Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Het algemene doel van dit protocol is om de fabricage en werking van een microfluidische chip te demonstreren, die hoogefficiënte isolatie en cultuur van enkelcellen mogelijk maakt. Deze methode biedt een nuttig instrument voor elk vakgebied dat baat heeft bij de isolatie en cultuur van enkelcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie bij het laden van enkelcellen in grote microwell-arrays.

Bovendien worden alleen een zachte stroom en de zwaartekracht gebruikt om het apparaat te bedienen, waardoor celbeschadiging wordt geminimaliseerd. De implicatie van deze techniek is gericht op de einddiagnose van menselijke ziekten zoals kanker, waarbij cellulaire heterogeniteit de respons van de cel beïnvloedt. We kwamen op het idee om deze methode te ontwikkelen tijdens het opzetten van een microwell-cellijn, omdat de methode van limiterende verdunning zeer tijdrovend en inefficiënt was. Deze methode kan nu inzicht bieden in de analyse van individuele cellen.

Het kan ook worden toegepast voor andere toepassingen, zoals het vaststellen van en de tijdsduur van de observatie van het verloop en gedrag van individuele cellen. Begin met het vervaardigen van gesilaniseerde mastermallen voor zowel de isolatielaag voor enkelvoudige cellen als de microwell-cultuurlayer, met behulp van standaard fotolithografie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Combineer voor elke mastermal 16 gram PDMS-basis met 1,6 gram hardingsmiddel in een wegwerpbeker en roer de mengsels totdat ze volledig zijn gecombineerd.

Plaats vervolgens de mastermallen in petrischalen van 150 millimeter en giet het PDMS bovenop de mallen. Plaats de petrischalen in een vacuümexsikkaator en pas gedurende één uur een vacuüm toe om luchtbellen uit het PDMS te verwijderen. Haal de schalen na één uur uit de vacuümexsikkaator en plaats ze gedurende drie tot zes uur in een conventionele oven bij 65 graden Celsius om het PDMS te uitharden.

Verwijder vervolgens de schaaltjes uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Pel, zodra ze zijn afgekoeld, de uitgeharde PDMS-capture-well array en de microwell-cultuurarray van de mastermallen en snijd de apparaten uit met een scheermesje. Gebruik daarna een pons van 0,75 millimeter om aan beide uiteinden van het microkanaal op de capture-well array-laag één gat te maken.

Gebruik plakband om het toekomstige binnenoppervlak van het apparaat te reinigen en plaats vervolgens de afzonderlijke lagen, met de binnenoppervlakken naar boven gericht, in een plasmareiniger voor een korte zuurstofplasmabehandeling. Verwijder na afloop de PDMS-lagen uit de plasmareiniger en gebruik een stereomicroscoop om de boven- en onderlagen van het apparaat uit te lijnen en te verbinden. Plaats het uitgelijnde apparaat gedurende 24 uur in een oven op 65 °C om een permanente binding tussen de PDMS-lagen te creëren.

Plaats vervolgens het verbonden PDMS-apparaat in gedeïoniseerd water en zet de container gedurende 15 minuten in een vacuümdessicator om de lucht uit het microkanaal van het apparaat te verwijderen. Wanneer alle lucht uit het apparaat is verwijderd, plaatst u het PDMS-apparaat in een weefkulturkap en gebruikt u UV-licht om het oppervlak van het apparaat 30 minuten lang te steriliseren. Vervang vervolgens het gedeïoniseerde water in het apparaat door 5% bovine serumalbumine in PBS en incubeer het apparaat 30 minuten lang bij 37 graden Celsius.

Dit zal het oppervlak blokkeren en de overdrachtsefficiëntie van geïsoleerde cellen van de vangstputjes naar de kweekputjes verbeteren. Vervang na 30 minuten de blokkeringsoplossing in het apparaat door steriele PBS. Bereid een enkelcel-suspensie voor met 2,5 miljoen cellen per milliliter en vul een pipet met 50 microliters van de suspensie.

Breng vervolgens de cellen via het uitlaatgat van het apparaat over in het apparaat. Voeg nog eens 50 µL van de celsuspensie toe en breng deze via het inlaatgat over in het apparaat om het gehele microkanaal gelijkmatig met cellen te vullen. Nadat de cellen zijn geladen, wordt het uitlaatgat van het apparaat afgedicht met een steriele plug gemaakt van nylon vislijn met een diameter van één millimeter.

Vul vervolgens een steriele spuit van één milliliter met cultuurmedium, verwijder eventuele resterende luchtbellen en plaats deze in de spuitpomp. Bevestig een stompe naald van 23 gauge aan de spuit en gebruik polytetrafluoroethyleen-slangen om de naald met de inlaat van het apparaat te verbinden. Verwijder na het aansluiten van de slang de plug uit het uitlaatgat en wacht twee minuten terwijl de cellen door zwaartekracht in de capture-wells voor enkelvoudige cellen bezinken.

Stel vervolgens de spuitpomp in op 600 µL per minuut. Verwijder de uitlaatplug en spoel de niet-gevangen cellen gedurende 30 seconden weg. Wacht twee minuten tot de druk is gestabiliseerd.

Verwijder vervolgens de buis uit de inlaat van het apparaat en sluit zowel de inlaat- als uitlaatopeningen af met pluggen om een gesloten cultuursysteem te vormen. Keer het apparaat nu handmatig om om de gevangen individuele cellen over te brengen naar de cultuur-microwells aan de andere zijde van het apparaat. Plaats het apparaat vervolgens in een weefselkweekschaal van 100 millimeter, voeg 10 milliliter gesteriliseerd PBS rondom het apparaat toe en plaats de schaal in een incubator.

Om het cultuurmedium te vervangen, plaatst u eerst twee druppels cultuurmedium bovenop het PDMS-apparaat nabij de in- en uitlaat om te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal terechtkomen. Gebruik vervolgens een biopsietpons van 0,75 millimeter om twee gaten te ponsen vanuit de bovenkant van het PDMS-apparaat nabij de uiteinden van het microkanaal. Zorg ervoor dat u alleen door de bovenste laag van het apparaat ponst.

Vul vervolgens een plastic spuit van één milliliter met vers voorverwarmd medium en gebruik een stompe naald van 23 gauge en PTFE-slangen om deze met de nieuw gemaakte inlaatpoort te verbinden. Laat gedurende vijf minuten langzaam ongeveer 120 microliter vers medium in het apparaat stromen om het oude medium te vervangen. Seal na afloop de inlaat- en uitlaatpoorten met twee pluggen en plaats het apparaat terug in de celkweekincubator.

Het aantal cellen dat in de opvangputjes terechtkomt varieert van ongeveer 68% tot 85%, afhankelijk van het celtype. Daarnaast bevatten de meeste opvangputjes slechts één enkele cel voor alle drie de celtypen. Na de overdracht van de opgevangen KT98-cellen naar de kweekputjes bevatten ongeveer 77% van de putjes slechts één enkele cel, 16% bevatte geen cellen, 6% bevatte twee cellen en minder dan 1% van de putjes bevatte drie of meer cellen.

Gedurende zeven dagen vertoonden geïsoleerde enkelcellen heterogene groeipatronen. Terwijl sommige cellen zich vermenigvuldigden, deden andere dat niet. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer 20 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u dit high-throughput platform voor endocrinale kweek met isolatie van enkelvoudige cellen kunt gebruiken om de productiviteit van uw experimenten met enkelvoudige cellen te verhogen. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal terechtkomen en dat cellen na verloop van tijd gaan aggregeren.