Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor
February 1st, 2018
Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.
Het algemene doel van deze procedure is om de omkering van het celdoodproces na caspase-activering in levende dieren te detecteren en te volgen met behulp van Drosophila melanogaster als model. In reactie op een doodsstimulus ondergaan cellen geprogrammeerde celdood zoals apoptose, wat traditioneel is beschouwd als een onomkeerbare cascade die leidt tot celdood. Interessant genoeg kunnen sommige stervende cellen echter de celdoodproces omkeren, zelfs in een late fase, na verwijdering van de doodsstimulus.
Door een nieuw ontdekt celherstelfenomeen genaamd anastasis. Levende celmicroscopie toont aan dat apoptotische stervende cellen unieke morfologische kenmerken vertonen, zoals pleompjeblaasjes in het plasmamembraan, nucleaire condensatie en celkrimp. Over het algemeen wordt verwacht dat deze cellen zullen sterven.
Echter, na het wassen en incuberen van de stervende cellen met vers medium, ondergaan ze anastasis, herstellen en kunnen later delen. Het is moeilijk om anastasis in levende dieren te detecteren en te volgen omdat de herstelde cellen morfologisch niet te onderscheiden zijn van de omringende gezonde cellen. Om dit probleem op te lossen, werd het CaspaseTracker biosensor-systeem voor zoogdieren ontwikkeld om de cellen te identificeren en te volgen die het celdoodproces omkeren na executie of caspase-activering, het kenmerk van apoptose.
Dit biosensor-systeem bestaat uit twee componenten: de caspase-activatiebare transactivator, rtTA, en de Cre LoxP-gebaseerde rtTA-activiteitsreporter. In gezonde cellen, zonder caspase-activiteit, is rtTA verbonden aan een plasmamembraan-anker via een caspase-splitsbare DEVD-linker. Omdat rtTA als zodanig niet kan transloceren van het cytosol naar de kern, blijft de rtTA-reporter inactief.
Echter, bij activering als reactie op celdood-inductie, splitsen caspasen de DEVD-linker, waardoor rtTA vrijkomt om naar de kern te transloceren en de rtTA-reporter activeert. Eenmaal in de kern bindt rtTA zich aan het tet-responselement, of TRE, en activeert de expressie van Cre-recombinase, wat leidt tot een onomkeerbare recombinatiegebeurtenis die het stopcodon-cassette tussen de CAG-promotor en de coderende sequenties voor het rode fluorescente eiwit DsRed verwijdert. Dit resulteert in permanente expressie van DsRed, wat dient als permanente fluorescente marker voor cellen die levend kunnen blijven na het hebben ervaren van caspase-activiteit, evenals hun nakomelingen.
Levende cel-confocale microscopie toont aan dat na tijdelijke celdood-inductie, de CaspaseTracker biosensor-cellen DsRed tot expressie brengen tijdens en na hun herstel, en onderscheiden ze zich daarom van de niet-herstelde cellen, aangegeven met witte pijlen, evenals de controle-biosensor-cellen die niet werden blootgesteld aan de celdood-stimulus. Geprogrammeerde celdood, zoals apoptose, wordt over het algemeen als onomkeerbaar beschouwd omdat het wordt uitgevoerd door een wilde en massale celvernietiging. Echter, we ontdekken dat stervende cellen daadwerkelijk kunnen herstellen, zelfs in een late fase die als het punt van geen terugkeer wordt beschouwd, zoals na de afgifte van cytochroom c, caspase-3-activering, DNA-schade, pleompjeblaasjes in het plasmamembraan, celkrimp en de vorming van apoptotische lichaampjes.
We noemden deze omkering van het celdoodproces anastasis, wat betekent "opkomst tot leven" in het Grieks. Door gebruik te maken van levende celmicroscopie, kunnen we anastasis in gekweekte cellen observeren. Het is echter technisch uitdagend om anastasis in levende dieren waar te nemen, omdat de herstelde dode cel eruit kan zien als normale gezonde cellen die helemaal geen celdood hebben geprobeerd.
Daarom ontwikkelden we een CaspaseTracker biosensor-systeem om anastasis in levende dieren te detecteren en te volgen. De Drosophila-versie van het CaspaseTracker-systeem is een dubbele biosensor die bestaat uit twee componenten: de caspase-activatiebare transcriptiefactor, GAL4, en de GAL4-activiteitsreporter, bekend als G-TRACE. In de cellen zonder caspase-activiteit, is de gisttranscriptiefactor, GAL4, verbonden aan een plasmamembraan-ankerdomein via een caspase-splitsbare DQVD-linker.
Bij caspase-activering splitsen geactiveerde caspasen de DQVD-linker om GAL4 vrij te maken, dat vervolgens naar de kern transloceert om de G-TRACE-reporter te activeren. De nucleaire GAL4 bindt zich aan de specifieke stroomafwaartse activerende sequenties, afgekort als UAS, om de tijdelijke expressie van RFP te activeren, wat dient als de reporter van recente of huidige caspase-activiteit totdat de caspase en de GAL4-activiteit stoppen en het RFP-eiwit wordt afgebroken. GAL4 activeert ook de expressie van de FLP-recombinase, wat leidt tot een recombinatiegebeurtenis die het stopcassette verwijdert tussen het ubiquitine, afgekort als Ubi, promotor en de coatingsequenties voor het nucleair-gerichte GFP.
Dit resulteert in permanente expressie van nucleair GFP, wat dient als een permanente marker voor cellen die caspase-activiteit hebben ervaren maar levend blijven, evenals hun nakomelingen. Dit systeem kan dus cellen met lopende of recente caspase-activiteit identificeren door het tijdelijke RFP-signaal en voorbije caspase-activiteit met het permanente GFP-signaal. Een controle-biosensor heeft de mutatie DQVA op de caspase-splitsplaats, wat ongevoelig is voor caspase-activiteit.
Caspase-gevoelige GAL4 maagdelijke vrouwtjesvliegen werden gekruist met G-TRACE jonge mannetjesvliegen, of omgekeerd, om de CaspaseTracker-vliegen te genereren. Om de omkeerbaarheid van het celdoodproces na caspase-activering te testen, worden de vliegen eerst blootgesteld aan tijdelijke, celdood-inducerende omgevingsstress, zoals koudschok of eiwitgebrek. Vervolgens worden de gestreste vliegen teruggezet in normale kweekomstandigheden voor herstel.
Weefsels werden verkregen uit de eicellen in de eierstokken van de controle-, gestreste of herstelde vliegen. De monsters werden onderworpen aan confocale microscopie om de fluorescente signalen van de CaspaseTracker biosensor te detecteren. Om te beginnen, worden anesthetiseerde, recent uitgekomen caspase-gevoelige DQVD GAL4-vliegen met kooldioxide gebruikt en met een penseel worden
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt de detectie en het volgen van anastasis, een proces waarbij stervende cellen celdood kunnen omkeren na de verwijdering van een doodsstimulus. Met behulp van Drosophila melanogaster als model introduceert de studie een nieuw in vivo CaspaseTracker biosensorsysteem om dit fenomeen in levende dieren te observeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschap
- Beeldvorming van levende cellen
Achtergrond
- Anastasis is een nieuw ontdekte herstelproces in stervende cellen.
- Cellen ondergaan typisch apoptose, wat als onomkeerbaar wordt beschouwd.
- Sommige cellen kunnen herstellen, zelfs in late stadia nadat een doodsstimulus is verwijderd.
- Levende celmicroscopie onthult unieke morfologische veranderingen in apoptotische cellen.
Doel van het onderzoek
- Om protocollen te ontwikkelen voor het detecteren van anastasis in vivo.
- Om een biosensor te gebruiken voor het volgen van celherstel in levende dieren.
- Om het begrip van celdood en herstelmechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van het CaspaseTracker biosensorsysteem.
- Technieken voor levende celmicroscopie.
- Gebruik van Drosophila melanogaster als modelorganisme.
- Observatie van morfologische kenmerken van apoptotische cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van cellen die anastasis ondergaan in levende modellen.
- Identificatie van unieke morfologische kenmerken tijdens het herstelproces.
- Demonstratie van het potentieel voor het volgen van de omkering van celdood.
- Inzichten in de mechanismen achter celherstel vanuit apoptose.
Conclusies
- Anastasis kan worden gedetecteerd en gevolgd met behulp van het CaspaseTracker systeem.
- Dit onderzoek biedt een nieuw perspectief op celdood en herstel.
- Verdere studies kunnen de therapeutische implicaties van anastasis onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Detecting transient caspase activation and subsequent cellular recovery addresses a critical gap in target validation for apoptosis-modulating therapies. The CaspaseTracker biosensor enables mechanistic de-risking by distinguishing true anastasis from non-apoptotic caspase activity, improving predictive confidence in early discovery. This supports portfolio triage by identifying compounds that induce irreversible cell death versus those permitting recovery, reducing late-stage biological risk in oncology and regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether caspase activation leads to irreversible commitment or reversible recovery in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through permanent genetic marking of cells that experienced caspase activity but remained viable, clarifying target engagement outcomes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether a target modulates cell death reversibility, informing go/no-go decisions before phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with dual-signal readouts (transient RFP for recent caspase activity, permanent GFP for past activity) to support reproducible compound screening.
- Quantitative Outputs: Enables discrimination between cells with ongoing versus historical caspase activation, facilitating assay standardization and reducing false positives in death pathway assays.
- Scalability & Reuse: The biosensor’s permanent marking allows longitudinal tracking of cellular progeny, supporting platform reuse across multiple screening campaigns and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks recovery in cell types such as oocytes, nurse cells, follicle cells, and germarium stem cells, providing insight into tissue-level regeneration mechanisms.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase caspase dynamics to preclinical validation by monitoring whether recovered cells retain functionality and contribute to tissue repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on whether a compound’s pro-apoptotic effect is sustained or potentially counteracted by cellular recovery mechanisms, reducing recurrence risk in cancer therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
The CaspaseTracker biosensor fits within the discovery continuum from target engagement assessment through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for pathways where cell death reversibility impacts therapeutic durability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether caspase activation in a model system results in permanent cell death or transient stress response with recovery potential.
- Screening: Delivers assay-ready systems with built-in controls (e.g., caspase-insensitive DQVA mutant) to distinguish specific caspase-dependent signals from background or non-apoptotic activity.
- Analytics: Provides dual-parameter readouts (RFP+GFP for recent/past activity, GFP-only for past-only) that enable quantitative comparison of compound effects on cell death reversibility.
- Translational Research: Links molecular mechanism to tissue phenotype by tracking whether caspase-exposed cells in complex tissues like ovaries contribute to recovery lineages.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular biosensor platform adaptable to diverse model systems and inducible stressors, reducing redevelopment costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in apoptosis assays by differentiating true anastasis from experimental artifact or non-apoptotic caspase signaling.
- Operational Value: Standardizes detection of cell death reversibility through irreversible genetic marking, enabling consistent longitudinal tracking across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying early whether a target modulation leads to durable phenotypic effect or transient effect susceptible to cellular recovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to overcome cellular recovery mechanisms, particularly in oncology and degenerative disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic biosensor systems, confocal microscopy, and inducible stress models in Drosophila or mammalian systems.
- Dependent on fluorescence imaging infrastructure and genetic cross viability to maintain biosensor fidelity across generations.
- Necessitates cross-team standardization on stress induction protocols (e.g., cold shock, protein starvation) and recovery windows to ensure comparable anastasis detection.
- Involves adaptation considerations when translating the dual-component biosensor (e.g., GAL4/G-TRACE in flies, rtTA/Cre in mammals) across species or tissue types.
- Limited by the requirement that caspase activity must occur for signal generation, making it unsuitable for tracking caspase-independent cell death pathways.
