Name: Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer de stripe assay om de aantrekkelijke of afstotende activiteit van axon geleidingsmoleculen te evalueren met gescheiden hippocampusneuronen. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van groeikegels mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van de Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 en 26670090 aan S.Y.).

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd Hamamatsu University School of Medicine. 1. Bereiding van Matrices <ol><li> Kook 4-8 ​​silicone matrices in de magnetron of op een hete plaat gedurende 5 minuten en laat ze goed drogen gedurende 1 uur onder laminaire stroming (gestreept kant naar boven). Opmerking: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming. </li><li> Blaas perslucht of gebruik plakband om stof uit de gestreepte kant van de matrices te verwijderen. Houd de gestreepte kant schoon, dus het kan vast houden aan het plaatoppervlak. </li><li> Plaats voorzichtig de matrices op 6-cm plastic schaaltjes door te drukken met een vinger (één matrix per gerecht; streep naar beneden). Zorg dat er geen luchtbellen tussen de matrix en het gerecht. Markeer de locatie van de strepen aan de onderzijde van de kweekschaal. </li><li> Als de matrix niet te bevestigen, herhaal stap 1.2. </li></ol>2. Stripe Generation en Laminin Coating voor Neuron Cultuur <ol><li> Bereid fluorescent gelabeld recombinant eiwit (25 pl elk voor injectie [stap 2,2] of 100 pl elk voor de plaatsingsmethode [stap 2.2.1]) door mengen van het Fc-gemerkt eiwit (10-50 ug / ml) en een fluorescente kleurstof- geconjugeerd anti-humaan Fc antilichaam (1-3 ratio: 30-150 gg / ml) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vervolgens incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van een 22-G spuit injecteren 25 ul van het recombinante eiwit bereid in de vorige stap (2,1) door de kleine opening aan de zijde van de matrix (pijl in figuur 1A, 1C en 1E). <ol><li> Of hang 100 gl van het recombinante eiwit in de bovenste gleuf van de matrix en zuig ongeveer de helft van de oplossing uit het kleine gat (pijlen in Figuur 1A, 1C en 1E), zodat het recombinante eiwit blijft de gestreepte gebieden. </li></ol></li><li> Incubeer de schotel voor 30 min bij 37 ° C in een celkweek incubator. </li><li> Plaats 300 pl PBS in de bovenste gleuf (Figuur 1B) en zuig de kleine opening aan de zijkant van de matrix (pijl in figuur 1 A, C en E) voor losse recombinante eiwitten te verwijderen. Laat de PBS niet volledig te zuigen, omdat de eiwitten zal drogen. Herhaal deze stap twee keer. (3 keer in totaal) </li><li> Verwijder voorzichtig de matrix en onmiddellijk plaats ~ 100 ul van controle-eiwit (10-50 ug / ml; Fc) om de hele gestreepte gebied bestrijken, het creëren van een alternatieve coating. Vervolgens incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de celkweek incubator. </li><li> Na wassen van de schaaloppervlak driemaal met PBS, laag met ~ 100 ul van 20 ug / ml laminine in PBS. Opmerking: laminine moet worden op ijs ontdooid om stolling te voorkomen. </li><li> Incubeer de schotel voor 1 uur bij 37 ° C in de celkweek incubator. </li><li> Was de schaal oppervlak drie keer met PBS en voeg cultuur medium. Plaats de gecoate schaal kweekmedium in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot gebruik. </li></ol> 3. Het kweken hippocampus neuronen van E15.5 muizenembryo&#39;s <ol><li> Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en te isoleren drie E15.5 embryo&#39;s. </li><li> Snijd de huid en de schedel sagittally op de middellijn van het hoofd met een schaar en verwijder de hersenen met behulp van een kleine lepel. Breng de hersenen voorzichtig een 60 mm petrischaal met 3 ml Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Met behulp van een scalpel, knip de hemisferen waaronder cortex, hippocampus en striatum (Figuur 2A). Vervolgens ontleden de hippocampusgebied door voorzichtig verwijderen van de hersenvliezen, en breng de ontleed hippocampale weefsels in een 15 ml centrifugebuis met 2 ml HBSS oplossing, op ijs (figuur 2B-C). Verzamel 6 hippocampus van 3 embryo in de buis, die voldoende is voor het kweken van neuronen in 8 gerechten. </li><li> Vervang de HBSS oplossing met trypsine / EDTA-oplossing (2 ml) en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 15 min in een waterbad. Opmerking: Zuig HBSS zonder centrifugeren en niet de HBSS oplossing decanteren door het kantelen van de buis. </li><li> Neutraliseer de trypsine activiteit door toevoeging van 500 ul foetaal runderserum (FBS). </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 100 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en was de pellet met 2 ml kweekmedium. Herhaal deze stap nog een keer. </li><li> Pipet de hippocampus op en neer 10 keer in kweekmedium met behulp van een 1000-ul tip met een groot gat (cut-tip) om het weefsel te scheiden. </li><li> Ga verder met een gewone (ongesneden) 1000-ul tip en pipet het gedissocieerde weefsel op en neer om een ​​single-cell suspensie te verkrijgen. </li><li> Scheid de afzonderlijke cellen door ze door een 80-100-um mesh cel zeef. </li><li> Centrifugeer de gefilterde enkele celsuspensie bij 150 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door opzuigen, en resuspendeer de Pellet (neuronen) in 2 ml kweekmedium. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer met trypan blauw kleuring de dichtheid en levensvatbaarheid te bepalen. Dan plaat 10.000 neuronen in 150 ul kweekmedium voor elke set stripes.The schorsing zorgvuldig worden geplaatst om de hele streep regio te dekken. </li></ol> 4. Visualisatie van cellichamen en axonen door immunofluorescentiekleuring gebruik van een anti-Tau1 Antibody <ol><li> Na 24 uur cultuur, zuig het medium zonder de hechtende cellen, en bevestig de neuronen met voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) / 4% sucrose / PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Indien gewenst, gebruik maken van een waterafstotende pen om een ​​cirkel rond de gestreepte regio te vestigen op de hoeveelheid antilichaam die nodig is te verminderen. </li><li> Permeabilize de neuronen met 0,3% Triton X-100 / PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Incubeer de neuronen met blokkeeroplossing die 3% donkey serum en 0,1% Triton X-100 voor30 min gevolgd door incubatie met een anti-Tau1 antilichaam (1: 200) in 1% donkey serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bij 4 ° C. </li><li> Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Incubeer de neuronen met een fluorofoor geconjugeerd anti-muis IgG antilichaam in 1% runderserumalbumine (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 min. </li><li> Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Bedek de gestreepte gebied met een 18 mm x 18 mm dekglas met behulp van 50 pi antifade oplossing. vermijd luchtbellen die interfereren met de beeldvorming. </li><li> Verkrijgen fluorescerende beelden met een fluorescentiemicroscoop met de juiste systeem, bijvoorbeeld x10 objectieflens filter sets voor GFP en RFP en 1000 msec blootstellingstijd (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een streep test die recombinant eiwit en gedissocieerde neuronen maakt gebruik van het E15.5 muis hippocampus. Deze test maakt het mogelijk efficiënte observatie van afstotelijk, aantrekkelijk, of neutraal reacties van neuronen om een ​​recombinant eiwit van interesse in een gestreept patroon. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoudige methode voor het genereren van de stroken, waarbij het ​​eiwit direct gedrukt op het oppervlak van een plastic schaaltje, in vergelijking met de traditio...

Axon begeleiding is het proces waarbij nieuw gevormde neuronen sturen hun axonen Tijdens het ontwikkelen van het zenuwstelsel 1,2. Het ontwikkelen van axonen dragen een zeer beweeglijke structuur op hun tip genaamd de groei kegel. De groei kegel zintuigen extracellulaire signalen naar het pad van de axon te navigeren. Navigatie moleculen, zoals spleet semaphorines en ephrines kunnen aantrekken of afstoten axons afhankelijk van hun wisselwerking met geschikte receptoren en co-receptoren op het axon 1,3,4. De geactiveerde receptoren dragen signalen naar de groeikegel dat de organisatie van het cytoskelet en van axon groei-cone bewegingen beïnvloeden. Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om de werking van aantrekkende en afstotende moleculen evalueren. Chemo-aantrekkende en insectenwerende middelen kunnen worden toegediend in de groei / cultuurmedium met een gradiënt concentratie (bv., Dunn&#39;s kamer of μ-dia) 5,6, in een zeer geconcentreerde spot door micro-pipette (bijv., draaien bepaling) 7 of op een homogene concentratie bad toepassing (bv., groeikegel ineenstorting test) 8,9. Andere werkwijzen omvatten een streep assay of microcontactprinten (μCP), waarin een chemo-aantrekkende of afstotende wordt gecoat op het oppervlak van een plaat als substraat 10-12. Thestripe test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Bonhoeffer en collega&#39;s in 1987 tot topografische kaart brengen in het kuiken retino-tectal systeem 13 te analyseren. De oorspronkelijke methode vereist een vacuüm systeem om manteleiwitten op polycarbonaat nucleopore membranen met behulp van gestreepte en fijnmazige matrices. In latere versies werden de recombinante eiwitten direct gedrukt op het oppervlak van een kweekplaat in een gestreept patroon via smalle spleet silicium matrices 14,15. Onlangs hebben verschillende onderzoeksgroepen succes toegepast deze streep test om de analyse van axon begeleiding moleculen activiteiten 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier presenteren we het gedetailleerd protocol voor een streep test die de aantrekking of afstoting van axon begeleiding moleculen voor gedissocieerde hippocampus neuronen meet. Met name kan deze werkwijze worden toegepast bij minimaal uitgerust laboratorium instellingen. Voor deze test zijn afwisselende strepen van een fluorescent gelabeld substraat en een controle-eiwit gegenereerd op een plastic schaaltje met een siliconen matrix met 90-um spleten en gecoat met laminine. In onze demonstratie, los hippocampus neuronen uit E15.5 muizen werden gekweekt op afwisselende strepen van recombinante ectodomein van fibronectine en leucine-rijke transmembraaneiwit-2 (FLRT2) en de controle Fc proteïne 21. Na 24 uur kweken werden zowel de axonen en cellichamen van de neuronen sterk afgestoten van de FLRT2 strepen. Kleuring met anti-Tau1 antilichaam bleek dat ~ 90% van de neuronen werden verspreid op-Fc beklede gebieden, tegenover ~ 10% op de FLRT2-Fc, wat aangeeft dat FLRT2 een sterke afstotendefunctie hippocampale neuronen 21.

<table><tbody><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Verdunning 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tau1 antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Verdunning 1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Alternatief montagemedium kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Verdunning 1/50</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation machine</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm No. 1</td><td></td></tr><tr><td>DAKO pen</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Alternatieve waterafstotende pen kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Disposable scalpel</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluorecent microscope</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Forceps No. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Verdunning 1/100</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>22 gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc Fragment</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Verdunning 1/100</td></tr><tr><td>Plastic culture dish, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Matrices</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar en koopbaar bij Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Tip, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Transparent sticky tape</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Alternatieve kleefband kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal aangevuld met B27, GlutaMAX en Penicillin-Streptomycin.</td></tr></tbody></table>

stripe assay aan de aantrekkelijke of repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met gescheiden hippocampus neuronen studie

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Groeiende axonen ontwikkelen een zeer mobiele structuur aan hun punt, de zogenaamde groeikogel. De groeikogel maakt contact met extracellulaire omgevingssignalen om de axonale groei te navigeren. Netrin, slit, semaforine en efrinen zijn bekende geleidingsmoleculen die axonen kunnen aantrekken of afstoten bij binding aan receptoren en co-receptoren op het axon. De geactiveerde receptoren initiëren verschillende signaalmoleculen in de groeikogel die de structuur en beweging van de neuron veranderen. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol voor een streepjesassay om het vermogen van een geleidingsmolecuul om neuronen aan te trekken of af te stoten te beoordelen. In deze methode worden gedissocieerde hippocampale neuronen van E15,5 muizen gekweekt op laminine-gecoate schalen, verwerkt met afwisselende strepen van het ectodomein van fibronectine en leucinerijk transmembraan-eiwit-2 (FLRT2) en controle immunoglobuline G (IgG) fragment kristalliseerbare regio (Fc) eiwit. Zowel axonen als cellichamen werden sterk afgestoten van de FLRT2-gecoate streepgebieden na 24 uur van cultuur. Immunokleuring met tau1 toonde aan dat ~90% van de neuronen verdeeld was op de Fc-gecoate strepen vergeleken met de FLRT2-Fc-gecoate strepen (~10%). Dit resultaat geeft aan dat FLRT2 een sterk afstotend effect heeft op deze neuronen. Deze krachtige methode is niet alleen toepasbaar voor primair gekweekte neuronen, maar ook voor een verscheidenheid aan andere cellen, zoals neuroblasten.

Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur op strepen van fluorescent gelabelde controle Fc (figuur 3A-C) of FLRT2-Fc (Figuur 3D-F) afwisselen met ongemerkte controle Fc. In beide gevallen, de neuronen werden samengevoegd en uitgebreid hun axonen als bundels. Op het controle Fc / Fc strepen, de neuronen werden gelijkmatig verdeeld over de fluorescent gelabelde en ongelabelde strepen en breidden ze hun axon...

Axon-geleidingsmoleculen reguleren neuronale migratie en gerichte groei-kegel navigatie. We presenteren een krachtige methode, de stripe assay, om het vermogen van geleidingsmoleculen om neuronen aan te trekken of af te stoten te beoordelen. In dit protocol demonstreren we de stripe assay door de capaciteit van FLRT2 te laten zien om gekweekte hippocampale neuronen af te stoten.

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Het algemene doel van de stripe-assay is het beoordelen van het vermogen van specifieke eiwitten, zoals begeleidingsmoleculen, om neuronen aan te trekken of af te stoten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van axonbegeleiding, zoals de wijze waarop neuronen kunnen migreren of hun axonen kunnen uitstrekken als reactie op de externe cellulaire omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal neuronen in een enkel experiment gevisualiseerd kan worden en dat veel groeikegels gelijktijdig geanalyseerd kunnen worden.Kook ter voorbereiding vier tot acht siliconen matrices gedurende vijf minuten in water. Laat ze volledig aan de lucht drogen onder een laminaire flowkast met de gestreepte zijde naar boven. Dit duurt ongeveer een uur.Werk verder onder de zuigkap. Gebruik perslucht of plakband om eventueel stof van de gestreepte zijde van de matrices te verwijderen. Plaats vervolgens elke matrix zorgvuldig in een aparte plastic schaal van zes centimeter, met de gestreepte zijde naar beneden.Druk elke matrix met één vinger stevig aan. Voorkom dat er luchtbellen tussen de matrix en de schaal terechtkomen. Als de matrix niet hecht, herhaal dan het proces.Markeer, zodra ze zijn gehecht, de locatie van de strepen op de onderzijde van de kweekschaal. Bereid de fluorescentiegelabelde recombinante eiwitten voor in PBS. Maak 25 µL voor elke gestreepte schaal.Laat het mengsel 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Laad vervolgens voor elk schaaltje een spuit van 22 gauge met 25 microliters verdund eiwit en injecteer dit via het kleine gaatje aan de zijkant van de matrix. Vermijd het injecteren van luchtbellen in de matrices, aangezien deze de binding van de eiwitten aan de schaaltjes kunnen verstoren.Incubeer de schalen nu gedurende 30 minuten bij 37 °C in een celkweekincubator. Voeg na de incubatie 300 µL PBS toe aan de bovenste gleuf van elke matrix. Aspireer vervolgens de PBS via een klein gaatje aan de zijkant van elke matrix om alle niet-gebonden recombinante eiwitten te verwijderen.Zuig de PBS niet volledig af, omdat de eiwitten anders uitdrogen. Voer deze PBS-spoeling in totaal drie keer uit. Verwijder vervolgens voorzichtig de matrix uit elke schaal.Voeg vervolgens onmiddellijk ongeveer 100 µL gecontroleerd eiwit toe over het gehele gestreepte gebied, zodat er op elke schaal een afwisselende coating ontstaat. Incubeer de schalen daarna 30 minuten bij 37 °C. Ontdooi ondertussen op ijs laminine en PBS tot een concentratie van 20 µg/mL.Was na 30 minuten de schaaltjes drie keer met PBS. Coat vervolgens elk schaaltje met ongeveer 100 µL koude laminine en plaats de schaaltjes nog een uur terug in de incubator. Was de schaaltjes een uur later opnieuw drie keer met PBS.Voeg na de derde wasbeurt ongeveer 150 µL kweekmedium toe aan elke schaal. Incubeer de schalen vervolgens in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot ze opnieuw nodig zijn. Snijd na het euthanaseren van een donor-E15.5 muis de huid en de schedel sagittaal door in de middenlijn van de kop met een chirurgische schaar en schep de hersenen uit met een microspatel.Breng de hersenen zorgvuldig over naar een petrischaal van 60 milliliter die drie milliliter HBSS bevat. Gebruik in de schaal een scalpel om de hemisferen uit te snijden, inclusief de cortex, hippocampus en het striatum. Disseceer vervolgens de hippocampusregio's door de hersenvliezen voorzichtig te verwijderen.Breng de gedissecteerde hippocampusweefsels over naar een centrifugebuis van 15 milliliter met twee milliliter HBSS-oplossing op ijs. Zes hippocampi van drie embryo's zijn voldoende om neuronen op acht schaaltjes te kweken. Wanneer alle hippocampusweefsels zijn verzameld, wordt de HBSS weggezogen en vervangen door twee milliliter trypsine-EDTA.Incubeer de buis vervolgens 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Neutraliseer daarna de trypsine-activiteit door 500 µL foetaal runderserum toe te voegen. Centrifugeer het mengsel vervolgens 5 minuten bij 100 ×g.Verwijder het supernatant en was de pellet met twee milliliters kweekmedium. Centrifugeer het mengsel vervolgens opnieuw en vervang het medium door nieuw medium. Dissocieer het weefsel nu door middel van voorzichtig tritureren met een pipetpunt van één milliliter met een afgesneden tip.Breng de weefsels ongeveer 10 keer op en neer door de tip van de pipet. Gebruik vervolgens een ongesneden tip van één milliliter en herhaal het tritureren om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Isoleer nu de enkelcellen door de suspensie door een cellzeef met een maaswijdte van 80 tot 100 micron te persen.Centrifugeer vervolgens de gefilterde suspensie bij 150 Gs gedurende vijf minuten, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in twee milliliters kweekmedium. Tel de cellen met een hemocytometer en zaai 10.000 neuronen in 150 microliters kweekmedium uit op elke voorbereide stripe-plaat. Breng de suspensie voorzichtig aan zodat het gehele gestreepte gebied bedekt is.Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur gekweekt op strepen van fluorescent gelabeld controle-eiwit FC, of de neuronen werden uitgeplaat op strepen van FLRT2 FC afgewisseld met niet-gelabeld controle-FC. In beide gevallen aggregeerden de neuronen en strekten zij hun axonen uit als bundels. Op de FC-controle waren de neuronen gelijkmatig verdeeld en strekten zij hun axonen uit in willekeurige richtingen. In contrast hiermee vermeden de axonen bij kweek met FLRT2 FC-strepen de groei op de FLRT2 FC-regio's.De uitlopende axonen groeiden dus voornamelijk op de FC-strepen. Bij een hogere vergroting is te zien dat de axonen langs de grens met de FLRT2 FC-strepen groeiden, maar niet doordrongen in het FLRT2-gebied. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gestreept tapijt van de aanbevolen eiwitten maakt en hoe u de attractieve of repulsieve activiteit beoordeelt met behulp van gedissocieerde hippocampale neuronen.Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vijf uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.

stripe-assay-to-study-attractive-or-repulsive-activity-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates an antibody-feeding approach to study the trafficking of glutamate receptors in primary hippocampal neuronal cultures. This approach allows the observation of receptor populations at both the plasma and internal membranes. Discrimination between these subsets is achieved by labeling the receptors before and after membrane permeabilization, using the same primary antibody but secondary antibodies conjugated to different fluorophores.

An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons

This video demonstrates a method to assess protein activity using hippocampal neurons over patterned protein zones. Neurons exhibit repulsion in test protein zones and attachment in control protein zones, highlighting the effects of attractive or repulsive protein activity.

Assessing Attractive or Repulsive Activity of Proteins Using Hippocampal Neurons

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

In dit protocol introduceren we een methode voor het zuiveren van de dendritische filopodia-rijke Fractie van de phagocytische beker-achtige uitsteeksel structuur op gekweekte hippocampal neuronen door gebruik te maken van de specifieke en sterke affiniteit tussen een dendritische filopodial adhesie molecuul, TLCN, en een extracellulaire matrix molecuul, vitronectine.

Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Leer de stripe assay om de aantrekkelijke of afstotende activiteit van axon geleidingsmoleculen te evalueren met gescheiden hippocampusneuronen. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van groeikegels mogelijk.

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Meer video's verkennen