Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Het algemene doel van de stripe-assay is het beoordelen van het vermogen van specifieke eiwitten, zoals begeleidingsmoleculen, om neuronen aan te trekken of af te stoten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van axonbegeleiding, zoals de wijze waarop neuronen kunnen migreren of hun axonen kunnen uitstrekken als reactie op de externe cellulaire omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal neuronen in een enkel experiment gevisualiseerd kan worden en dat veel groeikegels gelijktijdig geanalyseerd kunnen worden.

Kook ter voorbereiding vier tot acht siliconen matrices gedurende vijf minuten in water. Laat ze volledig aan de lucht drogen onder een laminaire flowkast met de gestreepte zijde naar boven. Dit duurt ongeveer een uur.

Werk verder onder de zuigkap. Gebruik perslucht of plakband om eventueel stof van de gestreepte zijde van de matrices te verwijderen. Plaats vervolgens elke matrix zorgvuldig in een aparte plastic schaal van zes centimeter, met de gestreepte zijde naar beneden.

Druk elke matrix met één vinger stevig aan. Voorkom dat er luchtbellen tussen de matrix en de schaal terechtkomen. Als de matrix niet hecht, herhaal dan het proces.

Markeer, zodra ze zijn gehecht, de locatie van de strepen op de onderzijde van de kweekschaal. Bereid de fluorescentiegelabelde recombinante eiwitten voor in PBS. Maak 25 µL voor elke gestreepte schaal.

Laat het mengsel 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Laad vervolgens voor elk schaaltje een spuit van 22 gauge met 25 microliters verdund eiwit en injecteer dit via het kleine gaatje aan de zijkant van de matrix. Vermijd het injecteren van luchtbellen in de matrices, aangezien deze de binding van de eiwitten aan de schaaltjes kunnen verstoren.

Incubeer de schalen nu gedurende 30 minuten bij 37 °C in een celkweekincubator. Voeg na de incubatie 300 µL PBS toe aan de bovenste gleuf van elke matrix. Aspireer vervolgens de PBS via een klein gaatje aan de zijkant van elke matrix om alle niet-gebonden recombinante eiwitten te verwijderen.

Zuig de PBS niet volledig af, omdat de eiwitten anders uitdrogen. Voer deze PBS-spoeling in totaal drie keer uit. Verwijder vervolgens voorzichtig de matrix uit elke schaal.

Voeg vervolgens onmiddellijk ongeveer 100 µL gecontroleerd eiwit toe over het gehele gestreepte gebied, zodat er op elke schaal een afwisselende coating ontstaat. Incubeer de schalen daarna 30 minuten bij 37 °C. Ontdooi ondertussen op ijs laminine en PBS tot een concentratie van 20 µg/mL.

Was na 30 minuten de schaaltjes drie keer met PBS. Coat vervolgens elk schaaltje met ongeveer 100 µL koude laminine en plaats de schaaltjes nog een uur terug in de incubator. Was de schaaltjes een uur later opnieuw drie keer met PBS.

Voeg na de derde wasbeurt ongeveer 150 µL kweekmedium toe aan elke schaal. Incubeer de schalen vervolgens in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot ze opnieuw nodig zijn. Snijd na het euthanaseren van een donor-E15.5 muis de huid en de schedel sagittaal door in de middenlijn van de kop met een chirurgische schaar en schep de hersenen uit met een microspatel.

Breng de hersenen zorgvuldig over naar een petrischaal van 60 milliliter die drie milliliter HBSS bevat. Gebruik in de schaal een scalpel om de hemisferen uit te snijden, inclusief de cortex, hippocampus en het striatum. Disseceer vervolgens de hippocampusregio's door de hersenvliezen voorzichtig te verwijderen.

Breng de gedissecteerde hippocampusweefsels over naar een centrifugebuis van 15 milliliter met twee milliliter HBSS-oplossing op ijs. Zes hippocampi van drie embryo's zijn voldoende om neuronen op acht schaaltjes te kweken. Wanneer alle hippocampusweefsels zijn verzameld, wordt de HBSS weggezogen en vervangen door twee milliliter trypsine-EDTA.

Incubeer de buis vervolgens 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Neutraliseer daarna de trypsine-activiteit door 500 µL foetaal runderserum toe te voegen. Centrifugeer het mengsel vervolgens 5 minuten bij 100 ×g.

Verwijder het supernatant en was de pellet met twee milliliters kweekmedium. Centrifugeer het mengsel vervolgens opnieuw en vervang het medium door nieuw medium. Dissocieer het weefsel nu door middel van voorzichtig tritureren met een pipetpunt van één milliliter met een afgesneden tip.

Breng de weefsels ongeveer 10 keer op en neer door de tip van de pipet. Gebruik vervolgens een ongesneden tip van één milliliter en herhaal het tritureren om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Isoleer nu de enkelcellen door de suspensie door een cellzeef met een maaswijdte van 80 tot 100 micron te persen.

Centrifugeer vervolgens de gefilterde suspensie bij 150 Gs gedurende vijf minuten, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in twee milliliters kweekmedium. Tel de cellen met een hemocytometer en zaai 10.000 neuronen in 150 microliters kweekmedium uit op elke voorbereide stripe-plaat. Breng de suspensie voorzichtig aan zodat het gehele gestreepte gebied bedekt is.

Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur gekweekt op strepen van fluorescent gelabeld controle-eiwit FC, of de neuronen werden uitgeplaat op strepen van FLRT2 FC afgewisseld met niet-gelabeld controle-FC. In beide gevallen aggregeerden de neuronen en strekten zij hun axonen uit als bundels. Op de FC-controle waren de neuronen gelijkmatig verdeeld en strekten zij hun axonen uit in willekeurige richtingen. In contrast hiermee vermeden de axonen bij kweek met FLRT2 FC-strepen de groei op de FLRT2 FC-regio's.

De uitlopende axonen groeiden dus voornamelijk op de FC-strepen. Bij een hogere vergroting is te zien dat de axonen langs de grens met de FLRT2 FC-strepen groeiden, maar niet doordrongen in het FLRT2-gebied. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gestreept tapijt van de aanbevolen eiwitten maakt en hoe u de attractieve of repulsieve activiteit beoordeelt met behulp van gedissocieerde hippocampale neuronen.

Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vijf uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.