Name: Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer gerichte RNA-sequencing voor genexpressie-analyse en mutatiedetectie. Deze methode verrijkt specifieke transcripten met hybride-opvang en streepjescodebibliotheken voor kosteneffectief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto en Eric Samorodnitsky voor technische ondersteuning. We willen ook Jenny Badillo bedanken voor haar administratieve ondersteuning voor ons team. We danken het Ohio Supercomputer Center (OSC) voor het verstrekken van schijfruimte, verwerkingscapaciteit en ondersteuning om onze analyses uit te voeren. We danken het Comprehensive Cancer Center (CCC) van het Wexner Medical Center van The Ohio State University voor hun administratieve ondersteuning van dit werk. S.R. en Team worden ondersteund door de American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), een Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association en Pelotonia.

Opmerking: Dit protocol beschrijft de gelijktijdige verwerking en analyse van vier monsters. Deze methode is compatibel met RNA geïsoleerd uit cellen, vers bevroren weefsel en in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel (FFPE). Dit protocol begint met 50 - 1.000 ng (250 ng aanbevolen) van start-RNA-input voor elk monster.
1. rRNA Depletion en fragmentatie van RNA-procedure
<ol>
	<li>rRNA Depletion
	<ol>
		<li>Verwijder eluent, prime, fragment mix, rRNA verwijdering mix, rRNA binding buffer en resuspendatie buffer uit -20 °C en laat op kamertemperatuur ontdooien. Verwijder elutiebuffer, rRNA verwijderingskralen en RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen uit 4 °C en breng op kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 0,25 µg RNA toe aan PCR-buis. Verdun het totale RNA met nuclease-vrij ultra-zuiver water tot een totaal eindvolume van 10 µl. Voeg 5 µl rRNA binding buffer toe aan elke buis, voeg vervolgens 5 µl rRNA verwijdering mix toe en pipet voorzichtig op en neer om te mengen. Plaats buizen in een thermische cycler met deksel voorverwarmd op 100 °C en programmeer de thermische cycler naar 68 °C gedurende 5 min om het RNA te denatureren.</li>
		<li>Na RNA-denaturatie, verwijder buizen uit de thermische cycler en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur. Vortex rRNA verwijderingskralenbuis krachtig om de kralen te resuspenderen. Voeg 35 µl rRNA verwijderingskralen toe aan nieuwe buizen en breng de RNA-denaturatiereactie (20 µl) over naar buizen met rRNA verwijderingskralen.</li>
		<li>Stel pipet in op 45 µl en pipet snel 20x op en neer om te mengen. Incubeer buizen bij RT gedurende 1 min. Plaats vervolgens buizen in magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Breng supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen en plaats deze buizen opnieuw in magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Dit zorgt ervoor dat er geen kralen worden overgebracht. Breng supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen.</li>
		<li>Vortex RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen en voeg 99 µl kralen toe aan elke buis. Pipet voorzichtig het hele volume 10x op en neer om te mengen. Als u begint met gedegradeerd-RNA, voegt u 193 µl goed gemengde RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen toe aan elke buis. Incubeer bij RT gedurende 15 min. Plaats vervolgens buizen op de magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder en gooi de supernatanten weg.</li>
		<li>Voeg 200 µl vers bereide 70% ethanol (EtOH) toe. Houd buizen op magnetische standaard en zorg ervoor dat de kralen niet worden verstoord. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 sec, verwijder en gooi vervolgens supernatant weg. Laat buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 - 10 min staan om te drogen.</li>
		<li>Centrifugeer ontdooid elutiebuffer bij kamertemperatuur bij 600 x g gedurende 5 sec. Voeg 11 µl elutiebuffer toe aan elke buis en pipet voorzichtig 10x op en neer om te mengen. Incubeer buizen bij RT gedurende 2 min. Plaats buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 min op magnetische standaard. Breng 8,5 µl van het supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fragmentatie van rRNA gedepleteerde RNA
	<ol>
		<li>Voeg 8,5 µl eluent, 8,5 µl prime en 8,5 µl fragment mix toe aan elke buis. Pipet voorzichtig 10x op en neer om te mengen. Plaats buizen in thermische cycler met het volgende programma: voorverwarmd deksel op 100 °C, 94 °C gedurende 8 min, vervolgens 4 °C houden. 
		OPMERKING: Deze stap is ontworpen om een gemiddelde insertgrootte van 155 bp te genereren. Als de gemiddelde fragmentgrootte van het RNA-monster lager is dan 200 bp, sla deze stap over en ga door naar First Strand cDNA Synthese.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. cDNA Synthese
<ol>
	<li>Synthesize First Strand cDNA
	<ol>
		<li>Verwijder first strand synthesemix uit -20 °C en laat op kamertemperatuur ontdooien.</li>
		<li>Programmeer de thermische cycler vooraf met de volgende instellingen: kies de optie voorverwarmen deksel en stel in op 100 °C, vervolgens 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 15 min, 70 °C gedurende 15 min en houd op 4 °C. Sla dit programma op als 'Synthesize 1st Strand'.</li>
		<li>Centrifugeer ontdooide first strand synthesemixbuis bij 600 x g gedurende 5 sec. Meng 1 µl reverse transcriptase met 9 µl first strand synthesemix.</li>
		<li>Voeg 8 µl first strand synthese en reverse transcriptasemix toe aan elke buis, pipet voorzichtig 6x op en neer om te mengen. Centrifugeer buizen gedurende 4 sec met een vaste snelheid mini tafelcentrifuge bij 6,0 x g om de vloeistof naar de bodem te brengen. Plaats buizen in de thermische cycler en selecteer Synthesize 1st Strand. Wanneer de thermische cycler 4 °C bereikt, verwijder buizen en ga onmiddellijk door naar Synthesize Second Strand cDNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synthesize Second Strand cDNA
	<ol>
		<li>Verwarm de thermische cycler voor op 16 °C met het deksel voorverwarmd op 30 °C. Ontdooi tweede streng mastermix en re-suspensiebuffer op ijs. Verwijder van tevoren de fles met paramagnetische kralen uit 4 °

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
<li>Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf">http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf</a> (2010).</li>
<li>Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html</a> (2012).</li>
<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14, R36(2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. ontvangt financiering van Novartis en Ariad Pharmaceuticals voor het uitvoeren van klinische onderzoeken. Directe familieleden van S.R. bezitten aandelen in Johnson en Johnson.

RNAseq Capture is een tussenliggende strategie tussen RNAseq- en microarray-benaderingen voor het evalueren van een geselecteerd deel van het transcriptome. De voordelen van Capture omvatten lagere kosten, snelle doorlooptijd op een desktopsequencer, hoge doorvoer en detectie van genomische veranderingen. De methode kan worden aangepast om niet-coderende RNA's23 te karakteriseren, enkele nucleotidevarianten4-6 te detecteren, RNA-splijten te onderzoeken en genfusies of structurele herschikkingen te i...

Gehele transcriptoom of RNA sequencing (RNAseq) is een onbevooroordeelde sequencingmethode om alle RNA-producten te beoordelen. Het doel van gerichte RNAseq (Capture) is een gerichte evaluatie van geselecteerde transcripten met verhoogde gevoeligheid, dynamisch bereik, verlaagde kosten of schaal, en verhoogde doorvoer in vergelijking met standaard RNAseq. Net als bij standaard RNAseq, kunnen getargete verrijkingsbenaderingen worden gebruikt om genexpressie, meerdere RNA-soorten zoals mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, andere niet-coderende RNA's2, genfusies3 en mutaties4-6 te evalueren.
Capture omvat hybridisatie van complementaire oligonucleotiden om cDNA-bibliotheken te verrijken voor sequencing. De redenering voor RNAseq Capture is vergelijkbaar met microarray-benaderingen waarbij complementaire oligonucleotiden of sondes worden gehybridiseerd met monsters en vervolgens worden gemeten voor relatieve abundantie. Voor microarray-technologieën is expressie gebaseerd op relatief signaal gemeten voor transcripten die aan deze sondes binden. Microarrays zijn dus beperkt door bereik, potentiële achtergrondruis van niet-specifieke binding en kruishybridisatie van sondes. Bovendien hebben arrays een beperkt dynamisch bereik voor laag en hoog tot expressie gebrachte transcripten in vergelijking met RNAseq1. Microarrays worden veel gebruikt vanwege hun lagere kosten en hoge doorvoercapaciteit in vergelijking met RNAseq.
Hier demonstreren we een methode voor RNAseq Capture die een middenweg biedt tussen RNAseq- en microarray-benaderingen voor het evalueren van het transcriptoom. RNAseq Capture heeft een gemiddelde doorvoer, groter dynamisch bereik en gevoeligheid, en is geschikt voor snelle omzet op desktop sequencers. RNAseq Capture vereist ook minder computationele bronnen in termen van opslagruimte en dataverwerking.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universal Blocking Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - PCR Purification beads&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Assay Tubes&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; EZ Hybridization and Wash Kits&nbsp; (24 or 96 reactions)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 or 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; 2.0 Fluorometer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Thermal Cycler with 96&ndash;Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcription 200 U/&#956;l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Sample Buffer</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Dry Bath</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagents</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

gerichte rna sequencing assay gene expression en genomic wijzigingen karakteriseren

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequentie (RNAseq) is een veelzijdige werkwijze die kan worden gebruikt voor het detecteren en karakteriseren van genexpressie, mutaties, genfusies en niet-coderende RNA&#39;s. Standard RNAseq vereist 30-100000000 sequencing leest en kan meerdere RNA zoals mRNA en niet-coderende RNA&#39;s. We laten zien hoe gerichte RNAseq (capture) maakt een gerichte studie op geselecteerde RNA-producten met behulp van een desktop-sequencer. RNAseq capture kan een annotatie, lage, of tijdelijk tot expressie transcripten die anders kan worden gemist met behulp van traditionele methoden RNAseq karakteriseren. Hier beschrijven we de extractie van RNA uit cellijnen, ribosomaal RNA uitputting, cDNA synthese, het opstellen van barcode bibliotheken, hybridisatie en vastleggen van gerichte transcripties en multiplex sequencing op een desktop sequencer. We hebben ook een overzicht van de geautomatiseerde analyse pijpleiding, die kwaliteitscontrole assessment, uitlijning, fusion detectie, genexpressie kwantificering en identificatie van enkele Nuc omvatleotide varianten. Deze test maakt gerichte transcript sequentiebepaling genexpressie genfusies en mutaties te karakteriseren.

Een schema waarin de belangrijkste stappen van RNAseq Capture worden belicht, is weergegeven in Figuur 1. Vier kankercellijnen met bekende mutaties werden gebruikt om de effectiviteit van de RNAseq Capture-techniek aan te tonen (K562 met ABL1-fusie, LC2 met RET-fusie, EOL1 met PDGFRalpha-fusie en RT-4 met FGFR3-fusie). De vier monsters werden samengevoegd en gesequenced met 2x 10 bp reads op een desktop-sequencer, wat FASTQ-bestanden ge...

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Het algemene doel van deze assay is het verrijken van doeltranscripten voor next generation sequencing. Deze gerichte RNA-sequencing-assay is een procedure in meerdere stappen die begint met de depletie van ribosomaal RNA uit totaal RNA, gevolgd door chemische fragmentatie en synthese van complementair DNA, preparatie van gebarcodeerde libraries, hybridisatie en capture van doeltranscripten, gemultiplexte sequencing, en eindigt met data-analyse. Deze video demonstreert de procedures voor hybridisatie, target capture en PCR-amplificatie na de capture voor vier monsters.Zo kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de moleculaire biologie, zoals het identificeren van genfusies, enkelvoudige nucleotidevariaties, relatieve genexpressie en alternatieve splicing van specifieke transcripten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze aanpasbaar is voor alle genen van belang. Om de hybridisatieprocedure te starten, haal je het volgende uit de vriezer van 20 °C en laat je dit ontdooien op ijs: aangepaste gehydrateerde probes, Cot-1 DNA, universele blokkerende oligos en adapter-specifieke blokkerende oligos.Combineer in een low-binding buis van 1,5 milliliter 500 nanogram DNA-monsters, 5 microliter Cot-1 DNA, één microliter universele blokkerende oligos, 0,5 microliter zes-nucleotide adapter-specifieke blokkerende oligos en 0,5 microliter acht-nucleotide adapter-specifieke blokkerende oligos. Plaats de monsterbuis met de dop open en in tegenovergestelde richting van de rotatie in een vacuümconcentrator. Droog de inhoud bij 45 graden Celsius gedurende 20 minuten, of tot de vloeistof volledig is verdampt.Resuspende vervolgens de gedroogde inhoud met 8,5 µL 2x hybridisatiebuffer, 3,4 µL hybridisatiecomponent A en 1,1 µL nucleasevrij water. Laat het mengsel 10 minuten resuspenderen, waarbij elke 2,5 minuten wordt gevortexd. Breng het geresuspendeerde materiaal over naar een 0,2 mL PCR-buis en incubeer dit in een thermocycler bij 95 °C gedurende 10 minuten.Verwijder de hybridisatiebuis uit de thermocycler en voeg twee microliters toe van de custom probes, die zijn geresuspendeerd in een concentratie van 1,5 picomoles per microliter. Incubeer de hybridisatiereactie overnacht bij 65 °C. De volgende stap na de multiplexed hybridisatie is de capture van het target-RNA met behulp van streptavidine-gekoppelde paramagnetische beads.Haal een fles kralen uit de koelkast (4 °C) en laat deze 30 minuten equilibreren bij kamertemperatuur. Bereid 1x werkoplossingen van alle benodigde buffers. Pipetteer 140 µL van de 1x wasbuffer één in een nieuwe 1,5 ml buis.Verwarm deze aliquote buffer en de volledige hoeveelheid 1x stringent buffer gedurende ten minste twee uur bij 65 graden Celsius in een warmteblok. Pipetteer de juiste hoeveelheid beads in een buisje van 1,5 milliliter. Plaats dit in het magnetische scheidingsrek en verwijder het supernatant.Voeg kraalwasbuffer toe en vortex selama 10 seconden. Plaats de buis twee tot vijf minuten in het magnetische scheidingsrek of totdat de supernatant helder is. Verwijder de supernatant.Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten. Nadat de bead-wasbuffer is verwijderd, wordt er een volume bead-wasbuffer toegevoegd dat gelijk is aan het oorspronkelijke startvolume. Resuspendeer en breng over naar een PCR-buis van 0,2 milliliter.Plaats de buis gedurende twee tot vijf minuten in het magneetrek of tot het supernatant helder is. Verwijder het supernatant. Plaats de buis met beads in een mini-warmteblok bij 65 °C.Overbreng het hybridisatie-monster naar de buis met beads, pipetteer dit 10 keer op en neer om te mengen en incubeer gedurende 45 minuten bij 65 °C. Vortex het monster elke 15 minuten en centrifugeer dit vier seconden in een tafelmodel mini-centrifuge met vaste snelheid. Wanneer de incubatie van 45 minuten voltooid is, verwijder dan de capture-buis uit het warmteblok.Voeg 100 µL voorverwarmde 1x wasbuffer één toe aan de buis en vortex vervolgens 10 seconden om te mengen. Overbreng het mengsel naar een nieuwe, low-binding 1,5 ml buis. Plaats de buis in het magnetische rek en laat dit twee tot vijf minuten scheiden, of totdat de supernatant helder is.Verwijder het supernatant. Voeg 200 µL voorverwarmde 1x stringent wash buffer toe en pipetteer dit 10 keer op en neer om te mengen. Incubeer gedurende vijf minuten bij 65 °C.Plaats de buis in het magnetische rek en laat dit twee tot drie minuten bezinken voor scheiding. Verwijder het supernatant. Herhaal de stringente wasstap eenmaal voor een totaal van twee wasbeurten.Voeg 200 µL 1x wasbuffer één op kamertemperatuur toe en vortex twee minuten om te mengen. Plaats de buis in het magnetische rek, laat het twee tot vijf minuten bezinken en verwijder het supernatant. Voeg 200 µL 1x wasbuffer twee op kamertemperatuur toe en vortex één minuut om te mengen.Plaats de buis gedurende twee tot vijf minuten in het magnetische scheidingsrek en verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 200 µL 1x wasbuffer drie op kamertemperatuur toe en vortex 30 seconden om te mengen. Plaats de buis gedurende twee tot vijf minuten in het magnetische scheidingsrek en verwijder vervolgens het supernatant.Verwijder tot slot de buis uit het magnetische scheidingsrek en voeg 20 microliters nuclease-vrij water toe om de beads opnieuw te suspenderen. Meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren. Voordat u de PCR-amplificatie na de capture opzet, haalt u de paramagnetische beads uit vier graden Celsius en laat u deze 30 minuten equilibreren bij kamertemperatuur.Haal de 2x hot start PCR ready mix en de PCR-primermix uit de vriezer van 20 graden Celsius, ontdooi deze bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens op ijs. Bereid een library-amplificatiemastermix voor door 27,5 µL 2x hot start PCR ready mix, 2,75 µL PCR-primer één en 2,75 µL PCR-primer twee te combineren. Stel de reactie op in een PCR-buis door 20 µL kralen met gevangen DNA te mengen met 30 µL van de library-amplificatiemastermix.Sluit de buis goed af en vortex deze om te mengen. Centrifugeer de buis vier seconden lang in een vaste-snelheid mini-tafelcentrifuge bij 6×g. Plaats de buis in de thermocycler en start de PCR-amplificatie met behulp van het volgende PCR-programma: een initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 45 seconden, gevolgd door 10 tot 12 cycli van denaturatie bij 98 °C gedurende 15 seconden, annealing bij 65 °C gedurende 30 seconden en extensie bij 72 °C gedurende 60 seconden.Eén laatste extensiecyclus bij 75 °C gedurende 60 seconden, en vervolgens bewaren bij 4 °C. Wanneer de PCR is voltooid, wordt het monster uit de thermische cycler verwijderd. Voeg 75 µL paramagnetische beads toe, meng goed en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.Plaats de buis bij kamertemperatuur gedurende twee tot drie minuten in het magnetische rek en verwijder vervolgens het supernatant. Was de beads op de magneet door 200 µL 80% ethanol toe te voegen, 30 seconden te incuberen en vervolgens het supernatant te verwijderen. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten.Nadat het supernatant van de tweede ethanolwas is verwijderd, laat u de kraaltjes vijf tot tien minuten drogen bij kamertemperatuur, maar voorkom overdroging om barstvorming te vermijden. Resuspendeer de kraaltjes in 22 µL Tris-EDTA pH 8.0 en laat dit drie minuten inwerken voor elutie. Plaats de monster op de magneet voor drie tot vijf minuten.Breng tot slot 20 µL van het geëlueerde product over naar een nieuwe, low-binding 1,5 mL buis, waarbij wordt gewaarborgd dat er geen beads worden meegenomen. Een vergelijking van de genexpressie tussen de capture-methode en niet-gerichte RNA-sequencing in vier kankercellijnen onthulde dat de capture-methode de doelgenen, in het blauw weergegeven, 10 tot 1000 keer sterker verrijkte dan de niet-doelgenen, weergegeven in het grijs. Daarnaast was het percentage reads dat in kaart werd gebracht op doelregio's hoger in de capture-bibliotheken vergeleken met de niet-gerichte RNA-sequencing-bibliotheken.Een beoordeling van de kwaliteitscontrolemaatregelen toonde aan dat capture en non-targeted RNA-sequencing gelijkwaardig presteren wat betreft de uitlijning met het transcriptoom en de belangrijkste insertgrootte. Met de capture-methode werd een hoger percentage exonische regio's en een lager percentage intronische regio's gesequenced. Zoals verwacht genereerde non-targeted RNA-sequencing meer dan 50 keer zoveel totale sequencing reads per monster als capture.Bij gebruik van de capture-methode was het percentage ribosomaal RNA-sequenties in elk monster lager. Ten slotte tonen vergelijkingen van single nucleotide variants die zijn geïdentificeerd in overlappende regio's van capture en RNA-sequencing voor elk van de vier cellijnen een hoge concordantie van variantie aan tussen capture en RNA-sequencing binnen de doelregio. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te werken tijdens het opvangen van gehybridiseerde targets en ervoor te zorgen dat de reactie op 65 °C blijft. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de moleculaire biologie om transcripten van belang op een high-throughput en kosteneffectieve manier te bestuderen.

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Leer gerichte RNA-sequencing voor genexpressie-analyse en mutatiedetectie. Deze methode verrijkt specifieke transcripten met hybride-opvang en streepjescodebibliotheken voor kosteneffectief onderzoek.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Meer video's verkennen