30-40% confluentie. <ol><li> Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml PBS kamertemperatuur. Verwijder de PBS, voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA en incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min. </li><li> Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groei medium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Aantal cellen met een hemocytometer en voeg 8,0 x 10 5 cellen C2C12 een 60 mm plaat. </li></ol></li><li> Voeg 0,5 ml retrovirus een 60 mm plaat van cellen te infecteren in 3 ml groeimedia. Zet de plaat naar de incubator. </li><li> Vervangen door 3 ml vers medium aangevuld met antibiotische selectie (puromycine 1-3 ug / ml) 48 uur na infectie. Vervang 3 ml medium met antibiotica elke dag voor ~ 5 dagen tot de getransduceerde C2C12 controle cultuur sterft uit. </li></ol></li><li> Lentivirus voorbereiding en C2C12 lentivirale transductie Opmerking: Voer alle-lentivirus gerelateerde procedures in Biosafety Level 2 kast en volg biologische veiligheidsrichtlijnen. Vloeibaar afval dat het virus moeten vóór verwijdering worden gedesinfecteerd. <ol><li> Plaat 4,0 x 10 6 293T cellen in een 100 mm plaat (-80% confluentie op de dag van transfectie) met HEK 293 celkweekmedium (DMEM hoog glucose, aangevuld met 10% foetaalrunderserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine) 24 uur voor transfectie. </li><li> Verwarm het transfectiereagens tot kamertemperatuur. Meng de lentivirale verpakkingsvectoren (4 ug pMD2.G en 6 ug psPAX2) met 8 ug lentivirale transfervector (Celf1 shRNA of scrambled controle shRNA) in 1 ml serumvrij celkweekmedium. Vortex kort. </li><li> Voeg 36 ul voorverwarmde transfectiereagens aan het DNA / DMEM buis en meng goed door vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Verwijder de 293T cellen uit de incubator en voeg het transfectie mengsel aan de plaat. Zwenk de plaat en vervolgens terug naar 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur werd vervangen transfectie mengsel met 10 ml vers kweekmedium. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende lentivirus 48 uur na transfectie en overzetten in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en retournerenincubator. Bewaar het supernatant bij 4 ° C. </li><li> Verzamel de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en deze combineren met de bovenstaande vloeistof uit 2.3.5. Centrifugeer kort bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min. </li><li> Breng het supernatans in een verse 50 ml centrifugebuis. Als het gebruiken van verse virus, ga dan naar stap 2.3.9. Voor toekomstig gebruik, opslag virus-bevattende supernatans bij -20 ° C in porties van 10 ml. </li><li> Ontdooi het virus 2.3.7 bij kamertemperatuur voor gebruik als een ingevroren voorraad wordt gebruikt. Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli. </li><li> Plate C2C12-CUG200 cellen (verkregen in paragraaf 2.1) zoals beschreven in 2.2.9 op dezelfde dag van transductie. Opmerking: Streef naar 30 - 40% van de samenvloeiing. </li><li> Voeg 0,5 ml virus op een 60 mm plaat van C2C12-CUG200 infecteren en de terugkeer van de plaat naar de incubator. </li><li> Vervang het kweekmedium door vers medium aangevuld met de selectie antibioticum (puromycine 1-3 ug / ml) 72 uur na transductie.Vernieuwen cultuur media elke dag met de selectie antibioticum voor ~ 5 dagen tot alle niet getransduceerde C2C12-CUG200 controlecultuur sterft uit. </li><li> Gebruik Western blot om Celf1 knock-down te controleren in GFP-CUG200 getransfecteerde cellen. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 Celdifferentiatie <ol><li> Plate 2 x 10 6 cellen in een putje van een 6-wells plaat in 2,5 ml groeimedium 24 uur voor aanvang van differentiatie. Opmerking: De uitplaatdichtheid kan worden afgesteld dat volledige confluentie bereikt in 24 uur. <ol><li> Spoel confluente cellen met PBS en voeg 2,5 ml van laag serum differentiatie medium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium gesupplementeerd met 2% paarden serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, en 1 uM insuline) . Vervang het medium elke twee dagen. Let op: Houd voorraad insuline bevroren en voeg deze toe aan de media op elk medium verandering. </li></ol></li><li> Tijdens C2C12 differentiatie, het verzamelen van monsters voor quantieve RT-PCR (zie hoofdstuk 4) op de volgende tijdstippen: Day0, 1, 2, 4 en 6. Werkwijze van de cultuur voor immunokleuring op dag 6-8 (zie paragraaf 5). </li></ol> 4. RNA isolatie en kwantitatieve RT-PCR <ol><li> Gebruik protocol van de fabrikant voor RNA-isolatie. Na isolatie, resuspendeer de RNA pellet in 30 pi RNase-vrij water en pipet op en neer meerdere malen. Opmerking: De monsters overgaan tot kwantitatieve RT-PCR en kan bij -80 ° C opgeslagen. </li><li> Gebruik een RT-qPCR kit voor Kwantitatieve RT-PCR 10 en volg de instructies van de fabrikant. Bereid het reactiemengsel volgens tabel 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bestanddeel </td><td> Volume (pl) </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> 2x reactiebuffer </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> voorwaartse primer </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse primer </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse transcriptase en RNase Inhibitor </td><td> 0.1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Sjabloon </td><td> 1 </td><td> 100 ng totale RNA </td></tr><tr><td> RNase vrij water </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Total Mix </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Kwantitatieve RT-PCR Master Mix Bereiding <ol start="3"><li> Voer een 20 pl RT-qPCR reactie middels thermisch profiel Tabel 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reverse transcriptie stap </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA-polymeerase activering / reverse transcriptase inactivatie </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 Cycles </td><td> 15 sec, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 2. De kwantitatieve RT-PCR thermisch profiel 5. Immunokleuring <ol><li> Bevestig de monolaag kweek in 2,5 ml vers bereide 4% paraformaldehyde / PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Permeabilize de monsters in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de monsters naar een vochtige kamer. Blokkeer de monsters in 2,5 ml blokkerende buffer (0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof / PBS, 10% normaal geit serum) gedurende 30 min bij 37 ° C. </li><li> Gooi blokkeerbuffer en breng 800 ul primaire antilichaam tegen de zware keten van myosine verdund in het blokkeren van buffer (1: 100). Incuberen in een bevochtigde kamer overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Was de plaat 3 times (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer (0,1% polysorbaat 20 / PBS) op dag 2. </li><li> Verwijder de wasbuffer en breng 800 ul secundair antilichaam (geit anti-muis IgG, 1: 500 verdund in PBS). Incuberen in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was twee keer (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer. </li><li> Incuberen met 800 ui DAPI (1 ug / ml, verdund in gedestilleerd gedeïoniseerd H2O) gedurende 5 min. </li><li> Wassen met 2,5 ml wasbuffer opnieuw gedurende 10 min. </li><li> Verander de wasbuffer tot 2,5 ml PBS en het gebruik van een fluorescentiemicroscoop om beelden vast te leggen. </li></ol>

<ol><li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+PS+%22Myotonic+dystrophy.+3rd+edn%22">Myotonic dystrophy. 3rd edn</a>. , W. B. Saunders. (2001).</li>
<li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li>
<li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy%3A+expansion+of+a+trinucleotide+%28CTG%29+repeat+at+the+3%27+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li>
<li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li>
<li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li>
<li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li>
<li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue%2C+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li>
<li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+%28DM%29+mutation+in+a+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li>
<li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28CTG%29n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line%3A+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
<li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmerson%2C+CP+%22Methods+in+muscle+biology%22">Methods in muscle biology</a>. 52, Academic Press. (1997).</li>
<li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li>
<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

C2C12 cellijn is gebruikt als een model om myogenesis 11-14 bestuderen. Deze cellen behouden een fibroblast-achtige look, prolifereren snel in media die 20% foetaal runderserum en gemakkelijk differentiëren in media die 2% paarden serum 15. De snelle groei en differentiatie zijn voordelige eigenschappen in een myogenesis cel model. Hier tonen we het gebruik van plasmide, retrovirale en lentivirale vectoren om cDNA, 3&#39;-UTR en shRNA introduceren in C2C12-cellen. De kritische punten voor transfect...

Myotone dystrofie (DM) is een autosomaal dominante ziekte die meerdere systemen, met name hart- en skeletspieren 1 beïnvloedt. Er zijn twee subtypen van deze ziekte, DM1 en DM2. DM1 is gebruikelijker en een ernstiger uiting dan DM2 2. De genetische mutatie onderliggende DM1 is een uitbreiding van CUG triplet repeats in het 3 &#39;onvertaalde gebied (UTR) van DM proteïne kinase gen (DMPK) 3. De CUG aantal repeats in aangetaste individuen varieert van 5 tot 37. Daarentegen verhoogt tot meer dan 50 en soms wel duizenden in DM1 patiënten 4. Hierdoor RNA-bindende eiwitten, zoals muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP en Elav-achtige familie 1 (Celf1), zijn misregulated. Door de opslag van de geëxpandeerde CUG herhalingen, verliest MBNL1 zijn vermogen om alternatieve splicing 5 reguleren. Celf1, anderzijds, wordt opwaarts gereguleerd 6,7. Overexpressie van Celf1 gaat gepaard met het verlies van spiermassaen zwakheid, die niet worden toegeschreven aan verlies van MBNL1 functie. Diermodellen simuleren DM1-gerelateerde veranderingen, waaronder DMPK 3&#39;-UTR CUG expansie, verlies van MBNL1 en overexpressie van Celf1, zijn vastgesteld. Echter, modelleren DM1 in myoblasten biedt een efficiënt alternatief, vooral voor ontleden DM1-gerelateerde cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. C2C12 myoblasten-cellijn werd voor het eerst geïsoleerd uit gewond C3H muis spier en op grote schaal gebruikt om myogene differentiatie 8,9 bestuderen. C2C12 cellen sneller prolifereren in foetaal bovine serum (FBS) bevattende media en gemakkelijk differentiatie ondergaan wanneer FBS leeg. Maar met deze myoblast differentiatie model presenteert twee problemen: C2C12 cellen zijn vaak resistent tegen gentransfectie / virale transductie; en lichte variaties in cel handling en differentiatie procedure kan leiden tot duidelijke veranderingen in myotube formatie. Ons laboratorium maakt gebruik van routinematig C2C12 myoblasten als acell model en heeft protocollen die effectief genen door plasmide transfectie, retrovirale transductie, en lentivirale transductie geven in C2C12 cellijn 10 ontwikkeld. In de video, tonen we de geoptimaliseerde procedures voor het transfecteren / transduceren C2C12 cellen en het behoud van differentiatie consistentie bij de vaststelling van DM1 myoblast modellen.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>voor kweekmedium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>voor kweekmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>voor kweekmedium</td></tr><tr><td>Insulin van bovien pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>voor differentiatiemedium</td></tr><tr><td>equine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>voor differentiatiemedium</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp;HD Transfectie Reagens</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>voor transfectie</td></tr><tr><td>G418 sulfaat&nbsp;</td><td>Gold Biotechnology&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>voor selectie van geneesmiddelresistentie</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>voor selectie van geneesmiddelresistentie</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Proteïnegelen, 1,0 mm, 15 putjes</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>voor western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>voor western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>voor western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>voor western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>primair Ab voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Texas Red-X-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secundair Ab voor immunokleuring</td></tr><tr><td>One step qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>voor qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagens</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>voor RNA-isolatie</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antilichaam (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primair Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Antilichaam</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>geiten polyklonaal IgG voor ladingscontrole</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>cellen voor retrovirusvoorbereiding</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>lege retrovirale vector voor retrovirusvoorbereiding</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>huis-gebouwd</td><td>niet beschikbaar</td><td>retrovirale vector die Celf1Flag codeert, gebruikt in retrovirusvoorbereiding</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>geschenk van Didier Trono</td><td>niet beschikbaar</td><td>voor lentivirusvoorbereiding</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>geschenk van Didier Trono</td><td>niet beschikbaar</td><td>voor lentivirusvoorbereiding</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>geschenk van M.S. Mahadevan</td><td>niet beschikbaar</td><td>details in verwijzing 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>geschenk van M.S. Mahadevan</td><td>niet beschikbaar</td><td>details in verwijzing 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>voor immunokleuring</td></tr></tbody></table>

modelleren van myotone dystrofie 1 in c2c12 myoblastcellen

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotone dystrofie 1 (DM1) is een veel voorkomende vorm van spierdystrofie. Hoewel verschillende diermodellen vastgesteld voor DM1, myoblast cell modellen blijven belangrijk omdat ze een efficiënte cellulaire alternatief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. Hoewel C2C12 myoblast cellen zijn op grote schaal gebruikt myogenesis, resistentie te bestuderen gen transfectie of virale transductie, belemmert onderzoek C2C12 cellen. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol dat dagelijks onderhoud, transfectie en transductie procedures omvat om genen in C2C12-myoblasten en de inductie van differentiatie myocyten. Tezamen zijn deze procedures inschakelen beste transfectie / transductie efficiëntie en samenhangende differentiatie resultaten. Het protocol bij de vaststelling DM1 myoblasten celmodellen zou de studie van myotone dystrofie, evenals andere spierziekten profiteren beschreven.

C2C12-cellen werden getransfecteerd met GFP-CUG5 of GFP-CUG200. Na resistentie selectie werden stabiele pools opgericht, die worden gevisualiseerd kan door GFP expressie (Figuur 1A). Myotube formatie in het gedifferentieerde myoblasten werd gedetecteerd door immunokleuring myosine zware keten 10 (figuur 1B). De kwantificering van myotube formatie aangetoond dat fusie indices werden afgenomen van 35,4 ± 4,1% tot 2,6 ± 1,1% en myotube gebieden w...

In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.

Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Het algemene doel van deze procedures voor het onderhoud, de transfectie en de transductie van myoblasten is het opzetten van een eencellig model voor myotone dystrofie voor de studie naar myotone dystrofie en andere spierziekten. Deze methode kan helpen bij het opzetten van M1-myoblastcellijnen die nuttig zullen zijn bij het onderzoeken van het gedetailleerde mechanisme van de M1-pathogenese. Deze gelaagde genmanipulatie van C2C12-myoblasten maakt het mogelijk om sequentiële en genetische pathologische gebeurtenissen in de M1 te modelleren. Plaats 24 uur voor de transfectie 7 × 10⁵ C2C12-cellen per put in een zes-putsplaat.Voeg de volgende dag 2 µg van het plasmid-DNA van belang toe aan 200 µL serumvrij medium op kamertemperatuur en vortex de oplossing kort. Voeg vervolgens 6 µL transfectiereagens op kamertemperatuur toe aan het medium en vortex de oplossing onmiddellijk gedurende 30 seconden. Incubeer het medium daarna 30 minuten bij kamertemperatuur.Vervang tijdens de laatste vijf minuten van de incubatie het medium in elke well door 2,5 ml vers serumvrij groeimedium en voeg 200 µL transfectiemengsel toe aan elke well. Plaats de plaat gedurende vier uur terug in de celkweekincubator.Controleer vervolgens de cellen onder een microscoop op veranderingen in hun morfologie en aanhechting. Indien er cytotoxiciteit wordt waargenomen, vervang dan het serumvrije medium door groeimedium. Voeg 48 uur na transfectie elke twee dagen gedurende 10 dagen het juiste selectieantibioticum in vers groeimedium toe.Totdat de controleput die zonder plasmiden is getransfecteerd geen levende cellen bevat. Om het retrovirus te prepareren, zaai eerst vier keer 10⁶ ecotrope HEK293-gebaseerde packagingcellen uit in een 100 millimeter plaat met celcultuurmedium. Meng de volgende dag 15 µg van het plasmide-DNA van belang in één milliliter serumvrij groeimedium en vortex de buis kortstondig.Voeg vervolgens 30 µL transfectiereagens op kamertemperatuur toe aan het medium en vortex de oplossing onmiddellijk gedurende 30 seconden. Voeg na 30 minuten bij kamertemperatuur het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de ecotrope cellen en draai de plaat voorzichtig rond. Plaats de plaat gedurende 24 uur terug in de celkweekincubator en vervang de volgende dag het medium door 10 mL vers groeimedium van 37 °C.48 uur na de transfectie worden de supernatanten die het retrovirus bevatten met een pipet overgebracht naar een enkele conische kolf van 50 milliliter voor bewaring gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 10 milliliter nieuw warm medium langs de wand van de plaat toe en plaats de cultuur terug in de incubator. Oogst de tweede batch retrovirus 60 uur na de transfectie.Voeg dit samen met het retrovirus dat na 48 uur is verzameld. Centrifugeer het supernatant om eventuele celresten te verwijderen en breng het retrovirus over naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Was vervolgens elke put van een C2C12-celkweek met drie milliliter PPS op kamertemperatuur, gevolgd door de toevoeging van 500 micro liter 0,25% trypsine EDTA voor een incubatie van vijf minuten bij 37 graden Celsius.Wanneer de cellen zijn losgelaten, wordt de reactie in elke put geneutraliseerd met drie milliliter groeimedium en wordt de cultuur zes tot acht keer gepipetteerd om de cellen te dissociëren tot een enkelcellige suspensie. Voeg na het tellen acht keer 10⁵ cellen toe aan een 60 milliliter plaat en voeg drie milliliter groeimedium toe. Infecteer de cellen vervolgens met nul punt vijf milliliter retrovirus en plaats de plaat gedurende 48 uur terug in de incubator.Voed de cellen na twee dagen dagelijks gedurende vijf dagen met drie milliliter vers groeimedium, aangevuld met het passende selectieantibioticum. Dit dient te gebeuren totdat de niet-getransduceerde C2C12-controlecultuur geen levende cellen meer bevat. Voor de lentivirale transductie van C2C12-cellen moeten in een veiligheidskast voor bioveiligheidsniveau 2 vier × 10⁶ 293T-cellen in een 100 millimeter plaat met HEK293-celcultuurmedium worden geplaatst.Meng de volgende dag de lentivirale verpakkingsvectoren met acht microgram van de juiste lentivirale transfervector in één milliliter serumvrij celkweekmedium. Vortex het mengsel kort en voeg 36 microliter voorverwarmd transfectiereagens toe. Vortex het medium vervolgens nogmaals 30 seconden en incubeer het mengsel 30 minuten bij kamertemperatuur.Voeg aan het einde van de incubatie het transfectiemengsel toe aan de 293T-cellen, draai de plaat voorzichtig rond en plaats de cellen terug in de incubator. Vervang na 24 uur het transfectiemengsel door 10 milliliter vers kweekmedium. Draag na 48 uur het supernatant dat het lentivirus bevat over naar een conische buis van 50 milliliter voor bewaring bij vier degree celsius, en voeg 10 milliliter vers, warm medium toe aan de plaat.Combine na 60 uur de tweede batch supernatant met het lentivirus dat na 48 uur is verzameld, en centrifugeer het virus om eventuele celresten te verwijderen. Voeg vervolgens 0,5 mL lentivirus toe aan een cultuur van C2C12 CUG200-cellen met een confluentie van 30 tot 40 procent, uitgeplaat in een 60 millimeter plaat zoals zojuist gedemonstreerd. Vervang 72 uur na transfectie het lentivirus-supernatant door vers medium, aangevuld met het geschikte selectieantibioticum.Ververs elke dag gedurende vijf dagen het kweekmedium met vers selectieantibiotica-gesupplementeerd medium, totdat alle niet-getransduceerde C2C12 CUG200 controlecellen zijn afgestorven. Na selectie op drugresistentie kunnen de GFP-expressie en myotubevorming van gedifferentieerde myoblasten worden beoordeeld via een manofluorescente analyse. Kwantificering van de myotubevorming in dit representatieve experiment laat zien dat de fusie-indices en myotube-oppervlakken significant afnemen door abnormale CUG-expansie en GFP CUG 200 getransfecteerde cellen.Een opregulatie van Celf1 is ook geassocieerd met CUG-expansie bij myogene dystrofie type 1. Bovendien toont western blotting consistent een verhoging van Celf1-proteineniveaus aan bij CUG, met een geremde expressie van MyoD, MyoG en Mef2C tijdens differentiatie. Dit suggereert dat CUG-expansie myotubulusdefecten en een verstoorde myoblastdifferentiatie induceert.Western blot-analyse onthult bovendien dat FLAG-getagd Celf1 uitsluitend aanwezig is in culturen die zijn getransduceerd met de retrovirale vector, en dat de expressie hiervan in deze culturen is upgereguleerd. Inderdaad is myotube-vorming zeldzaam in cellen die Celf1 overexpresseren in vergelijking met controlecturen. Dit suggereert dat de overexpressie van Celf1 de differentiatie van myoblasten ernstig belemmert.Verder is het niveau van endogeen Celf1-eiwit in lentivirale vector-getransduceerde GFP CUG 200-cellen, geselecteerd met dubbele antibiotica, sterk verminderd in de aanwezigheid van Celf1 short hairpin RNA. Met het herstel van de myotubusvorming werden myotubusfusie-indices en myotubusoppervlakken waargenomen in deze culturen. Ondertussen suggereren real-time RTPCR-resultaten dat de expressie van MyoD, MyoG en Mef2C significant is toegenomen in cellen die Celf1 short hairpin RNA tot expressie brengen, wat de mogelijkheid ondersteunt dat een Celf1-knockdown het defect in de myocytdifferentiatie in deze culturen heeft hersteld.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te controleren of de C2C12-celdichtheid onder de 70 procent confluentie blijft. Behandel de cellen na de celtransfectie gedurende ten minste vier uur, maar niet langer dan 12 uur, met serumvrij medium, terwijl de cytotoxiciteit van de cellen wordt gemonitord.Door middel van plasmidtransfectie, retrovirale en lentivirale transductie hebben we met succes een celmodel voor myotone dystrofie opgezet, dat van nut zal zijn voor onderzoek naar deze en andere spierziekten.

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Gekweekte spiercellen een inadequate model om geïnnerveerde spier...

Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van...

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Spierencellen behoren tot de meest complexe eukaryotische cellen. We presenteren een protocol voor de in vitro differentiatie van hoog gematureerde myofibers die genetische manipulatie en duidelijke beeldvorming mogelijk maakt tijdens alle ontwikkelingsstadia.

In Vitro Differentiatie van Mature spiervezels voor Live Imaging

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

We bieden een protocol om genen die extracellulaire matrix (ECM) eiwitten coderen in C2C12 myoblasten neer te halen met behulp van small-hairpin (sh) RNA. Gericht op ADAMTSL2 als voorbeeld, beschrijven we de methoden voor de validatie van de knockdown-efficiëntie op het mRNA-, eiwit- en cellulair niveau tijdens C2C12 myoblast tot myotubedifferentiatie.

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt modelleren van Duchenne spierdystrofie met behulp van MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cellen om het herstel van dystrofine mRNA en eiwitniveaus te evalueren na exon overslaan.

Exon Overslaan in direct geherprogrammeerd Myotubes verkregen uit menselijke urine-afgeleide cellen

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.

Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

Leer myotone dystrofie 1 modelleren in C2C12 myoblastcellen via transfectie en transductie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar spierziekten en ziektepathogenese.

Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen

Meer video's verkennen