Name: Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe je een microfluïdische chip fabriceert en bedient voor efficiënte single-cell isolatie en cultuur met behulp van zachte stroming en zwaartekracht. Deze methode minimaliseert celschade en opent nieuwe mogelijkheden voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Opmerking: De fotomasker ontwerpen voor onze microfluïdische apparaat fabricage werden getekend door het gebruik van een computer-aided design (CAD) software. De ontwerpen werden vervolgens gebruikt om chroom fotomaskers met behulp van een commerciële dienst te fabriceren. De PDMS-apparaten werden gemaakt met behulp van zachte lithografie technieken. 11 1. Fabricage van Master Molds door Lithography <ol><li> Voordat het fotolithografieproces 12 Gebruik de 4-inch silicium wafers als een substraat en drogen van de wafels in een conventionele oven bij 120 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Reinig de gedehydrateerde silicium wafers met zuurstofplasma behandeling bij 100 watt gedurende 30 seconden in een plasma schoner. </li><li> Verwarm twee kookplaten bij 65 ° C en 95 ° C respectievelijk, de volgende bakproces. </li><li> Coat 5 g negatieve fotoresist (PR) op de gereinigde silicium wafers door een spin coater; centrifugeren op 1200 rpm (SU-8 50) gedurende 30 seconden op het microkanaal laag produceren. </li><li> Plaats de PRgecoate wafer op een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 12 minuten en overgebracht naar een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 95 ° C gedurende 33 min (bij 100 urn dik patronen) om een ​​zacht bakproces voeren. </li><li> Na het bakken, plaatst u de PR gecoat silicium wafer op de houder van een semi-automatische masker aligner en lijn het een 25.400 dpi resolutie transparantie fotomasker. </li><li> Blootstellen PR beklede siliciumwafel aan UV-licht (365 nm) bij een dosis van 500 mJ / cm2 aan de PR patroon op de siliciumwafel te maken. </li><li> Verwijder de wafer uit de aligner en plaats deze op een kookplaat voor post-bakken bij 95 ° C gedurende 12 min. </li><li> Week de wafers in SU-8 ontwikkelaaroplossing (propyleenglycolmonomethyletheracetaat, PGMEA) te wassen verknoopte PR 12 min en voorzichtig droog met stikstofgas om de uitlijnmerktekens bloot. </li><li> Nogmaals, jas 5 g van de negatieve fotolak op de wafers door een spin coater; centrifugeren op 700 rpm (SU-8 100) voor 30 sec en 1200 rpm (SU-8 10) gedurende 30 seconden voor 300 &amp;# 181; m dik patroon en 27 micrometer dik patroon respectievelijk de microwell laag te maken. </li><li> Plaats de PR beklede wafer op een verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 4 minuten en bij 95 ° C gedurende 8 minuten (bij 27 urn deep capture-gat laag); en bij 65 ° C gedurende 40 min en bij 95 ° C gedurende 110 min (bij 300 um diepe kweek-gat laag). </li><li> Na afkoeling zet de PR beklede siliciumwafel op de mask aligner met UV licht. </li><li> Blootstellen PR beklede siliciumwafel het UV-licht (365 nm) bij een dosis van 250 mJ / cm2 (bij 27 pm dik patroon) en 700 mJ / cm2 (bij 300 urn dik patroon). </li><li> Bak de plakken bij 95 ° C gedurende 5 min (27 urn dik patroon) en 30 min (300 urn dik patroon), respectievelijk. </li><li> Wegwassen verknoopte PR door de PGMEA gedurende 6 min (27 urn dik patroon) en 25 min (300 urn dik patroon), respectievelijk, en vervolgens drogen met stikstofgas. </li><li> Meet de hoogte van het patroon is voorzien opde wafer met een aftastende laser profilometer door het plaatsen van de wafer op het xy-fase van een scanning laser profilometer. <ol><li> Pas de focal plane om duidelijk te laten zien het patroon is voorzien op de wafer met behulp van de &quot;camera view&quot; observatie mode onder een 20X objectief. </li><li> Schakel de observatie-modus van &quot;camera view&quot; naar &quot;laser view&quot;, en stel de bovenste en onderste posities van de functies. </li><li> Stel de meetmodus, ruimte, kwaliteit en z-pitch tot transparante (top), 1 lijn (1024 x 1), hoge nauwkeurigheid en 0,5 urn, respectievelijk, en druk vervolgens op de start bodem om de meting te beginnen. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de PDMS Inrichtingen voor het Single-cell Isolation <ol><li> Voordat PDMS casting, silaniseren de meester mallen met trichloorsilaan tot een hydrofoob oppervlak, waardoor het makkelijker te pellen van de PDMS replica&#39;s van de master mallen maken. <ol><li> Plaats de master mallen en een weging boot met200 pl van trichloorsilaan in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 15 min. </li><li> Stop de stofzuiger en laat de master mallen in de exsiccator tot de meester schimmels bij kamertemperatuur silaniseren gedurende tenminste 1 uur. </li><li> Verwijder de master mallen uit de exsiccator en leg elke master schimmel in een 10 cm petrischaal. </li></ol></li><li> Meng een totale hoeveelheid van 17,6 g PDMS polymeer kit met een base en een hardingsmiddel in een verhouding van 10: 1, en giet het PDMS op de master schimmel in de petrischaal. </li><li> Plaats de petrischaal in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen in het PDMS. </li><li> Verwijder de petrischaal uit de exsiccator en plaats deze in een conventionele oven op 65 ° C gedurende 3-6 uur naar het PDMS te genezen. </li><li> Verwijder de uitgeharde PDMS replica van de master mallen en punch twee gaten als een inlaat en een uitlaat aan beide uiteinden van het microkanaal op het capture-reeks van holtes PDMS replica van een perforatie met inwendige diameter van 0.75 mm voor de vloeibare kanaal (Figuur 2A). </li><li> Gebruik tape om het oppervlak van het PDMS replica&#39;s schoon te maken, en plaats dan de PDMS replica&#39;s in een plasma reiniger voor kort zuurstof plasma behandeling (100 watt voor 14 sec). </li><li> Verwijder de PDMS replica van het zuurstofplasma machine. </li><li> Lijn een top (met de capture microwells) en een bodem PDMS (met de cultuur microwells) replica met de hand onder een stereomicroscoop en brengen hen in contact. </li><li> Plaats de uitgelijnde PDMS replica in een oven bij 65 ° C gedurende 24 uur permanente hechting tussen de PDMS replica bereiken de uiteindelijke inrichting te vormen. </li><li> Week de PDMS apparaat in een gedeïoniseerd (DI) -water gevulde container en de container te plaatsen in een exsiccator onder vacuüm (-85 kPa) gedurende 15 min om lucht uit de microkanaal van de PDMS apparaat te verwijderen. </li><li> Plaats de DI-water gevulde PDMS inrichting in een weefselkweek kap en gebruik UV-licht (golflengte van licht: 254 nm) te steriliseren van de inrichting voor 30 min. </li><li> Vervang de DI water in het PDMS apparaat met een 5% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min ter voorkoming cellen plakken aan de PDMS oppervlak. Opmerking: De BSA coating is van cruciaal belang voor de overdracht efficiëntie van de geïsoleerde cellen uit het verbeteren van capture-well cultuur-goed. </li><li> Vervang de 5% BSA oplossing in de PDMS apparaat met gesteriliseerd 1x PBS oplossing. </li></ol> 3. Voorbereiding van de Single-cell Suspension <ol><li> Cultuur neurale stamcel KT98 en humane carcinoma cellen A549 en MDA-MB-435 we petrischaal in conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid) om cellen te bereiden op het PDMS inrichting celexperiment . </li><li> Verwijder de verbruikte kweekmedium (DMEM basaal medium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica meegeleverd) om de kweekschaal met cellen gekweekt tot 70-80% confluentie. </li><li> Voorzichtig te wassen van de cellen met gesteriliseerde PBS driemaal. &lt;/ Li&gt; <li> Verwijder de PBS en voeg 2 ml van een recombinant enzym mengsel met proteolytische, collagenolytisch en DNase activiteiten (zie de materialen lijst voor gedetailleerde informatie). </li><li> Incubeer de cultuur schotel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, en tik op de cultuur schotel naar cel onthechting te vergemakkelijken. </li><li> Voeg 4 ml gesteriliseerde PBS aan cellen te dispergeren en breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de buis bij 300 g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 1 ml gesteriliseerde PBS en tel de live aantal cellen met behulp van de standaard trypan Blue uitsluiting methode 13. Opmerking: deze resuspensie stap is van cruciaal belang voor het bereiden van goed gescheiden single-cell schorsing tot de single-cell isolatie efficiëntie te verbeteren. </li></ol> 4. Single-cell Isolatie en Cultuur van klonen <ol><li> Belasting 50 ui celsuspensie bij een concentratie van 2,2-2,5 x10 <sup&gt; 6 cellen / ml in het microkanaal van de PDMS apparaat via het apparaat uitlaat gat met een handheld pipet. Opmerking: De celsuspensie laden pipet moet worden gestopt en gehouden op de eerste stop positie te voorkomen dat er luchtbellen in de microkanaal. </li><li> Plaats een ander 50 pi celsuspensie door de inlaat opening gelijkmatig vullen de hele microkanaal met cellen. </li><li> Seal de uitlaat gat met een plug (3 mm lang, 1 mm diameter gesneden nylon vislijn) aan stroom veroorzaakt door de hydrostatische druk van de druppels op inlaat en uitlaat een gaatje te voorkomen. Opmerking: De pluggen werden UV gesteriliseerd in een weefselkweek kap voor gebruik. </li><li> Vul een 1 ml steriele spuit met kweekmedium, uitwerpen luchtbellen uit, en zet deze op een injectiepomp. </li><li> Sluit het medium geladen spuit naar de inlaat gat van de PDMS apparaat via een 23 G stompe naald en een poly-tetrafluoretheen (PTFE) slangen. </li><li> Haal de stekker uit het stopcontact gat en alleow een 2-min tijdsinterval om de cellen om zich te vestigen in de single-cell capture-putten door zwaartekracht. </li><li> Wegspoelen de ongevangen cellen met 300 pl cultuurmedium bij een stroomsnelheid van 600 pl / min aangedreven door de injectiepomp. </li><li> Wacht 2 minuten om het apparaat te stabiliseren, en sluit de inlaat en uitlaat gaten pluggen een gesloten kweeksysteem vormen. </li><li> Draai het apparaat met de hand om de gevangen single-cellen over te dragen aan de cultuur microwells. </li><li> Plaats het PDMS inrichting in een 100-mm weefselkweekplaat en voeg 10 ml gesteriliseerde PBS rondom het apparaat kweekmedium verdamping uit het microkanaal voorkomen. </li><li> Verplaats de kweekschaal met een conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) voor klonale kweek van de single-cellen. </li></ol> 5. Cultuur Medium Replenishment <ol><li> Na 1 d van de cultuur, vervangt het kweekmedium in het PDMS apparaat met vers medium naar cel pr te verbeterenoliferation. </li><li> Plaats twee druppeltjes kweekmedium bovenop het PDMS apparaat nabij de inlaat- en uitlaatgaten gebieden te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal tijdens het uitvoeren van de volgende stap. </li><li> Punch twee gaten aan de bovenkant van het PDMS apparaat nabij de beide uiteinden van het microkanaal een inlaat en een uitlaat voor het microkanaal. Let op: niet punch via de hele twee lagen van het PDMS apparaat; in plaats daarvan slechts punch door de bovenste laag van het PDMS. </li><li> Sluit een 1 ml plastic spuit met vers medium aan de inlaat via een 23 G stompe naald en PTFE-buis. </li><li> Stroom 120 ul vers medium in de inrichting voor 5 minuten van het oude medium vervangen. </li><li> Plaats twee pluggen aan de inlaat en uitlaat af te dichten gaten, en de terugkeer van de inrichting aan de celkweek incubator. </li><li> Vernieuwen het kweekmedium elke 2 d gedurende de cultuur door het verwijderen van de afdichtpluggen, gevolgd door stap 5,4-5,5. </li></ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

-Microwell-apparaat systemen 6,14 werden gebruikt voor single-cell bewerking en analyse, zoals grootschalige eencellige trapping 6 en één hematopoietische stamcel proliferatie 15. Hoewel goed grootte, aantal en vorm kan worden aangepast voor specifieke toepassingen, de eencellige isoleerrendement altijd gevaar wanneer de grootte van de put toeneemt. 9,15 Om deze beperking te overwinnen, Park et al. Rapporteerde een microfluïdische chip met...

Momenteel plaatsen enkele cellen afzonderlijk in een kweekruimte wordt gewoonlijk bereikt door beperkende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Voor veel laboratoria beperkende verdunning een geschikte methode, aangezien het slechts vereist een pipet en weefselkweek platen, die gemakkelijk beschikbaar zijn. In dit geval wordt een celsuspensie serieel verdund tot een geschikte celdichtheid, en vervolgens in cultuur putjes geplaatst met een manuele pipet. Deze compartimenten enkele cellen worden vervolgens gebruikt voor cellulaire analyse, zoals genetische heterogeniteit screenen 1 en 2 kolonievorming. Deze methode is low-throughput en arbeidsintensief, zonder gebruikmaking van een robotarm om bijstand omdat de Poisson verdeling aard van de beperkende verdunningsmethode beperkt eencellige events een maximale waarschijnlijkheid van 37% 3. FACS machines met een geïntegreerde robotarm kan de beperking van de Poisson-verdeling overwonnen door nauwkeurig placing een single-cell in een cultuur goed in een tijd 4. De hoge schuifspanning mechanische (dus verminderde cellevensvatbaarheid) 5 en machine aankoop en bedrijfskosten hebben het gebruik ervan beperkt in veel laboratoria. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, zijn microschaal apparaten zijn ontwikkeld om zeer efficiënt enkele cellen in microwells 6 laden. Echter, de microputjes niet voldoende ruimte voor het beladen cellen prolifereren, vanwege de noodzaak om de grootte van elk microputje dicht bij die van een enkele cel om de eencellige loading waarschijnlijkheid maximaliseren. Aangezien cultuur assays vereist in veel cellen gebaseerde toepassingen (bijvoorbeeld klonogene assay 7), grotere microputjes (90-650 pm in diameter of lengte) zijn ook gebruikt om langere celculturen. Echter, zoals de beperkende verdunning methode, ze bezitten ook low single cell laden efficiëntie, variërend van 10 -. 30% 8, 9 Eerder hebben we een high-throughput microfluïdische platform ontwikkeld om enkele cellen te isoleren in afzonderlijke microwells en tonen de toepassing ervan in klonogene assay van de geïsoleerde cellen. 10 De inrichting werd gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS) en omvat twee stellen microputje arrays microwell met verschillende afmetingen, die grotendeels de efficiëntie van het laden van een enkele cel in een microtiterplaat waarvan de grootte kan verbeteren is aanzienlijk groter dan de cel. Met name de &quot;dual-well&quot; concept maakt de grootte van de kweek gebied flexibel worden aangepast zonder dat de eencellige capture efficiency, waardoor het eenvoudig om de vormgeving van de inrichting aan te passen aan verschillende celtypen en toepassingen. Deze high-efficiency methode moet nuttig zijn voor de lange termijn celkweek experimenten voor mobiele heterogeniteit studies en monoklonale cellijn vestiging.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Part No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Silicon wafer&nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Conventional oven</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasma Treatment System</td></tr><tr><td>SU-8 50 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td></tr><tr><td>Scanning laser profilometer</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Gevaarlijk. Corrosief voor de luchtwegen, reageert hevig met water.</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Space saver vacuum desiccator 190&nbsp;mm witte basis</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>met 0,75 mm binnendiameter</td></tr><tr><td>Verwijderbaar plakband</td><td>3M Company</td><td>Scotch Verwijderbaar Plakband 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basaal medium</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotica</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Penicilline-Streptomycine</td></tr><tr><td>Recombinant enzymmengsel</td><td>Innovative cell technology</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) celmembraandye</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Wordt gebruikt als celtracker</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof spuit (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge stompe naalden</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Poly-tetrafluoretheen (PTFE) buis</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>binnendiameter, 0,51&nbsp;mm; buitendiameter, 0,82&nbsp;mm</td></tr></tbody></table>

een microfluïdische platform voor high-throughput single-cell isolatie en cultuur

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Het bestuderen van de heterogeniteit van enkele cellen is cruciaal voor veel biologische vragen, maar is technisch moeilijk. Daarom is er behoefte aan een eenvoudige, maar toch snel doorvoerende, methode om experimenten met enkele celkweek uit te voeren. Hier rapporteren we een microfluïdische chip-gebaseerde strategie voor hoog-efficiënte enkele celisolatie (~77%) en demonstreren we de mogelijkheid om langdurige enkele celkweek (tot 7 dagen) en cellulaire heterogeniteit analyse uit te voeren met behulp van een klonogene assay. Deze toepassingen werden gedemonstreerd met KT98 muis neurale stamcellen, en A549 en MDA-MB-435 menselijke kankercellen. Hoge enkele celisolatie-efficiëntie en lange termijn kweekmogelijkheden worden bereikt door verschillende maten microwells te gebruiken aan de boven- en onderkant van het microfluïdische kanaal. De kleine microwell array is ontworpen voor precieze isolatie van enkele cellen, en de grote microwell array wordt gebruikt voor enkele cel klonale kweek in de microfluïdische chip. Dit microfluïdische platform vormt een aantrekkelijke aanpak voor enkele celkweek toepassingen, vanwege zijn flexibiliteit van instelbare celkweekruimtes voor verschillende kweekstrategieën, zonder vermindering van isolatie-efficiëntie.

De microfluïdische platform eencellige het kweken omvat een microkanaal (200 urn hoog) met twee sets microwell arrays (Figuur 2A). De twee stellen microwell arrays worden genoemd als capture-well (25 urn in diameter en 27 urn in diepte) en cultuur putjes (285 urn in diameter en 300 urn diepte) van eencellige isolatie en kweek, respectievelijk, en elk capture goed gepositioneerd in het midden van een kweek-well gezien vanuit het bovenaanzicht (figuur 2B)....

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Het algemene doel van dit protocol is om de fabricage en werking van een microfluidische chip te demonstreren, die hoogefficiënte isolatie en cultuur van enkelcellen mogelijk maakt. Deze methode biedt een nuttig instrument voor elk vakgebied dat baat heeft bij de isolatie en cultuur van enkelcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge efficiëntie bij het laden van enkelcellen in grote microwell-arrays.Bovendien worden alleen een zachte stroom en de zwaartekracht gebruikt om het apparaat te bedienen, waardoor celbeschadiging wordt geminimaliseerd. De implicatie van deze techniek is gericht op de einddiagnose van menselijke ziekten zoals kanker, waarbij cellulaire heterogeniteit de respons van de cel beïnvloedt. We kwamen op het idee om deze methode te ontwikkelen tijdens het opzetten van een microwell-cellijn, omdat de methode van limiterende verdunning zeer tijdrovend en inefficiënt was. Deze methode kan nu inzicht bieden in de analyse van individuele cellen.Het kan ook worden toegepast voor andere toepassingen, zoals het vaststellen van en de tijdsduur van de observatie van het verloop en gedrag van individuele cellen. Begin met het vervaardigen van gesilaniseerde mastermallen voor zowel de isolatielaag voor enkelvoudige cellen als de microwell-cultuurlayer, met behulp van standaard fotolithografie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Combineer voor elke mastermal 16 gram PDMS-basis met 1,6 gram hardingsmiddel in een wegwerpbeker en roer de mengsels totdat ze volledig zijn gecombineerd.Plaats vervolgens de mastermallen in petrischalen van 150 millimeter en giet het PDMS bovenop de mallen. Plaats de petrischalen in een vacuümexsikkaator en pas gedurende één uur een vacuüm toe om luchtbellen uit het PDMS te verwijderen. Haal de schalen na één uur uit de vacuümexsikkaator en plaats ze gedurende drie tot zes uur in een conventionele oven bij 65 graden Celsius om het PDMS te uitharden.Verwijder vervolgens de schaaltjes uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Pel, zodra ze zijn afgekoeld, de uitgeharde PDMS-capture-well array en de microwell-cultuurarray van de mastermallen en snijd de apparaten uit met een scheermesje. Gebruik daarna een pons van 0,75 millimeter om aan beide uiteinden van het microkanaal op de capture-well array-laag één gat te maken.Gebruik plakband om het toekomstige binnenoppervlak van het apparaat te reinigen en plaats vervolgens de afzonderlijke lagen, met de binnenoppervlakken naar boven gericht, in een plasmareiniger voor een korte zuurstofplasmabehandeling. Verwijder na afloop de PDMS-lagen uit de plasmareiniger en gebruik een stereomicroscoop om de boven- en onderlagen van het apparaat uit te lijnen en te verbinden. Plaats het uitgelijnde apparaat gedurende 24 uur in een oven op 65 °C om een permanente binding tussen de PDMS-lagen te creëren.Plaats vervolgens het verbonden PDMS-apparaat in gedeïoniseerd water en zet de container gedurende 15 minuten in een vacuümdessicator om de lucht uit het microkanaal van het apparaat te verwijderen. Wanneer alle lucht uit het apparaat is verwijderd, plaatst u het PDMS-apparaat in een weefkulturkap en gebruikt u UV-licht om het oppervlak van het apparaat 30 minuten lang te steriliseren. Vervang vervolgens het gedeïoniseerde water in het apparaat door 5% bovine serumalbumine in PBS en incubeer het apparaat 30 minuten lang bij 37 graden Celsius.Dit zal het oppervlak blokkeren en de overdrachtsefficiëntie van geïsoleerde cellen van de vangstputjes naar de kweekputjes verbeteren. Vervang na 30 minuten de blokkeringsoplossing in het apparaat door steriele PBS. Bereid een enkelcel-suspensie voor met 2,5 miljoen cellen per milliliter en vul een pipet met 50 microliters van de suspensie.Breng vervolgens de cellen via het uitlaatgat van het apparaat over in het apparaat. Voeg nog eens 50 µL van de celsuspensie toe en breng deze via het inlaatgat over in het apparaat om het gehele microkanaal gelijkmatig met cellen te vullen. Nadat de cellen zijn geladen, wordt het uitlaatgat van het apparaat afgedicht met een steriele plug gemaakt van nylon vislijn met een diameter van één millimeter.Vul vervolgens een steriele spuit van één milliliter met cultuurmedium, verwijder eventuele resterende luchtbellen en plaats deze in de spuitpomp. Bevestig een stompe naald van 23 gauge aan de spuit en gebruik polytetrafluoroethyleen-slangen om de naald met de inlaat van het apparaat te verbinden. Verwijder na het aansluiten van de slang de plug uit het uitlaatgat en wacht twee minuten terwijl de cellen door zwaartekracht in de capture-wells voor enkelvoudige cellen bezinken.Stel vervolgens de spuitpomp in op 600 µL per minuut. Verwijder de uitlaatplug en spoel de niet-gevangen cellen gedurende 30 seconden weg. Wacht twee minuten tot de druk is gestabiliseerd.Verwijder vervolgens de buis uit de inlaat van het apparaat en sluit zowel de inlaat- als uitlaatopeningen af met pluggen om een gesloten cultuursysteem te vormen. Keer het apparaat nu handmatig om om de gevangen individuele cellen over te brengen naar de cultuur-microwells aan de andere zijde van het apparaat. Plaats het apparaat vervolgens in een weefselkweekschaal van 100 millimeter, voeg 10 milliliter gesteriliseerd PBS rondom het apparaat toe en plaats de schaal in een incubator.Om het cultuurmedium te vervangen, plaatst u eerst twee druppels cultuurmedium bovenop het PDMS-apparaat nabij de in- en uitlaat om te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal terechtkomen. Gebruik vervolgens een biopsietpons van 0,75 millimeter om twee gaten te ponsen vanuit de bovenkant van het PDMS-apparaat nabij de uiteinden van het microkanaal. Zorg ervoor dat u alleen door de bovenste laag van het apparaat ponst.Vul vervolgens een plastic spuit van één milliliter met vers voorverwarmd medium en gebruik een stompe naald van 23 gauge en PTFE-slangen om deze met de nieuw gemaakte inlaatpoort te verbinden. Laat gedurende vijf minuten langzaam ongeveer 120 microliter vers medium in het apparaat stromen om het oude medium te vervangen. Seal na afloop de inlaat- en uitlaatpoorten met twee pluggen en plaats het apparaat terug in de celkweekincubator.Het aantal cellen dat in de opvangputjes terechtkomt varieert van ongeveer 68% tot 85%, afhankelijk van het celtype. Daarnaast bevatten de meeste opvangputjes slechts één enkele cel voor alle drie de celtypen. Na de overdracht van de opgevangen KT98-cellen naar de kweekputjes bevatten ongeveer 77% van de putjes slechts één enkele cel, 16% bevatte geen cellen, 6% bevatte twee cellen en minder dan 1% van de putjes bevatte drie of meer cellen.Gedurende zeven dagen vertoonden geïsoleerde enkelcellen heterogene groeipatronen. Terwijl sommige cellen zich vermenigvuldigden, deden andere dat niet. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer 20 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u dit high-throughput platform voor endocrinale kweek met isolatie van enkelvoudige cellen kunt gebruiken om de productiviteit van uw experimenten met enkelvoudige cellen te verhogen. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal terechtkomen en dat cellen na verloop van tijd gaan aggregeren.

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Hier presenteren we een protocol om primaire cellen, weefselmodellen en punchbiopten gedurende maximaal 28 dagen te cocultiveren in een microfluïdische multi-orgaan chip. Humane dermale microvasculaire endotheelcellen, leveraggregaten en huidbiopten werden met succes gecombineerd in een gemeenschappelijke mediacirculatie.

De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken &gt; 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Dit protocol beschrijft hoe het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel) kan worden gebruikt om microbiële monoklonale isolatie, teelt en pluk uit te voeren. De MISS-cel bereikt een geïntegreerde workflow op basis van microfluïdische druppeltechnologie, die een uitstekende monodispersie van druppels, hoge parallelle teelt en detectie van biomassa met hoge doorvoer biedt.

Geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale teelt en plukken met behulp van het eencellige Microliter-druppel Culture Omics-systeem

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Leer hoe je een microfluïdische chip fabriceert en bedient voor efficiënte single-cell isolatie en cultuur met behulp van zachte stroming en zwaartekracht. Deze methode minimaliseert celschade en opent nieuwe mogelijkheden voor kankeronderzoek.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Meer video's verkennen