Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur
June 16th, 2016
Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.
Het algemene doel van dit protocol is om de fabricage en werking van een microfluïdische chip te demonstreren, die een efficiënte isolatie en cultivatie van enkele cellen mogelijk maakt. Deze methode biedt een nuttig hulpmiddel voor elk gebied dat zou kunnen profiteren van de isolatie en cultivatie van enkele cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer efficiënt is in het laden van enkele cellen in grote microputjes.
Bovendien worden alleen een zachte stroom en de zwaartekracht gebruikt om het apparaat te bedienen, wat de celschade minimaliseert. De implicatie van deze techniek is gericht op de uiteindelijke diagnose van menselijke ziekten zoals kanker, waarbij cellulaire heterogeniteit de respons van de cel beïnvloedt, dus we kwamen op het idee om deze methode te ontwikkelen toen we een microputje cellijn aan het opzetten waren, omdat de methode van beperkte verdunning erg tijdrovend en inefficiënt was. Nu kan deze methode inzicht bieden in individuele celanalyse.
Het kan ook worden toegepast op andere toepassingen zoals de vestiging van en de tijdsgebondenheid van observatie van het verloop en gedrag van individuele cellen. Om te beginnen, fabriceer gesiliciseerde mastervormen voor zowel de laag voor enkele celisolatie als de microputje cultuurlaag, met behulp van standaard fotolitografie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Combineer voor elke mastervorm 16 gram PDMS-basis met 1,6 gram van een verhardingsmiddel in een wegwerpbeker en roer de mengsels tot ze zijn gecombineerd.
Plaats vervolgens de mastervormen in 150 millimeter petrischalen en giet het PDMS op de vormen. Plaats de petrischalen in een droogkolom en breng gedurende een uur een vacuüm aan om luchtbellen uit het PDMS te verwijderen. Verwijder na een uur de schalen uit de droogkolom en plaats ze gedurende drie tot zes uur in een conventionele oven op 65 graden Celsius om het PDMS te verharden.
Verwijder vervolgens de schalen uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra het afgekoeld is, pel de uitgeharde PDMS-opvangputje-array en microputje-cultuurarray van de mastervormen en knip de apparaten uit met een scheermesje. Gebruik vervolgens een 0,75 millimeter pons om een gat aan elk uiteinde van het microkanaal op de opvangputje-arraylaag te maken.
Gebruik tape om te reinigen wat de binnenoppervlakte van het apparaat zal worden en plaats vervolgens de afzonderlijke lagen met de binnenoppervlakken naar boven in een plasmareiniger voor een korte zuurstofplasmabehandeling. Wanneer u klaar bent, verwijdert u de PDMS-lagen uit de plasmareiniger en gebruikt u een stereomicroscoop om de boven- en onderlagen van het apparaat uit te lijnen en te verbinden. Plaats het uitgelijnde apparaat gedurende 24 uur in een oven op 65 graden Celsius om een permanente binding tussen de PDMS-lagen te creëren.
Plaats vervolgens het gebonden PDMS-apparaat in gedeïoniseerd water en plaats de container in een droogkolom onder vacuüm gedurende 15 minuten om de lucht uit het microkanaal van het apparaat te verwijderen. Nadat alle lucht uit het apparaat is verwijderd, plaatst u het PDMS-apparaat in een weefselcultuurkap en gebruikt u UV-licht om het oppervlak van het apparaat gedurende 30 minuten te steriliseren. Vervang vervolgens het gedeïoniseerd water in het apparaat door 5% bovien serumalbumine in PBS en incubeer het apparaat gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius.
Dit zal het oppervlak blokkeren en de overdrachtsefficiëntie van geïsoleerde cellen van opvangputjes naar de kweekputjes verbeteren. Vervang na 30 minuten de blokkeringsoplossing in het apparaat door steriel PBS. Bereid een enkele celsuspensie voor met 2,5 miljoen cellen per milliliter en laad een pipet met 50 microliter van de suspensie.
Breng vervolgens de cellen over in het apparaat via het uitlaatgat van het apparaat. Laad nogmaals 50 microliter van de celsuspensie en breng deze over in het apparaat via het inlaatgat om het hele microkanaal gelijkmatig te vullen met cellen. Zodra geladen, gebruikt u een steriele plug gemaakt van een millimeter diameter nylon vislijn om het uitlaatgat van het apparaat te verzegelen.
Vul vervolgens een ene milliliter steriele spuit met kweekmedium, verwijder eventuele resterende luchtbellen en plaats deze in de spuitpomp. Verbind een 23 gauge stompe naald met de spuit en gebruik polytetrafluorethyleen slang om de naald te verbinden met de inlaat van het apparaat. Nadat de slang is aangesloten, verwijdert u de plug van het uitlaatgat en wacht u twee minuten terwijl de cellen zich in de enkele cel opvangputjes nestelen door zwaartekracht.
Stel vervolgens de spuitpomp in op 600 microliter per minuut. Verwijder de uitlaatplug en spoel de niet-opgevangen cellen gedurende 30 seconden weg. Wacht twee minuten tot de druk is gestabiliseerd.
Verwijder vervolgens de slang uit de inlaat van het apparaat en verzegel zowel de inlaat- als uitlaatgaten met pluggen om een gesloten kweeksysteem te vormen. Draai vervolgens het apparaat met de hand om de gevangen enkele cellen over te brengen naar de kweekmicroputjes aan de andere kant van het apparaat. Plaats vervolgens het apparaat in een 100 millimeter weefselkweekschaal, voeg 10 milliliter gesteriliseerd PBS rond het apparaat toe en plaats de schaal in een incubator.
Om het kweekmedium te vervangen, plaatst u eerst twee druppels kweekmedium bovenop het PDMS-apparaat nabij de inlaat en uitlaat om te voorkomen dat luchtbellen in het microkanaal terechtkomen. Gebruik vervolgens een 0,75 millimeter biopsieponser om twee gaten te ponsen vanaf de bovenkant van het PDMS-apparaat nabij de uiteinden van het microkanaal. Zorg ervoor dat u alleen door de bovenste laag van het apparaat ponst.
Vervolgens vult u een ene milliliter plastic spuit gevuld met vers voorverwarmd medium en gebruikt u een 23 gauge stompe naald en PTFE-slang om deze te verbinden met de nieuw gecreëerde inlaatpoort. Laat langzaam ongeveer 120 microliter vers
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont de fabricage en werking van een microfluïdische chip die is ontworpen voor hoogwaardige isolatie en kweek van enkele cellen. Het minimaliseert celschade door gebruik te maken van zachte stroming en zwaartekracht.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Celkweek
- Eencelligse analyse
Achtergrond
- Isolatie van enkele cellen is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit.
- Traditionele methoden zoals limietverdunning zijn tijdrovend en inefficiënt.
- Deze microfluïdische aanpak verbetert de efficiëntie bij het laden van enkele cellen.
- Toepassingen strekken zich uit tot ziektediagnose, inclusief kanker.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor efficiënte isolatie en kweek van enkele cellen.
- Om inzichten te bieden in individuele celanalyse.
- Om het begrip van cellulaire reacties in heterogene populaties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een microfluïdische chip.
- Gebruik van microwell-arrays voor celladen.
- Toepassing van zachte stroming en zwaartekracht.
- Langdurige klonale kweek van geïsoleerde cellen.
Belangrijkste resultaten
- Hoge efficiëntie in het isoleren van enkele cellen.
- Geminimaliseerde celschade tijdens het isolatieproces.
- Succesvolle langdurige kweek van enkele cellen.
- Mogelijke toepassingen in kankerdiagnose en -onderzoek.
Conclusies
- Het microfluïdische platform is een waardevol hulpmiddel voor enkele celstudies.
- Deze methode kan het onderzoek naar cellulaire heterogeniteit aanzienlijk verbeteren.
- Het opent nieuwe wegen voor het begrijpen van ziektemechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform addresses a critical bottleneck in single-cell analysis by enabling high-efficiency isolation and long-term culture without compromising cell viability. By reducing reliance on labor-intensive limit dilution methods, it accelerates hypothesis testing in target validation and phenotypic screening workflows. The system supports mechanistic de-risking through clonal expansion and heterogeneity assessment, directly informing go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating single cells for functional validation.
- Operational Value: Reduces time and reagent consumption compared to traditional clonal derivation methods.
- Predictive Confidence: Supports portfolio triage by quantifying clonal heterogeneity in disease-relevant cell lines.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible clonal populations for downstream compound screening.
- Scalability: Microwell array design allows parallel processing of hundreds of single cells per run.
- Quantitative Output: Enables measurement of growth kinetics and differentiation potential as assay endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Maintains phenotypic fidelity of KT98 neural stem and cancer cells over 7-day culture.
- Translational Biomarker Alignment: Links single-cell behavior to population-level responses in heterogeneous cultures.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies subpopulations with differential growth or survival profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of clonal cells for target engagement and phenotypic assays, bridging isolation to functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled single-cell culture and lineage tracking.
- Screening: Delivers assay-ready clonal populations with minimal variability.
- Analytics: Enables quantification of clonal expansion and heterogeneity as key phenotypic readouts.
- Translational Research: Connects single-cell behavior to bulk population responses in disease models.
- Enterprise Reuse: Fabrication process allows replication across projects and cell types without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation by reducing clonal bias and artifacts.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by decreasing time-to-clone and increasing success rates.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on clonal response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to plasma bonding equipment and precision fluidic connectors.
- Necessitates standardization of cell suspension preparation and loading protocols.
- Adaptation to primary cells may require optimization of microwell dimensions and surface chemistry.
- Long-term culture success depends on medium exchange frequency and bubble prevention.
