Name: Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken Vermamoeba vermiformis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer een snelle isolatiestrategie voor nieuwe Faustovirussen uit milieumonsters met Vermamoeba vermiformis. Deze methode verbetert de detectie van virale lysis en helpt virologen reuzenvirussen te prospecteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen erkenningen te maken.

1. Sample Collection <ol><li> Verzamel 70 monsters van verschillende omgevingen en regio&#39;s. In dit geval gebruikt u de volgende: 5 vuil water monsters uit het dorp van Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrijk), 15 monsters van het meer in Parc Borély in Marseille (Frankrijk); 15 zee watermonsters met sediment uit de kreken op Samena in Marseille (Frankrijk), 25 rivierwater monsters van de Alpen (Frankrijk), en ten slotte, 10 monsters van rioolwater in La Ciotat (Frankrijk). </li><li> Vortex monsters vóór homogenisering inoculeren gedurende één minuut bij kamertemperatuur zonder enige behandeling. </li></ol> 2. Isolatie Procedure <ol><li> Host Voorbereiding voor Blind Cultuur Procedures en Sample Inenting <ol><li> Gebruik V. vermiformis (stam cdc19) als Celdrager voor co-cultuur. </li><li> Handhaaf de amoeben bij 28 ° C, in een 75 cm 2 celkweek kolf met 30 ml protease-pepton-gistextract-glucose medium (PYG). Controleer PYG samenstelling in tabel 1. Opmerking: Na 48 uur worden amoeben gekwantificeerd door een normale telling behulp van het tellen slides (bijvoorbeeld Kovaslides). </li><li> Oogst cellen bij een concentratie van 5 x 10 mei-10 juni cellen / ml, en amoeben pellet door centrifugeren bij 720 xg gedurende 10 min. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en resuspendeer de amoeben pellet in 30 ml amoebal zoutoplossing steriele Pagina&#39;s (PAS) Tabel 1. Herhaal deze spoelprocedure. </li><li> Resuspendeer amoeben in 30 ml uitputtingsmedium met een antibioticum en schimmelwerende mengsel bij een concentratie van ongeveer 10 6 amoebe / ml. De honger medium is een survival medium voor de amoebe, waardoor het in leven te blijven zonder encystment of vermenigvuldiging. Check samenstelling in tabel 1. Opmerking: Het antimicrobiële middel mengsel bevatte 10 ug / ml vancomycine, 10 ug / ml imipenem, 20 ug / ml ciprofloxacine, 20 μg / ml doxycycline en 20 ug / ml voriconazol. Deze mix diende om de bacteriële en schimmel besmetting die kan verminderen of veranderen virale vermenigvuldiging te verminderen. </li><li> Direct inoculeren 25 pi van elk monster op de 200 ul amoebe monolaag in een 96-well plaat met vlakke bodem begunstiging amoeben hechting en incubeer bij 30 ° C in een vochtige omgeving (een vochtige omgeving bestaat uit het plaatsen van een natte kompres in de zak met de plaat om verdamping te voorkomen). Dit is de primo-cultuur. Laat twee putjes van amoeben zonder monster enting; Deze fungeert als negatieve controle. Incubeer dit primo-cultuur voor drie dagen. </li><li> Drie dagen na de eerste inoculatie, subcultuur de primo-kweekplaat verse amoeben zoals boven beschreven zonder enige microscopische waarneming. Incubeer de nieuwe plaat voor drie dagen onder dezelfde voorwaarden als de primo-cultuur. </li><li> Voer de uiteindelijke kweek na drie dagen incubatie net als vooe primo- en sub-cultuur. Incubeer de uiteindelijke kweek gedurende twee dagen. Ga dan naar detectie. </li></ol></li><li> Detectie van Lysis door geautomatiseerde flowcytometrie Opmerking: Blind cultuur combinatie met flowcytometrie verschilt van de vorige standaardsysteem van isolatie. Het gevoeliger, nauwkeuriger en geautomatiseerd. Voor detectiedoeleinden, pasten we een nieuwe techniek ontwikkeld om lysis detecteren de hoogste snelheid en zonder microscopische waarneming. Deze techniek is voordelig voor het screenen van monsters en heeft een betere gevoeligheid dan oudere technieken. 7-9 <ol><li> Gebruik de 96-well plaat van de laatste co-cultuur lysis detecteren. </li><li> Schakel de cytometer en uitvoeren van een schoon en spoeling om lagere achtergrondgeluid te verkrijgen volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Start de High Throughput Sampler (HTS) in combinatie met flowcytometer monsters van de 96-well plaat automatisch laden en uitvoeren van een volledig geautomatiseerd verwerving in 40 min according het protocol van de fabrikant. </li><li> Stel de HTS als volgt: monster volume 150 ul, mengen volume 50 pi, het mengen snelheid 180, aantal mixen 5, wassen volume tussen elk monster 400 ul, debiet 2,5 gl / sec, het aantal geregistreerde gebeurtenissen 10.000. </li><li> Beoordeel de negatieve controle wells van de laatste co-cultuur microplaat eerste om poort amoeben populatie en het percentage van deze gastheercellen te bepalen afhankelijk van hun fysieke kenmerken. Zorg ervoor dat u een homogene amoebe bevolking en een tweede populatie van een lagere gebeurtenissen die overeenkomt met puin en lawaai. Opmerking: Deze gating procedure onderscheidt subcellulaire puin en klompen van enkelvoudige cellen op grootte, geschat door voorwaartse verstrooiing. Het is daarom belangrijk om nauwkeurig bepalen van het percentage van elke populatie met de best mogelijke gating procedure. Deze percentages kunnen variëren, vooral als vele soorten protozoa worden gebruikt, dus is het belangrijk altijd een negativ hebbene controle, die kan worden gebruikt als referentiepopulatie voor de rest van de monsters. </li><li> Start de gating door te klikken verwerven monster. </li><li> Noteer het aantal gebeurtenissen ten minste 10.000 gebeurtenissen. </li><li> Lokaliseren amoebe bevolking van belang met behulp van de pijl. Dit is hoe je de poorten te definiëren. </li><li> Na de gating, laat de HTS plaatse of zoek de plaat door te klikken op &#39;Home&#39;, dan is de hele plaat automatisch uitgevoerd. Voer data-acquisitie en analyse op basis van de omvang en structuur parameters (respectievelijk FSC (voorwaartse verstrooiing) en SSC (zijwaartse verstrooiing)). Opmerking: Het detecteren van het verlies van de amoebe-gated bevolking signaleert de aanwezigheid van een pathogeen agens verantwoordelijk voor amoebe lysis. Protozoa lysis geassocieerd met virus infectie gedetecteerd met een willekeurig gemaakt drempel van 50% lysis van de amoebe bevolking afgesloten door de analyzer en vergeleken met dezelfde niet-geïnfecteerde als een betrouwbare negatieve controle. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Karakterisering van de New isolaten na Lysis Detection <ol><li> Voorlopige kleuring om de aanwezigheid van Giant Virussen Reveal <ol><li> Na lysis met behulp van flow cytometrie, pipet de gelyseerde co-culturen naar resterende amoeben opschorten. Vervolgens direct cytocentrifuge 50 pl van de suspensie bij 800 xg gedurende 10 min. </li><li> Na centrifugeren, bevestig de dia&#39;s met een pure methanol oplossing. Vlekken op de dia&#39;s met behulp van een commercieel snelle kleuring van Eosine / blauw Azur en DAPI kleuring en observeren onder een lichtmicroscoop bij 1000x om te controleren op de aanwezigheid van het virus fabrieken. <ol><li> Voor snelle kleuring, dompelen de dia&#39;s in de eerste eosine-oplossing (4 sec driemaal herhaald) leid rechtstreeks dia duik in de tweede fixeeroplossing met blauwe Azur voor 6 seconde, en tenslotte spoel de glaasjes voor 45 sec met een fosfaatbufferoplossing pH 7,2. Laat de dia&#39;s drogen bij kamertemperatuur, ga dan naar observatiop. </li><li> Voor DAPI kleuring, aanbetaling van 15 ul van de DAPI commerciële voorraad oplossing op de vaste droge glijbaan. Beschermen tegen licht ga dan naar waarneming. </li></ol></li></ol></li><li> Elektronenmicroscopie <ol><li> Na de eerste identificatie op de glijbaan, beoordeelt de aanwezigheid van de grote virus via elektronenmicroscopie waarneming supernatant culturen. </li><li> Borg 5 pi van de positieve monster op de gloed ontladen raster. Wacht gedurende ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Droog het rooster aandachtig en borg op het een kleine daling van 1% ammoniummolybdaat gedurende 10 sec. Laat het rooster drogen 5 min. </li><li> Ga verder met elektronenmicroscopie bij 200 keV. </li><li> Plaats het rooster op de houder; invoering van de houder in de microscoop. Controleer het vacuüm overzicht door te klikken op de bijbehorende icoon. Sluit kleppen en beginnen observatie op een plek maat 5, en vergroting van x 25.000. </li><li> Meet de reus virus met behulp van ImageJ of directly op de microscoop met behulp van de maatregel instrument van de microscoop op de overname scherm. Opmerking: Deel het monster in de Faustovirus groep met een capside grootte van ongeveer 200 nm. </li></ol></li><li> Moleculaire biologie Opmerking: Na deze identificatie moleculaire biologie testen waren cruciaal voor de bevestiging om Faustovirus onderscheiden van marseillevirus, die dezelfde capside grootte en het uiterlijk onder elektronenmicroscopie heeft, hoewel zij niet dezelfde gastheerspecificiteit hebben. De marseillevirus kan niet groeien op Vermamoeba, de Faustovirus is specifiek voor Vermamoeba en alle pogingen om het te groeien op andere amoebe, zoals Acanthamoeba hebben gefaald to-date. Het ontwerp en de uitvoering van de specifieke in de werken van Reteno et al vermeld primer / probe-systemen. kon een nauwkeuriger voorlopige classificatie van de nieuw geïsoleerde virussen door middel van amplificatie en sequencing van de virale genen. <ol><li> Extract DNA van de positieve kweekmonsters een geautomatiseerd extractie volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Voer real-time PCR met behulp van een thermocycler zoals beschreven Reteno et al. 19 </li><li> Sequentie met dezelfde primers die werden gebruikt voor amplificatie. Met de primers gericht DNA gerichte RNA polymerase subunit 1 gen: Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA CAT CAC GAT GGT ATA G-3 &#39;(voorwaarts) en 5&#39;-Fstv_S2R TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3&#39; (omgekeerde) met de Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA probe. </li></ol></li></ol> 4. Virus Productie, zuivering en Genome Sequencing <ol><li> Subcultuur de enkel virus amoebe cultuur eindpunt verdunning klonen. </li><li> Voor de productie: bereid 20 kolven met 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis en 5 ml van het geïsoleerde virus reeds overgedragen van putten kleine kolven. </li><li> Incubeer bij 30 ° C tot vollediglysis van de amoebe. Observeer elke dag door omgekeerde optische microscopie totdat alle amoebe worden gelyseerd. </li><li> Na volledige lysis, bundelen alle kolven in een ontvanger. Filter met een 0,45 urn filter om afval te elimineren. </li><li> Start de zuivering door ultracentrifugatie bij 89.800 xg gedurende 75 min. Zorg ervoor dat het gewicht van de buizen te kalibreren voordat centrifugeren. </li><li> Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof van elke buis door aspiratie en resuspendeer de pellet in PAS met hetzelfde volume wordt gebruikt voor de kalibratie, voordat u opnieuw centrifugeren. </li><li> Zoals hierboven, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Zuiver het virus dat wordt geproduceerd met behulp van 25% sucrose (27,5 g sucrose in 100 ml PBS, gefiltreerd over een 0,22 urn filter). <ol><li> Gebruik 8 ml sucrose en 2 ml van de virale suspensie. Centrifugeer bij 89.800 g gedurende 1 uur 15 min. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS. Bewaar bij -80 ° C. </li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Raoult, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+1.2-megabase+genome+sequence+of+Mimivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus.</a> Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Claverie, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+viruses+in+the+oceans%3A+the+4th+Algal+Virus+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop.</a> Virol J. 2, 52-52 (2004).</li>
<li>Monier, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+mimivirus+relatives+are+probably+large+algal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Audio%2C+Transactions+of+the+IRE+Professional+Group+on%22%5BJournal%5D)">Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses.</a> Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).</li>
<li>Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+distribution+of+large+DNA+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea.</a> Genome Biol. , (2008).</li>
<li>Claverie, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimivirus+and+Mimiviridae%3A+Giant+viruses+with+an+increasing+number+of+potential+hosts%2C+including+corals+and+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges.</a> J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).</li>
<li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+megavirome+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence of the megavirome in humans.</a> J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+characterization+of+new+environmental+giant+viruses+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ Microbiol. , (2012).</li>
<li>Pagnier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+improvements+in+mimiviridae+and+marseilleviridae+isolation+from+amoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba.</a> Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+Amoeba+Viruses+with+Genomes+Up+to+2.5+Mb+Reaching+That+of+Parasitic+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> PNAS. , (2014).</li>
<li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Isolation+of+Mimivirus+in+a+Patient+With+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia.</a> Clin Infect Dis. , (2013).</li>
<li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shan+virus%3A+a+new+mimivirus+isolated+from+the+stool+of+a+Tunisian+patient+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia.</a> Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).</li>
<li>Claverie, J. -M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimivirus%3A+the+emerging+paradox+of+quasi-autonomous+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses.</a> Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).</li>
<li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+with+more+than+1%2C000+genes%3A+Mamavirus%2C+a+new+Acanthamoeba+polyphaga+mimivirus+strain%2C+and+reannotation+of+Mimivirus+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes.</a> Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).</li>
<li>Claverie, J. -M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+questions+about+giant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Open questions about giant viruses.</a> Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).</li>
<li>Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li>
<li>Van Etten, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+really%2C+really+big+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Another really, really big virus.</a> Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> J.Virol. , (2015).</li>
<li>Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+free-living+amoebae+from+tap+water+in+Sivas%2C+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey.</a> Biomed res Int. 2013, 675145(2013).</li>
<li>Bradbury, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+recovered+from+human+stool+samples+in+Strongyloides+agar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+microbiol%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture.</a> J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).</li>
<li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li>
<li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li>
<li>Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+virus+infecting+the+novel+shellfish-killing+dinoflagellate+Heterocapsa+circularisquama%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama.</a> Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De mogelijkheid dat Faustovirus het eerste lid van een nieuwe familie Megavirales nabij ASFV kon werd eerst door Reteno et al., 19 maar verschillen nog te onderscheiden. Het lijkt onduidelijk of Faustovirus moet toetreden tot de familie Asfarviridae of dat het in plaats daarvan zou moeten vormen van een nieuw vermeende virale familie. Deze kwestie zal verder onderzoek, in het bijzonder een uitgebreidere karakterisering van de morfologie, gastheer range, replicatiecyclus en gen repertoire vereisen. Me...

De ontdekking van gigantische virussen, in het bijzonder die welke behoren tot de Megavirales orde, compleet veranderde de wereld van virussen in termen van deeltjesgrootte en genoom complexiteit. Virussen werden eerder gedacht kleine entiteiten en de mimivirus bleek alle regels overtreden. 1 Metagenomic gegevens suggereren de alomtegenwoordigheid van grote virussen niet alleen in het milieu, 2-5 maar ook bij mensen. 6 Derhalve bestaat er nog steeds behoefte zoeken naar deze virussen op grote schaal. De diversiteit van deze reusachtige virussen werd bepaald door middel van steekproeven niet alleen een verscheidenheid van het aquatisch milieu en de bijbehorende sedimenten wereldwijd, 7-11, maar ook door het screenen van een verscheidenheid van menselijke monsters 12,13 en milieu monsters. 7,9 de Acanthamoeba polyphaga mimivirus was geïsoleerd door middel van co-cultuur met behulp van fagocytische protisten, voornamelijk Acanthamoeba spp. 14-16 Een hele collectie van reuze virussen waren dan ookgeïsoleerd uit dit gespecificeerde protist gastheer, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap haar onderzoek en isolatie procedure voor Acanthamoeba spp beperken. Dit duidelijk afhankelijkheid van één gastheersoort heeft geleid tot een groot deel virussen het hoofd gezien. Dat de reus virus, CroV, werd geïsoleerd met de zeer beweeglijke Zeewaterprotozoa cafetaria roenbergensis, 17,18 aantoont dat een breder scala van protozoa gebruiken om nieuwe geslachten of families van grote virussen ontdekt. Reteno et al. Heeft andere protozoa als gastheercellen die nooit eerder werd gebruikt selecteren en die de nieuwe Asfar gerelateerde lijn van grote virussen (de nieuwe naam Faustovirus). 19 In een poging om nieuwe Faustovirus genotypes isoleren om de leden van deze virale stam breiden wij onze gemodificeerde isolatieprocedures en gebruikten ze om monsters milieu kunnen oogsten nieuwe Faustoviruses screenen. Wij danbeschreef de gehele protocol bij de nieuwe isolaten karakteriseren. Onderzochten we Vermamoeba vermiformis, de meest voorkomende vrijlevende protist in menselijke omgevingen 20-22 reeds bij het ​​isoleren van de eerste Faustovirus prototype E12. 19 Dit protist is nog steeds gastheerspecifiek voor Faustovirus gebruikt. We wisten dat geen van de bekende reus virussen pathogeen was voor deze amoebe, omdat er geen pogingen groeien andere grote virussen in ons laboratorium toonden amoebe lysis of virale groei. Om deze reden zijn wij van mening dat V. vermiformis is de beste en meest unieke Celdrager bekend om nieuwe Faustoviruses isoleren.

<table><tbody><tr><td>LSR FORTESSA cytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Duitsland&nbsp;</td><td>5027/11</td></tr><tr><td>Optische inversiemicroscoop</td><td>leica&nbsp;</td><td>Frankrijk</td><td>72643</td></tr><tr><td>DNA extractie</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Extractie Robot</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>Frankrijk</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>PYG medium, PAS, Starvation medium</td><td>In house laboratoriumproductie&nbsp;</td><td>Marseille URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba strain CDC-19</td><td>ATCC</td><td>Frankrijk</td><td>50237</td></tr><tr><td>Platen</td><td>Cellstar</td><td>Frankrijk</td><td>655180</td></tr><tr><td>PCR materialen, primers.&nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>Frankrijk</td><td>Primers geciteerd in manuscript</td></tr><tr><td>Glasstic glijbaan 10 met rasters</td><td>Kova&nbsp;</td><td>Verenigde Staten</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Eosin/blauwe Azur-Hemacolor vlek</td><td>Merck milipore&nbsp;</td><td>Frankrijk</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Vacuum aangedreven filters</td><td>Thermo scientific</td><td>Frankrijk</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp;</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>DAPI vlek</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 cytocentrifuge</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>Frankrijk</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Enkele cytologietunnel</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>Frankrijk</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Koolstof rasters&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Ammonium molybdaat</td><td>VWR internationanl&nbsp;</td><td>Frankrijk&nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Flessen&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>Duitsland</td><td>833911</td></tr><tr><td>0.22 &mu;m filters&nbsp;</td><td>Milex millipor&nbsp;</td><td>Frankrijk</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>Frankrijk</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Rapid-flow filters</td><td>Nalgene</td><td>Frankrijk</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; vermamoeba vermiformis</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

De isolatie van reusachtige virussen is van groot belang in dit nieuwe tijdperk van virologie, vooral omdat deze reusachtige virussen worden gerelateerd aan protists. Giant virussen kunnen potentieel pathogene voor vele soorten van protisten zijn. Ze behoren tot de onlangs beschreven volgorde van Megavirales. De nieuwe lijn Faustovirus dat is geïsoleerd uit rioolwater monsters is ver verwant aan de zoogdieren pathogeen virus van Afrikaanse varkenspest. Dit virus is ook specifiek voor de amoebal gastheer, Vermamoeba vermiformis, een protist gebruikelijk in de gezondheidszorg watersystemen. Het is van cruciaal belang om te blijven isoleren van nieuwe Faustovirus genotypes om de genotype collectie te vergroten en te bestuderen zijn pan-genoom. We ontwikkelden nieuwe strategieën voor het isoleren van aanvullende stammen door een beter gebruik van antibiotica en antifungale combinaties om bacteriële en fungale verontreiniging van de amoebe co-kweek te voorkomen en het bevorderen van de virusvermenigvuldiging. We hebben ook geïmplementeerd een nieuw starvation middellange tot V. behouden vermiformis in optimale omstandigheden voor virussen co-cultuur. Uiteindelijk, met flowcytometrie plaats van microscopische waarneming, hetgeen tijdrovend, het cytopathogene effect detecteren. We kregen twee isolaten uit rioolwater monsters waaruit de efficiëntie van deze werkwijze en daarmee de verbreding verzameling Faustoviruses, beter te begrijpen hun omgeving gastheerspecificiteit en genetische inhoud.

Het systeem bestudeerd in dit manuscript gevalideerde zijn proof of concept door het isoleren van twee nieuwe Faustoviruses. Van de geteste 70 monsters werden twee episoden van lysis waargenomen, in tegenstelling tot onze betrouwbare negatieve controles. De negatieve controle voor lysis bevatte een 86% amoebe bevolking. Daarentegen is de positieve monsters (ST1 voor Saint Pierre de Meyzoargues), en (LC9 voor de La Ciotat Sample 9) toonde een dramatische daling in een gesloten amoebae; me...

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Het algemene doel van deze nieuwe isolatiestrategie is om het aantal nieuwe virusisolaten te vergroten om zo het pan-genoom van deze nieuwe virale familie te bestuderen en hun ecosystemen en potentiële pathogeniciteit voor mensen beter te begrijpen. Deze methode kan cruciale vragen binnen het veld van de virologie beantwoorden en virologen wereldwijd helpen die geïnteresseerd zijn in het prospecteren van reuzenvirussen en in het bijzonder Faustovirussen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verbeteringen laat zien in diverse stadia, zoals het mengsel van antibiotica en antischimmelmiddelen, het nieuwe uithongeringsmedium aangepast voor de amebe en het gebruik van flowcytometrie voor een snellere en gevoeligere detectie van lysis. Nadat vervuilde watermonsters zijn verzameld volgens het tekstprotocol, wordt de gastheercel, V. vermiformis, voorbereid door de ameben toe te voegen aan een kweekfles van 75 vierkante centimeter met 30 milliliters protease-pepton-gistextract-glucose, of PYG-medium, en gedurende 48 uur te incuberen bij 28 °C. Gebruik telkamers om de ameben te tellen en wanneer zij een concentratie van 5 × 10⁵ tot 10⁶ cellen per milliliter bereiken, worden de cellen geoogst door centrifugatie bij 720 ×g gedurende 10 minuten.Zuig het supernatant af en gebruik 30 milliliters steriele Page's amoebal saline of PAS om het amoebepellet opnieuw te suspenderen. Na het tweede maal spoelen van het pellet, gebruik 30 milliliters uithongeringsmedium, bevattend een antibioticum en een antischimmelmiddel, om de cellen opnieuw te suspenderen tot ongeveer 10^6 amoeben per milliliter. Uithongeringsmedium stelt de amoeben in staat om te overleven zonder încystering of vermenigvuldiging.Zaai vervolgens 200 µL amoeben in de wells van een 96-well platbodemplaat en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 30 °C. Inoculeer daarna, na het vortexen van de watermonsters gedurende één minuut bij kamertemperatuur, 25 µL van elk monster op de amoebencellen, waarbij twee wells zonder monster als negatieve controles worden gelaten. Om verdamping te voorkomen, wordt de plaat met de primocultuur in een zak met een nat kompres geplaatst, waarna de bevochtigingskamer met de plaat in een incubator bij 30 °C wordt geplaatst.Subcultiveer drie dagen na de eerste inoculatie de primo-cultuurplaat op een nieuwe 96-wellplaat met amoeben, zoals zojuist gedemonstreerd, zonder microscopische observatie. Incubeer gedurende drie dagen bij 30 °C. Inoculeer vervolgens, met gebruik van de subcultuur, een derde plaat zoals zojuist beschreven en incubeer deze gedurende twee dagen.Om lysis in de uiteindelijke co-cultuurplaat te detecteren, schakelt u de cytometer in en voert u een reinigings- en spoelcyclus uit volgens het protocol van de fabrikant om de achtergrondruis te verminderen. Om een volledig geautomatiseerde acquisitie van 40 minuten uit te voeren, start u de high throughput sampler of HTS om automatisch monsters uit de 96-wells plaat te laden volgens het protocol van de fabrikant. Programmeer de HTS-instellingen zoals hier vermeld, waaronder een monstervolume van 150 µL, een mengvolume van 50 µL, een mengsnelheid van 180, het aantal mengbeurten op 5, een spoelvolume tussen monsters van 400 µL, een stroomsnelheid van 2,5 µL per seconde en het aantal geregistreerde events op 10.000. Klik op 'home' zodat de HTS de plaat kan lokaliseren. Beoordeel vervolgens eerst de negatieve controle-wells die de gastheer-amoebencellen bevatten, om de amoebenpopulatie te gaten en het celpercentage te bepalen op basis van hun fysieke kenmerken. Zorg voor een homogene amoebenpopulatie en een tweede populatie met minder events die overeenkomt met debris en ruis. Start daarna het gaten door op 'acquire sample' te klikken.Gebruik vervolgens de pijl, waarmee de gates worden gedefinieerd, om de amoebe-populatie van belang te lokaliseren. Nadat er minimaal 10 000 events zijn gegated, klikt u op run zodat de HTS automatisch de gehele plaat kan verwerken. Voer de data-acquisitie en analyse uit op basis van de grootteparameter forward scatter en de structuurparameter side scatter. Raadpleeg de tekst voor aanvullende details.Na de detectie van lyse via flowcytometrie, pipetteer de gelyseerde coculturen om de overgebleven amoeben te suspenderen. Nadat 50 µL van elk monster op objectglaasjes is gepipetteerd, wordt de suspensie direct gecytocentrifugeerd bij 800 ×g gedurende 10 minuten.Gebruik vervolgens pure methanol om de coupes te fixeren en laat ze daarna drogen bij kamertemperatuur. Dompel de coupes na fixatie drie keer gedurende vier seconden in de ESN-oplossing, voordat u de coupes zes seconden in blauw-azuur plaatst. Dompel de coupes tot slot 45 seconden in PBS.Laat de coupes drogen bij kamertemperatuur voordat u overgaat tot observatie. Om nieuwe gefixeerde coupes met DAPI te kleuren, pipetteert u 15 µL DAPI op de droge coupes. Observeer de coupes onder een lichtmicroscoop bij een vergroting van 1000x om de aanwezigheid van virusfabrieken te controleren.Breng voor elektronenmicroscopie vijf µL van het positieve monster aan op een glow-discharged grid en laat dit ongeveer 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Droog het grid voorzichtig, voeg vervolgens een kleine hoeveelheid 1% ammoniummolybdaat toe en laat dit 10 seconden incuberen. Verwijder de druppel voorzichtig en laat het grid vijf minuten drogen. Stel vervolgens de elektronenmicroscoop in op 200 keV. Plaats het grid in de houder en breng de houder in de microscoop aan. Klik op het icoon voor het vacuümoverzicht en controleer het vacuüm. Sluit daarna de kleppen en stel een spot size van vijf en een vergroting van 25.000 in voordat u begint met de observatie. Nadat u een reusvirus op het acquisitiescherm heeft gelokaliseerd, gebruikt u de meettool om het virus te meten.Voer de moleculaire biologie en viraal genoomsequencing uit volgens het tekstprotocol.Deze figuur toont de resultaten van de detectie van twee Faustovirussen vergeleken met de betrouwbare negatieve controles. De negatieve controle voor lysis bevatte een amoebenpopulatie van 86%. Daarentegen was meer dan 60% van de amoeben gelyseerd, waarbij het hoogste percentage debris werd gevonden in de positieve monsters.Zoals hier te zien is, kleuren ESN en blue-azur de kernen van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde amoebecellen, en de aanwezigheid van virusfabrieken binnen de geïnfecteerde cellen. DAPI-kleuring bevestigt evenzeens de aanwezigheid van virusfabrieken in de amoeben. Op deze beelden onthult elektronenmicroscopie de aanwezigheid van Faustovirus met het typische uiterlijk van een megavirus, bestaande uit een icosaëdraal kapsid zonder fibrillen en een grootte van 200 nanometers.Zodra de methode onder de knie is en na de co-cultuur, kan deze techniek voor lysisdetectie en viruskarakterisering in een uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de amoeben te controleren en eventuele waarschijnlijke contaminaties te controleren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals moleculaire biologie gericht op reuzenvirussen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de virusfamilie en/of het genotype.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de virologie om deze virale familie, hun specifieke gastheer en hun potentiële pathogeniteit te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u reusachtige virussen eenvoudig kunt isoleren door het aantal en de typen monsters te vergroten en door de beste gastheercel en de beste kweekcondities te kiezen. Vergeet niet dat het werken met virussen die potentieel pathogeen zijn voor mensen extreem gevaarlijk kan zijn, met name bij rioolmonsters.Daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in SB2-laboratoria onder beveiligde omstandigheden, bij het uitvoeren van deze procedure.

a-rapid-strategy-for-isolation-new-faustoviruses-from-environmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Amoebal coculture is een celcultuur systeem met aanhangend amoeben om selectief te groeien intracellulaire pathogenen kunnen fagocytcellen zoals amoeben en macrofagen weerstaan. Het vormt dus een belangrijk instrument om nieuwe infectieuze agentia te ontdekken. Amoebal verrijking laat ontdekking van nieuwe amoebal soorten en hun specifieke intracellulaire bacteriën.

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Dit protocol schetst een methode voor het efficiënt extraheren van levende nematoden uit natuurlijke substraten in het veld.

Snelle isolatie van wilde nematoden door Baermann Funnel

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

Leer een snelle isolatiestrategie voor nieuwe Faustovirussen uit milieumonsters met Vermamoeba vermiformis. Deze methode verbetert de detectie van virale lysis en helpt virologen reuzenvirussen te prospecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken

Meer video's verkennen