Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Het algemene doel van deze experimentele strategie is om de functionaliteit van ziekte-geassocieerde niet-coderende varianten te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de genomics, zoals hoe genetische varianten die de aminozuursequentie niet daadwerkelijk veranderen, toch bijdragen aan het ziektefenotype. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een gestroomlijnd proces biedt voor het beoordelen van genetische variantie voor functieactiviteit en inzicht geeft in effectieve regulatorische eiwitten en paden.

Deze techniek kan ten goede komen aan het onderzoek van elke ziekte met een kandidaat-oorzakelijke variant. Omdat de procedure voor het analyseren van deze varianten universeel is, ongeacht het fenotype dat wordt bestudeerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in menselijke ziekten, kan deze ook worden toegepast op mutaties in elk organisme.

Nucleaire lysaten worden in dit experiment bereid uit B-lymfoblastoïde cellen, maar deze procedure kan op de meeste cellijnen worden toegepast. Na het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer, worden de gewenste aantal cellen gecentrifugeerd voor lysering. Het medium wordt afgezogen, 10 milliliter ijs-koud PBS wordt toegevoegd en de cellen worden opnieuw gecentrifugeerd.

Was de cellen een tweede keer met PBS en verwijder het PBS na het centrifugeren. Resuspendeer de celpalais in ijs-koud PBS met één milliliter PBS per 10 tot de zevende cel. Doe één milliliter van de celsuspensie in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes, zodat elke buis 10 tot de zevende cellen in PBS bevat.

Centrifugeer gedurende twee minuten en zuig het PBS af. Voeg toe aan een werkend voorraad CE-buffer, één millimolair dithiothreitol of DTT, 1X fosfataseremmer en 0,5 millimolair fenylmethylsulfonylfluoride of PMSF. Resuspendeer elke celpalette met 400 microliter van deze buffer en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.

Voeg 25 microliter 10% Nonidet P-40 toe aan elke microcentrifugebuis en meng door te pipetteren. Centrifugeer gedurende drie minuten bij vier graden Celsius en maximale snelheid. Decanteer en gooi de supernatant weg.

Voeg vervolgens toe aan een werkend voorraad NE-buffer, één millimolair DTT, 1X fosfoaase-remmer en één millimolair PMSF. Resuspendeer elke cellipalet met 30 microliter van deze buffer en meng door te voortbewegen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius, in een buisrotator.

Centrifugeer gedurende twee minuten. Verzamel de heldere supernatant, dat het nucleaire lysate is. Doe het nucleaire lysate in aliquoten voordat het wordt bewaard bij min 80 graden Celsius om meerdere vries-ontdood cycli te vermijden die het eiwit kunnen degraderen.

Begin deze procedure door een 50 nanomolaire werkvoorraad van het oligonucleotide te bereiden, zoals beschreven in de protocoltekst. Plaats de oligo's in een hitteblok op 90 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na vijf minuten zet de hitteblok uit en laat de oligo's langzaam afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste één uur voor gebruik.

Bereid vervolgens de elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay of EMSA-gel voor. Verwijder de schuif van een voorgegoten, zes procent tris-boraat-EDTA of TBE-gel en spoel deze onder gedeïoniseerd water meerdere keren om eventueel buffer uit de putjes te verwijderen. Monteer de gelelektroforese-apparatuur en controleer op lekken door de binnenste kamer te vullen met 0,5X TBE-buffer.

Als er geen buffer in de buitenste kamer lekt, vul de buitenste kamer ongeveer twee derde van de weg. Voorloop de gel gedurende 60 minuten op 100 volt. Wanneer de voorloop is voltooid, spoel elke put met 200 microliter 0,5X TBE-buffer.

Bereid een bindingsbuffer-mastermix voor. Meng in een microcentrifugebuis de reagentia die voor alle reacties gemeenschappelijk zijn. 10X bindingsbuffer, DTT polysorbaat, Poly(dI-dC) en zalmzaad DNA.

Om de EMSA-reacties op te zetten, voeg nuclease-vrij water toe aan elke microcentrifugebuis, zodat het eindvolume, na toevoeging van alle reagentia, 20 microliter zal zijn. Voeg de juiste hoeveelheid mastermix toe aan elke microcentrifugebuis. Voeg acht microgram nucleair lysate toe aan de juiste microcentrifugebuisjes.

Neem buisjes met het oligo op, zonder nucleaire extract, als negatieve controles. Voeg 50 femtomol oligo toe aan de juiste microcentrifugebuisjes en schud om te mengen. Centrifugeer de inhoud kort naar de bodem van de buis.

Incubeer alle buisjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens twee microliter 10X oranje laaddye toe aan elke microcentrifugebuis. Pipet op en neer om te mengen.

Laad de monsters in de voorlopige, zes procent, TBE-gel door op en neer te pipetten om te mengen en vervolgens elke monster in een apart putje uit te zetten. Laat de gel gedurende ongeveer 60 tot 75 minuten draaien op 80 volt, totdat de oranje kleurstof twee derde tot drie kwart van de weg door de gel is gemigreerd. Wanneer de run is voltooid, gebruik een gelmes om de plastic cassette open te prijzen.

Verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in een container met 0,5 procent TBE-buffer om te voorkomen dat deze uitdroogt. Plaats de gel op het oppervlak van een infrarood- en chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. Verwijder eventuele luchtbellen of verontreinigingen die het beeld kunnen verstoren.

Scan de gel met behulp van de scansysteemsoftware zoals beschreven in de protocoltekst. Om deze procedure te beginnen, bereid een vijf micromolair oligo werkvoorraad voor zoals beschreven in de protocoltekst. Plaats de oligo's in een hitteblok op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Na vijf minuten zet de hitteblok uit en laat de oligo's langzaam afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik. Verwarm de volgende buffers tot kamertemperatuur: bindingsbuffer, lage strengdichtheid wasbuffer, hoge strengdichtheid wasbuffer en elutiebuffer. Bereid de bindingsmengsels voor elke variant voor.

Men