Name: Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer hoe u axonuitlijning en myelinisatie van dorsale wortelganglionneuronen verbetert met een statisch voorgerekt celcultuursysteem. Deze methode gebruikt co-cultuur met Schwann-cellen voor zenuwweefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Eric Vasco bedanken voor zijn hulp bij de voorbereiding van het PDMS substraten, Dr. Shiyong Wang in het lab van Dr. Marina Mata aan de Universiteit van Michigan voor nuttige tips en training van de DRG isolatie, en Dr. Mark Tuszynski en Dr. . W. Marie Campana bij UC San Diego voor nuttige tips en protocol voor de SC isolement. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Science Foundation (CBET 0.941.055 en CBET 1.510.895), het National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 en R01EB014986).

Alle procedures voor de isolatie van de cellen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Michigan State University. 1. Voorbereiding van de Pre-gespannen Anisotropische Surface <ol><li> Meng een 10: 1 oplossing van base en uithardingsmiddel en giet het mengsel in een weefselkweekplaat (12 cm diameter). Gebruik 4900 mg base en 490 mg verharder voor het totale verknopingsmengsel. </li><li> Houd de gel mengsel onder vacuüm gedurende 20 minuten om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Plaats de gel mengsel in de oven gedurende de nacht uitharden bij 60 ° C. </li><li> Na het PDMS membraan kuren, behandel het oppervlak met zuurstofplasma met behulp van een plasma cleaning / etsen voor 3 min bij 165 mTorr en 65 sccm stroom van O2. </li><li> Knip een stuk rechthoekige membraan (5 x 3,5 cm) van de schotel, terwijl ze bewust welke kant-zuurstof behandeld, zorg ervoor dat de zuurstof behandelde zijde naar boven en zet op een stretching frame. Plaats het frame op een<html> stretching fase en gelijkmatig strekken door de knop op het podium totdat 10% rek bereikt (of een andere vooraf bepaalde rek, de rek kan worden afgelezen uit de rekken fase) in de langere as 9. Bevestig het traject door de schroeven op het frame. </li><li> Verwijder het frame van het podium. Zorg ervoor dat het membraanoppervlak is droog en vrij van stof, plaats dan een silicone kamer op het membraan waardoor de kleverige kant van de kamer om stevig te hechten aan het membraan. Opmerking: De siliconen kamer kan ook voor het vasthouden van het celmedium de PDMS membraan. Het apparaat apparatuur is getoond in figuur 1. </li><li> Steriliseer het oppervlak met UV gedurende 10 min. </li><li> Voeg 1 ml poly-L-lysine (PLL) (0,01% in fosfaat gebufferde zoutoplossing) aan de PDMS oppervlak binnen de kamer binnen 6 h plasmabehandeling en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C vóór de DRG neuronen zaaien. Dit vergroot celhechting. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Isolatie van DRG <ol><li> Bereid standaard groeimedium voor de DRG neuronen. </li><li> Voorafgaand aan de isolatie, de isolatie autoclaaf apparatuur en reagentia filter. Voeg 5 ml van isolatie buffer in een putje van een 6-well plaat, en leg de plaat op het ijs. Bereid 10 ml dissociatie medium door toevoeging van 1 ml collagenase A (500 U / ml) aan 9 ml 0,05% trypsine-EDTA (1 mg / ml), filtreer de oplossingen met een 0,22 urn filter en plaats op ijs. </li><li> Gebruik 11:50 5-7 oude Sprague-Dawley ratten dagen voor de isolatie. Spuit de pups met 75% isopropanol, en offeren door onthoofding. </li><li> Knip de huid bovenliggende het ruggenmerg van de achterkant en verwijder eventueel overtollige weefsel rond de wervelkolom. Onder een chirurgische vergrootglas met de chirurgische spotjes, levert de eerste incisie van de hals en een snede langs de wervelkolom aan beide zijden met een schaar. Maak de ruggengraat van het lichaam van de pups en verwijder de overtollige spieren. Dan, met een schaar langs de lon te snijdenG as van de wervelkolom en het gebruik pincet om de wervelkolom volledig openen en extraheren de spinale cord.Remove de tip van een pipet om een ​​grotere opening voor het overbrengen van de DRG&#39;s met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren. </li><li> Met behulp van een fijne pincet, verwijder de ganglion van het bot zak en het verzamelen van ongeveer 10-16 DRG van beide kanten. Snijd de zenuwwortels en de overdracht van de ganglia van de ijskoude isolatie buffer. </li><li> De tip van een pipet om een ​​grotere opening voor het overbrengen van de DRG&#39;s met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren. Na de chemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Laat de weefsels naar de bodem van de buis en verwijder de isolatie buffer geplaatst en voeg 10 ml dissociatie medium in de buis. </li><li> Incubeer de ontleed weefsel in de dissociatie medium in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur onder schudden de buis elke 5-10 minuten. </li><li> Nachemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml kweekmedium en vortex. </li><li> Centrifugeer de gescheiden cellen als vermeld in paragraaf 2.9 nogmaals. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer de pellet in 12 ml van de standaard groei media en vortex. </li></ol> 3. Culture of DRG op pre-stretched Surface <ol><li> Voorafgaand aan de cellen zaaien, de PLL oplossingen uit de kamer en spoel de PDMS oppervlak met steriel water en lucht drogen. </li><li> Na resuspenderen van de cellen, laat de suspensie ingesteld voor 1-2 minuten om de te laten bezinken naar de bodem van de buis. Voeg 1,5 ml celsuspensie in elk rek kamer en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Om gliacellen te elimineren, op 1 dag in vitro (DIV), voeg 10 ul (of 15 pi) mengsel van fluor-2 deoxy-uridine en uridine (FDU-U) stock solutiop (zie tabel van Materialen) aan elk putje. Na 7 uur, de plaats van dit medium door vers standaard groeimedium en plaats de voorgerekte kweekinrichting in een 37 ° C incubator met 5% CO2. </li><li> Tijdens de celkweek periode (2-3 weken), veranderen de media om de twee dagen door het vervangen van de helft van het verbruikte medium door vers medium. Let op: Na het kweken op de uitgerekte en zonder rek oppervlakken voor 2 weken, worden gezuiverd SC&#39;s toegevoegd aan de kamer en gedurende een week (stap 4.7). </li></ol> 4. Co-kweek van Schwann-cellen (SC) met DRG neuronen op pre-stretched Surface <ol><li> Isoleer SC&#39;s zoals beschreven door Dr. Campana de groep eerder 15. <ol><li> In het kort, isoleren van de SCS van een 1 dag oud pup. Verzamelen en distantiëren de nervus zenuwen zowel chemisch (trypsine-EDTA en Collagenase A) en mechanisch (18 gauge naald / 10 ml spuit) 15. </li><li> Het zaad van de gescheiden cellen in poly-D-lysine (PDL) coated T25 kolf en kweek bij 37 ° C in 5% CO2. Op dag 5, zuiveren de cellen door selectie antilichaam Anti- thy 1,1 antilichaam en konijn complement en subcultuur de gezuiverde cellen passage 2 - 4. Gebruik kweekmedium dat Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) , 1% penicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 ug / ml runderhypofyse-extract (BPE) en 4 uM forskoline. </li></ol></li><li> Verwijder het kweekmedium van de SC en voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA in de kolf. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2 - 3 min. </li><li> Controleer cellen onder de optische microscoop met een 10X objectief te zien of ze verheffen uit de kolf, voeg 5 ml kweekmedium en meng met de cellen in de kolf. </li><li> Voeg de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 7 ml standaard DRG groei medIA. </li><li> Neem 10 pi celsuspensie in een 0,5 ml microcentrifugebuis, mengen met 10 pi van trypan blauw, en tel het aantal cellen met een hemocytometer onder de optische microscoop met een 10X objectief. Verdun de celsuspensie tot 5000 cellen per ml door toevoeging DRG groeimedia. </li><li> Verwijder 0,5 ml van medium uit de DRG cultuur in de uitgerekte kamer en voeg 0,5 ml SC suspensie aan de DRG cultuur. </li><li> Kweken van de cellen gedurende 1 week bij 37 ° C en 5% CO 2. Verandering de media om de twee dagen door vervanging halve verbruikte medium met vers standaard groeimedium voor DRG. Na 1 week co-cultuur werkwijze de cellen door immunohistochemie 10. </li></ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Layer-by-Layer+Films+for+Biomedical+Applications%22">Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).</li>
<li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li>
<li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li>
<li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+bridge%3A+Engineering+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li>
<li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li>
<li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li>
<li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li>
<li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+small+on+large%3A+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Method+Appl+M%22%5BJournal%5D)">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li>
<li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron%2Fastrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films%3A+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly%28methyl+methacrylate%29+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+Extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+%28LRP1%29+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li>
<li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li>
<li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li>
<li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChandra%2C+G+%22Organosilicon+Materials%22">Organosilicon Materials</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li>
<li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen enkele belangenconflict te onthullen.

Om axon aanpassing aan voorgerekt oppervlak induceren, zijn er twee belangrijke stappen: 1) het PDMS membraan moet vlak en vormt een homogene dikte; en 2) gliacellen moeten van de DRG verwijderd. Na mengen van de PDMS en crosslinker en uitharding in een oven, moet de verknoopte PDMS gel op een vlakke werktafel bewaard en voorzichtig behandeld om eventuele kantelen te vermijden. De zuurstof plasmabehandeling van het PDMS membraan worden gevolgd door 6 uur PLL-bekleding, aangezien de hydrofiliciteit van het oppervlak (ver...

In zenuwletsels, worden de proximale en distale zenuwstompen vaak voorkomen directe aanpassing van de zenuw bundels door de laesie 1-2. Gewoonlijk worden axon stukken uit sterk geordende en uitgelijnd bundels van axonen, die complexe netwerken van connectiviteit vormen. Echter, zenuwregeneratie is een chaotisch proces te wijten aan slecht georganiseerde axon uitlijning 3-4. Derhalve voldoende regenererende axons die de laesie overbruggen genereren, is het noodzakelijk om goed georganiseerd axonale uitlijning induceren. Bovendien, demyelinisatie begeleidt zenuwbeschadigingen als gevolg van de dood van de myelinating cellen op het letsel plaats. Sinds demyelinisatie sterk schaadt de geleidende capaciteit van de overlevende axonen, behandelingen gericht demyelinisatie of het bevorderen van remyelinisatie zijn belangrijk voor functioneel herstel na zenuwletsel 5. Dus het doel van dit protocol is om een ​​technische benadering die deze twee aspecten worden behandeld illustrerenvan zenuwregeneratie. Oppervlak anisotropie, die wordt gedefinieerd als het verschil, gemeten langs verschillende assen in een materiaal fysische of mechanische eigenschappen, is toegepast op celuitlijning, groei en migratie 6-7 beïnvloeden. Naast topografie, zijn er andere methoden om anisotropie induceren. Eerder onderzochten we oppervlak anisotropie geïnduceerd door statische mechanische voorrek poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) membraan. De theorie van &quot;kleine deformatie super opgelegd grote&quot; voorspelde dat de effectieve stijfheid van de cellen zin in de gerekte richting afwijkt van de loodrechte richting, en dit verschil in effectieve stijfheid door anisotropie 8 oppervlak. Mesenchymale stamcellen (MSCs) gekweekt op een voorgerekt PDMS membraan kunnen de anisotropie zin door het oppervlak actief trekken en daardoor uitlijnen in de voorgerekte richting 9. Ook een anisotrope oppervlak arising Uit mechanisch voorgerekt oppervlak beïnvloedt de uitlijning, alsmede groei en myelinisatie van dorsale wortel ganglion (DRG) axonen 10. Hier hebben we een protocol voor het induceren oppervlak anisotropie op een statische voorgerekt PDMS substraat axon regeneratie 10 te verbeteren. Om axon uitlijning, topologische kenmerken met de gewenste patronen te lokken, naar verluidt contact begeleiding bieden door middel van uitgelijnde vezels en kanalen 6,11-12 werd aangetoond dat axon uitlijning 11,13 vergemakkelijken. Meldde echter technieken voor het induceren axon uitlijning met topologische kenmerken, zoals vezels, zenders en patroonvorming, konden verlengen en verhoging van de dikte van de axonen. Daarentegen geleidelijke mechanisch rekken tot axon aanpassing in de verstrekrichting met langere en dikkere axonen die toe met de grootte van het rek 14. Echter, voorzien van een motor aangedreven apparaat in vivo is niethaalbaar. Daarentegen statische voorgerekte geïnduceerde anisotropie eenvoudiger en gemakkelijker kunnen worden opgenomen in toekomstige ontwerpen scaffold voor in vivo toepassingen. In dit protocol wordt een statische voorgerekt celcultuur gebruikt oppervlak anisotropie induceren zonder topologische kenmerken. De voor uitgerekte kweeksysteem bestaat uit een PDMS membraan, een rekbaar frame en een stretching fase, waarna het membraan op het frame is bevestigd en een vooraf bepaalde magnitude rek wordt aangebracht op het podium strekken. Vers geïsoleerde DRG neuronen gekweekt op het voorgerekte oppervlak maximaal 21 dagen gecontroleerd op axon uitlijning en dikte. Vervolgens Schwann-cellen (SC) tezamen gekweekt met de uitgelijnde axonen gecontroleerd op myelinisatie. Door de integratie voorreksysteem oppervlak geïnduceerde anisotropie konden we celuitlijning-differentiatie en axon-groei uitlijning van MSC&#39;s en DRG neuronen 9-10 respectievelijk verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Medium 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-2 deoxy-uridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Isolatie Buffer</td></tr><tr><td>Type I Collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Silicone chamber</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaning/etching system</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Thy 1.1 antibody</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Complement</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Standard growth medium</td><td></td><td></td><td>Voor 500 ml Neurobasal Medium 1x, voeg 10 ml van B-27 50x, 5 ml van Glutamax-I 100x, 2,5 ml van Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml van Albumax-I en 1 &mu;l van NGF-- 7S (50 &mu;g/ml) toe.</td></tr><tr><td>FDU Uridine stock solution</td><td></td><td></td><td>FDU 100 mg in 10 ml van ddH2O (10 mg/ml), filter in de kap en verdeel in 500 &mu;l aliquots en bewaar bij -20 &ordm;C. Uridine 5 g in 166,7 ml van ddH2O (33 mg/ml), filter in de kap, verdeel in 200 &mu;l aliquots en bewaar bij -20 &ordm;C.
Neem 61,5 &mu;l van FDU (10 mg/ml) en 20,5 &mu;l van Uridine(33 mg/ml), en voeg 4.918 &mu;l van ddH2O toe voor een eindconcentratie, verdeel in 1 ml aliquots en bewaar bij -20 &ordm;C.</td></tr></tbody></table>

een aanpak ter verbetering van alignment en myelination van dorsale wortel ganglion neuronen

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axonregeneratie is een chaotisch proces, grotendeels als gevolg van ongeorganiseerde axonenuitlijning. Daarom is er, om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal geregenereerde axonen de laesieplaats kan overbruggen, een goed georganiseerde axonaal uitlijning vereist. Aangezien demyelinisatie na zenuwbeschadiging de geleidende capaciteit van overlevende axonen sterk aantast, is remyelinisatie cruciaal voor het succesvol functioneren van geregenereerde zenuwen. Eerder hebben we aangetoond dat mesenchymatische stamcellen (MSC's) uitgelijnd zijn op een anisotroop oppervlak dat vooraf wordt uitgerekt, omdat de cellen een grotere effectieve stijfheid kunnen waarnemen in de uitgerekte richting dan in de loodrechte richting. We toonden ook aan dat een anisotroop oppervlak dat voortkomt uit een mechanisch vooruitgerekt oppervlak op dezelfde manier de uitlijning, evenals de groei en myelinisatie van axonen beïnvloedt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van een vooruitgerekt anisotroop oppervlak, de isolatie en kweek van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen op een vooruitgerekt oppervlak, en tonen het myelinisatiegedrag van een co-cultuur van DRG-neuronen met Schwann-cellen (SC's) op een vooruitgerekt oppervlak.

De pre-uitgerekt celcultuur gepromoot DRG axon uitlijning 10. DRG neuronen werden gekweekt op voorgerekt en zonder rek oppervlakken 12 dagen. De axonen werden gekleurd voor β-III-tubuline om hun uitlijning te tonen. Figuur 2 vergelijkt axon oriëntatie op het pre-uitgerekte en zonder rek PDMS substraten na 12 dagen van de cultuur. De DRG axonen evenwijdig aan de gerekte richting, terwijl ze toonden willekeurige uitlijning en vormden een fijnmazig netwerk op de ...

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Het algemene doel van dit protocol is het verbeteren van de axonale uitlijning en myelinisatie van neuronen uit dorsal root ganglia met behulp van een statisch, vooraf uitgerekt celkweeksysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van nerve tissue engineering, zoals de uitlijning en diktegroei van axonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze methode van vooraf uitrekken niet alleen de axonale uitlijning verbetert, maar ook de myelinisatie bevordert.Om deze procedure te starten, giet het mengsel van basis en uithardingsmiddel in een weefkweekschaal. Houd het gelmengsel 20 minuten onder vacuüm om luchtbellen te verwijderen. Plaats het gelmengsel vervolgens gedurende de nacht in de oven bij 60 °C om te laten uitharden.Nadat het PDMS-membraan is uitgehard, wordt het oppervlak gedurende drie minuten behandeld met zuurstofplasma in het plasma-reinigings- en etssysteem. Snijd vervolgens een rechthoekig stuk membraan uit de schaal. Bevestig dit aan een rekframe met de zuurstofbehandelde zijde naar boven gericht.Plaats het frame vervolgens op een rekpodium en rek het gelijkmatig uit door aan de knop op het podium te draaien totdat

an-approach-to-enhance-alignment-myelination-dorsal-root-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we de techniek van het opstellen en onderhouden van gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen van de achterwortelganglia.

Voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia Neuronen in Gecompartimenteerde culturen

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

The video demonstrates the co-culturing of dorsal root ganglion (DRG) neurons with Schwann cells. DRG neurons are first grown on a pre-stretched membrane for aligned axon growth. Schwann cells are then introduced, which attach to the axons, insulating them and promoting neural cell survival and function.

Co-Culture of Schwann Cells with DRG Neurons on a Pre-Stretched Membrane

This video demonstrates a protocol for enriching neuronal cultures from dorsal root ganglia by immunopanning, thereby improving their purity and utility for neurological research.

Neuronal Enrichment of Dorsal Root Ganglia by Immunopanning

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

Source: Li, Q. et al. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates electroporation-mediated transfection of mouse DRG neurons to study axon regeneration. It outlines the steps for delivering nucleic acid constructs to DRG neurons, inducing sciatic nerve injury, and assessing axonal regeneration.

Electroporation-Mediated Transfection of Mouse Dorsal Root Ganglia to Promote Sensory Axon Regeneration

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Dit protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van hele berg en gedissocieerde culturen van muis Dorsal Root Ganglia (DRG) en hun gebruik om tumor-zenuwinteracties te beoordelen.

Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw

Leer hoe u axonuitlijning en myelinisatie van dorsale wortelganglionneuronen verbetert met een statisch voorgerekt celcultuursysteem. Deze methode gebruikt co-cultuur met Schwann-cellen voor zenuwweefselengineering.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Meer video's verkennen