Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken

Het algemene doel van deze nieuwe isolatiestrategie is om het aantal nieuwe virusisolaten te vergroten om zo het pan-genoom van deze nieuwe virale familie te bestuderen en hun ecosystemen en potentiële pathogeniciteit voor mensen beter te begrijpen. Deze methode kan cruciale vragen binnen het veld van de virologie beantwoorden en virologen wereldwijd helpen die geïnteresseerd zijn in het prospecteren van reuzenvirussen en in het bijzonder Faustovirussen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verbeteringen laat zien in diverse stadia, zoals het mengsel van antibiotica en antischimmelmiddelen, het nieuwe uithongeringsmedium aangepast voor de amebe en het gebruik van flowcytometrie voor een snellere en gevoeligere detectie van lysis. Nadat vervuilde watermonsters zijn verzameld volgens het tekstprotocol, wordt de gastheercel, V. vermiformis, voorbereid door de ameben toe te voegen aan een kweekfles van 75 vierkante centimeter met 30 milliliters protease-pepton-gistextract-glucose, of PYG-medium, en gedurende 48 uur te incuberen bij 28 °C. Gebruik telkamers om de ameben te tellen en wanneer zij een concentratie van 5 × 10⁵ tot 10⁶ cellen per milliliter bereiken, worden de cellen geoogst door centrifugatie bij 720 ×g gedurende 10 minuten.

Zuig het supernatant af en gebruik 30 milliliters steriele Page's amoebal saline of PAS om het amoebepellet opnieuw te suspenderen. Na het tweede maal spoelen van het pellet, gebruik 30 milliliters uithongeringsmedium, bevattend een antibioticum en een antischimmelmiddel, om de cellen opnieuw te suspenderen tot ongeveer 10^6 amoeben per milliliter. Uithongeringsmedium stelt de amoeben in staat om te overleven zonder încystering of vermenigvuldiging.

Zaai vervolgens 200 µL amoeben in de wells van een 96-well platbodemplaat en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 30 °C. Inoculeer daarna, na het vortexen van de watermonsters gedurende één minuut bij kamertemperatuur, 25 µL van elk monster op de amoebencellen, waarbij twee wells zonder monster als negatieve controles worden gelaten. Om verdamping te voorkomen, wordt de plaat met de primocultuur in een zak met een nat kompres geplaatst, waarna de bevochtigingskamer met de plaat in een incubator bij 30 °C wordt geplaatst.

Subcultiveer drie dagen na de eerste inoculatie de primo-cultuurplaat op een nieuwe 96-wellplaat met amoeben, zoals zojuist gedemonstreerd, zonder microscopische observatie. Incubeer gedurende drie dagen bij 30 °C. Inoculeer vervolgens, met gebruik van de subcultuur, een derde plaat zoals zojuist beschreven en incubeer deze gedurende twee dagen.

Om lysis in de uiteindelijke co-cultuurplaat te detecteren, schakelt u de cytometer in en voert u een reinigings- en spoelcyclus uit volgens het protocol van de fabrikant om de achtergrondruis te verminderen. Om een volledig geautomatiseerde acquisitie van 40 minuten uit te voeren, start u de high throughput sampler of HTS om automatisch monsters uit de 96-wells plaat te laden volgens het protocol van de fabrikant. Programmeer de HTS-instellingen zoals hier vermeld, waaronder een monstervolume van 150 µL, een mengvolume van 50 µL, een mengsnelheid van 180, het aantal mengbeurten op 5, een spoelvolume tussen monsters van 400 µL, een stroomsnelheid van 2,5 µL per seconde en het aantal geregistreerde events op 10.000. Klik op 'home' zodat de HTS de plaat kan lokaliseren. Beoordeel vervolgens eerst de negatieve controle-wells die de gastheer-amoebencellen bevatten, om de amoebenpopulatie te gaten en het celpercentage te bepalen op basis van hun fysieke kenmerken. Zorg voor een homogene amoebenpopulatie en een tweede populatie met minder events die overeenkomt met debris en ruis. Start daarna het gaten door op 'acquire sample' te klikken.

Gebruik vervolgens de pijl, waarmee de gates worden gedefinieerd, om de amoebe-populatie van belang te lokaliseren. Nadat er minimaal 10 000 events zijn gegated, klikt u op run zodat de HTS automatisch de gehele plaat kan verwerken. Voer de data-acquisitie en analyse uit op basis van de grootteparameter forward scatter en de structuurparameter side scatter. Raadpleeg de tekst voor aanvullende details.

Na de detectie van lyse via flowcytometrie, pipetteer de gelyseerde coculturen om de overgebleven amoeben te suspenderen. Nadat 50 µL van elk monster op objectglaasjes is gepipetteerd, wordt de suspensie direct gecytocentrifugeerd bij 800 ×g gedurende 10 minuten.

Gebruik vervolgens pure methanol om de coupes te fixeren en laat ze daarna drogen bij kamertemperatuur. Dompel de coupes na fixatie drie keer gedurende vier seconden in de ESN-oplossing, voordat u de coupes zes seconden in blauw-azuur plaatst. Dompel de coupes tot slot 45 seconden in PBS.

Laat de coupes drogen bij kamertemperatuur voordat u overgaat tot observatie. Om nieuwe gefixeerde coupes met DAPI te kleuren, pipetteert u 15 µL DAPI op de droge coupes. Observeer de coupes onder een lichtmicroscoop bij een vergroting van 1000x om de aanwezigheid van virusfabrieken te controleren.

Breng voor elektronenmicroscopie vijf µL van het positieve monster aan op een glow-discharged grid en laat dit ongeveer 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Droog het grid voorzichtig, voeg vervolgens een kleine hoeveelheid 1% ammoniummolybdaat toe en laat dit 10 seconden incuberen. Verwijder de druppel voorzichtig en laat het grid vijf minuten drogen. Stel vervolgens de elektronenmicroscoop in op 200 keV. Plaats het grid in de houder en breng de houder in de microscoop aan. Klik op het icoon voor het vacuümoverzicht en controleer het vacuüm. Sluit daarna de kleppen en stel een spot size van vijf en een vergroting van 25.000 in voordat u begint met de observatie. Nadat u een reusvirus op het acquisitiescherm heeft gelokaliseerd, gebruikt u de meettool om het virus te meten.

Voer de moleculaire biologie en viraal genoomsequencing uit volgens het tekstprotocol.

Deze figuur toont de resultaten van de detectie van twee Faustovirussen vergeleken met de betrouwbare negatieve controles. De negatieve controle voor lysis bevatte een amoebenpopulatie van 86%. Daarentegen was meer dan 60% van de amoeben gelyseerd, waarbij het hoogste percentage debris werd gevonden in de positieve monsters.

Zoals hier te zien is, kleuren ESN en blue-azur de kernen van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde amoebecellen, en de aanwezigheid van virusfabrieken binnen de geïnfecteerde cellen. DAPI-kleuring bevestigt evenzeens de aanwezigheid van virusfabrieken in de amoeben. Op deze beelden onthult elektronenmicroscopie de aanwezigheid van Faustovirus met het typische uiterlijk van een megavirus, bestaande uit een icosaëdraal kapsid zonder fibrillen en een grootte van 200 nanometers.

Zodra de methode onder de knie is en na de co-cultuur, kan deze techniek voor lysisdetectie en viruskarakterisering in een uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de amoeben te controleren en eventuele waarschijnlijke contaminaties te controleren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals moleculaire biologie gericht op reuzenvirussen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de virusfamilie en/of het genotype.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de virologie om deze virale familie, hun specifieke gastheer en hun potentiële pathogeniteit te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u reusachtige virussen eenvoudig kunt isoleren door het aantal en de typen monsters te vergroten en door de beste gastheercel en de beste kweekcondities te kiezen. Vergeet niet dat het werken met virussen die potentieel pathogeen zijn voor mensen extreem gevaarlijk kan zijn, met name bij rioolmonsters.

Daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in SB2-laboratoria onder beveiligde omstandigheden, bij het uitvoeren van deze procedure.