Name: Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Leer anastasis detecteren in vivo met de CaspaseTracker biosensor in Drosophila melanogaster. Deze methode maakt het mogelijk om celherstel na apoptose te volgen in levende organismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Darren Obbard voor Drosophila afbeelding in figuur 3 c en video manuscript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson en Heather M. Lamb voor waardevolle discussie van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright verlenen 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.), en NCI K22 verlenen CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang was een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

1) voorbereiding van CaspaseTracker Biosensor vliegen
<ol><li>Anesthetize vliegen met CO2, en een penseel gebruiken voor het overbrengen van 7 tot en met 10 caspase-gevoelige Gal4 (DQVD)19 Maagd vrouwtjes en 7 naar 10 G-Trace53 Gal4 verslaggever jonge mannelijke vliegen (of vice versa) in de dezelfde flacon met vliegen eten en verse gist plakken. Opmerking: Kruis van Caspase-gevoelige (DQVD) Gal4 en G-Trace vliegen zal produceren CaspaseTracker nageslacht vliegen. Kruis van Caspase -ingevoelige (DQVA)19 Gal4 en G-Trace vliegen zorgt voor negatieve controle vliegt (zie discussie). Verse gist plakken fungeert als eiwitbron ter verbetering van de eiproductie, dus dat aantal nakomelingen vergroot. Selecteer Maagd vrouwtjes en jonge mannelijke vliegen volgens hun fenotypen54.</li>
	<li>De vliegen bij 18 graden Celsius (oC) tijdens het Kruis Incubeer gedurende 3 tot 7 dagen, en vervolgens de vliegen overbrengen in een nieuwe flacon instellen van een nieuwe Kruis bij 18 ° C. Blijven de oorspronkelijke flacon bij 18 ° C incuberen tot nakomelingen eclose vliegt. Opmerking: De bovenliggende vliegen naar nieuwe flesjes om te voorkomen dat de overbevolking van de nakomelingen op de oorspronkelijke flacon overbrengen. Bovenliggende vliegen kunnen produceren nakomelingen met vers voedsel en gist plakken op de eerste 2 tot 3 schakelaars, en vervolgens de productiviteit aanzienlijk zal dalen met de tijd. Verhogen van vliegen 18 ° C aspecifieke signaal van CaspaseTracker biosensor kan verminderen (zie discussie).</li>
	<li>Selecteer nakomelingen vliegt met juiste fenotypen54 voor volgende experimenten. Opmerking: De transgenen van zowel de Gal4 als de G-Trace caspase-gevoelige hier bevinden zich op de tweede chromosoom, in balans met CyO balancer. Selecteer de nakomelingen van de niet-krullend vleugel (zonder CyO), die beide transgenen van caspase-gevoelige Gal4 en G-Trace heeft.</li>
</ol>2) toepassing van voorbijgaande cel dood inductie to CaspaseTracker Biosensor Flies
<ol><li>Overdracht van 10 tot 20 nieuw eclosed vrouwtje naar een nieuwe flacon met verse vliegen eten en verse gist plakken voor 1 dag bij 18 ° C vliegt tot kamer eiproductie toestaan door oögenese. Opmerking: Het vrouwtje met mannelijke vliegen houden kan verbeteren eiproductie kamer.</li>
	<li>Om te induceren ei chambers apoptosis ondergaan door koude schok, overdracht vliegt het vrouwtje naar nieuwe lege flacon, die vervolgens wordt geplaatst bij-7 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: koude schok verwondt cellen door inducerende plasmamembraan breuk55,56.</li>
	<li>Om te induceren ei chambers apoptosis ondergaan door eiwit verhongering, overbrengen in de vrouwelijke vliegen een nieuwe flacon met 8% sucrose en 1% agar voedsel bij 18 ° C gedurende 3 dagen. Opmerking: Eiwit honger (niet-eiwit voedsel) kan leiden tot ei kamers te ondergaan apoptosis57,58,59 en autophagy60,61. Schakelaar vliegt naar een nieuwe flacon met 8% sucrose en 1% agar voedsel elke dag optimale conditie van de sucrose vliegen om voedsel te houden.</li>
	<li>De gespannen vliegen ook terug overzetten naar een nieuwe flacon met verse vliegen eten en verse gist plakken voor 3 dagen bij 18 ° C te laten herstellen. Ontleden de uitgehongerd en de uitgehongerd-hersteld vliegt naar ei chambers op eierstokken is verkrijgbaar als beschreven62. Opmerking: Om te ontleden Drosophila om te verkrijgen van de eierstokken, anesthetize vliegen met CO2, 2 paren van pincet gebruiken om te vliegen hoofd verwijderen en gebruik van de verlostang om te trekken van de basis van de buik te verwijderen van de eierstokken van de vliegen.</li>
</ol>3) fixatie en kleuring van ontleed ei kamers voor Imaging
<ol><li>De kamers van de ontleed ei samen met rond 0,5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) overbrengen in 1 mL centrifuge buizen. Laat de eieren om te settelen. Opmerking: Coat de plastic pipet tips met 1% bovien serumalbumine (BSA) zijn opgelost in water of PBS om te voorkomen dat het ei kamers te houden op het plastic oppervlak van de tips. De volgende procedures uitvoeren in donker te vermijden photobleaching rood fluorescerende eiwit (RFP, ook bekend als DsRed) en groen fluorescente proteïne (GFP) in de ei-kamers.</li>
	<li>Verwijder de PBS door pipetteren en vervolgens toepassen 0,5 mL 4% paraformaldehyde in PBS de ei kamers bij kamertemperatuur in donker gedurende 20 tot 30 minuten vast te stellen. Opmerking: Zachte rotatie in dit en de volgende stappen van de incubatie van toepassing.</li>
	<li>Verwijder de paraformaldehyde door pipetteren, en vervolgens gewassen de ei-zaal met 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) voor 3 keer. Opmerking: Langdurige fixatie kan verminderen de RFP en GFP signalen.</li>
	<li>Incubeer de ei-kamers met PBST gedurende 1 tot 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C met zachte rotatie naar permeabilize van de ei-kamers. Opmerking: PBST ook ei chambers vast te houden aan het niet-BSA gecoate plastic oppervlak kunt vermijden.</li>
	<li>De PBST door pipetteren verwijderen, en vervolgens het toepassen van 0,5 mL 10 μg/mL blauw nucleaire Hoechst kleurstof in PBST op ei kamers voor 1 tot en met 2 h bij kamertemperatuur aan voor nucleus vlek. NOTE1: Vermijd langdurige incubatie met nucleaire kleurstof omdat dit niet-specifieke signaal zal verhogen. NOTE2: Alternatieve aanpak van nucleus zonder Hoechst vlek is het toevoegen van 200 μL anti-bleken montage agent met de DAPI (Zie materiaal) en overnachting63, vóór de montage van de weefsels op glas cover slip zoals beschreven bij protocol 3.8 uit te broeden. NOTE3: het uitvoeren van de kleuring en de volgende procedures in donker te vermijden photobleaching.</li>
	<li>Verwijderen van de nucleaire kleurstof door pipetteren, en vervolgens toepassen 0,5 mL PBST te wassen van de ei-kamers in het 1 mL centrifuge buizen voor 3 keer, met 10 tot 20 min incubatie met zachte rotatie tussen elke stap wassen.</li>
	<li>Verwijder alle PBST met fijne pipet en past u vervolgens 200 μl anti-bleken montage agent (Zie materiaal) aan het broeden van de ei kamers bij kamertemperatuur gedurende 3 uur of 's nachts bij 4 ° C, totdat de kamers ei naar de bodem van de buis zinken. Opmerking: weefsels die hebben volledig geabsorbeerd de montage agent zinken naar de bodem van de buis.</li>
	<li>De kamers gekleurd ei door het overbrengen van hen met 200 μl anti-bleken Mount montage agent op een vooraf gereinigd glasplaatje voor beeldvorming door pipetteren, dekking van de ei-kamers met een 20 x 20 mm vooraf schoongemaakte glazen cover slip, en verzegel de cover slip op glasplaatje doordat nagellak aan de rand van de slip van de cover. NOTE1: Vooraf reinigen het glasplaatje en cover slip met water of 70% ethanol. NOTE2: Solliciteer vaseline tussen het glasplaatje en de cover slip te voorkomen vernietiging van de kamers van het ei door overcompression.</li>
	<li>Afbeelding van de ei-kamers met behulp van fluorescentie- of confocal microscoop, met behulp van een 20 x, NA 0,8 Plan-Apochromat doel met excitatie licht golflengte van 405 nm voor nucleaire kleuring (detect emissie ~ 461 nm), 561 nm voor RFP (lopende of recente caspase activiteit) signaal ( Detect emissie ~ 590 nm), en 488 nm voor GFP (verleden caspase-activiteit) signaal (detecteren emissie ~ 518nm). Opmerking: Zie onze gepubliceerde protocollen voor microscopie20,64.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het systeem van de dubbele biosensor CaspaseTracker is een roman en uniek instrument dat maakt de ontdekking van recente of lopende caspase-activiteit, en het bijhouden van cellen die zijn omgekeerd celdood verwerken en overleven na het ervaren van caspase activiteit in vivo. Terwijl caspase activiteit traditioneel als een stempel van apoptosis aangenomen is, openbaren groeiende studies dat niet-apoptotic caspase activiteit potentiële rollen in uiteenlopende normale cel functies,...

Geprogrammeerde celdood, zoals apoptosis, speelt een essentiële rol in de embryonale ontwikkeling en normale homeostase door het elimineren van ongewenste, gewonde of gevaarlijke cellen in meercellige organismen1,2,3. Het verlies van evenwicht tussen celdood en overleving kan leiden tot fatale gevolgen hebben, zoals kanker, hartfalen, auto-immuniteit en degeneratie4,5,6,7,8. Activering van de beul caspases heeft traditioneel beschouwd als de "point of no return" in apoptosis9,10,11, zoals het snelle en massale cellulaire sloop12, triggers 13,14,15,16. Uitdagend deze algemene dogma, we laten zien dat kunnen gekweekte stervende primaire cellen en kankercellen dood kenmerken waaronder plasmamembraan blebbing, cel krimp, herstellen aan niet alleen na activering van caspase, maar ook volgende belangrijke cel mitochondriale fragmentatie, introductie van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, nucleaire en condensatie van de chromatine, DNA-beschadiging, nucleaire fragmentatie, mobiele oppervlakte blootstelling van fosfatidylserine (PS), en de vorming van apoptotic organen 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Wij stellen voor dat anastasis is een intrinsieke cel herstel fenomeen, zoals stervende cellen na verwijdering van cel dood stimuli17,18,19,20, herstellen kunnen 21. wij bedacht de term "Anastasis" (Αναστάσης)18, wat betekent "rising tot leven" in het Grieks te beschrijven dit onverwachte cel herstel verschijnsel. Onze waarneming van de anastasis wordt verder ondersteund door recente onafhankelijke studies die ook herstel van cellen onthullen na fosfatidylserine externalization22,23,24, mitochondriale beperkt buitenste membraan permeabilization25, activering van gemengde afkomst kinase-achtige (MLKL) en cel krimp26.
Karakterisering van de mechanismen tot regeling van de anastasis, worden de paradigma-shifting fysiologische, pathologische en therapeutische gevolgen zal hebben. Anastasis kon vertegenwoordigen een voorheen onbekende cytoprotective mechanisme te redden of te bewaren van belangrijke postmitotic cellen en weefsels die moeilijk te vervangen, en eventueel rekening voor hartfalen omkering door ventriculaire lossen met links ventriculaire apparaten (LVADs)27,28, herstel van fotoreceptor cellen na voorbijgaande blootstelling van buitensporige lichte29,30,31, of reparatie van neuronen helpen na hersenen letsel32. Als dus het bevorderen van anastasis cel- en weefseltransplantaties herstel versterken kan. Daarentegen zou anastasis een tactiek van de onverwachte ontsnappen door kankercellen gebruikt om te overleven van cel-dood-inducerende therapie, veroorzaakt kanker herhaling17,18. Dus, het onderdrukken van anastasis in het sterven van kankercellen tijdens en na de kankerbehandeling zou een nieuwe therapeutische strategie om te genezen van kanker door te voorkomen dat hun herval.
Tijdens het proces van anastasis, hebben we gevonden dat sommige herstelde cellen verworven permanente genetische veranderingen en onderging oncogene transformatie, waarschijnlijk te wijten aan DNA-schade opgelopen tijdens apoptosis18,20,21 . Omkeren van het proces van de dood van DNA-beschadigde cellen zou een mechanisme van tumorvorming, potentieel ten grondslag liggen aan de observatie dat herhaald weefsel schade verhoogt het risico van kanker in een verscheidenheid van weefsels, zoals chronische thermische verwonding in de slokdarm geïnduceerde door de consumptie van zeer warme dranken33,34,35, leverschade als gevolg van alcoholisme36,37, tumor evolutie na genotoxische kanker therapie38, 39,40, en ontwikkeling van nieuwe kankergevallen van normale weefsels die zich tijdens de interval tussen de cycli van de anti-kanker therapie41,42,43,44 voordoen . Als de waarde true is, kon gericht op anastasis voorkomen of arresteren van de ontwikkeling van kanker en de progressie. We hebben gevonden dat stervende kiemcellen honger geïnduceerde anastasis in opnieuw gevoed Drosophila19ondergaan.  Als anastasis in geslachtscellen met DNA-beschadiging optreedt, zou het account voor de observatie dat verlengd milieudruk bevordert de ontwikkeling van genetische ziekten. Bijvoorbeeld, bijdragen hongersnoden tot de ontwikkeling van transgenerationele overneembare ziekten zoals diabetes en hart-vaatziekten45. Daarom kan begrip anastasis leiden tot de strategieën voor de preventie van het ontwikkelen van overneembare ziekten veroorzaakt door dit potentiële mechanisme.
Om te profiteren van de ontdekking van anastasis en direct te ontwikkelen innovatieve therapieën, is het essentieel om te bestuderen van de oorzaak en het gevolg van anastasis in levende dieren. Het is echter technisch uitdagend om te identificeren en te volgen anastatic cellen in vivo, omdat de cellen die verhaald van cel dood proces morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen weergegeven, en er geen biomerker voor anastasis is geïdentificeerd nog2118,17,. Om deze problemen aanpakken, ontwikkelden we onlangs een nieuwe in vivo caspase biosensor aangewezen "CaspaseTracker"19, identificeren en traceren van cellen die apoptosis na caspase activering19,46 overleven, de kenmerk van apoptosis10,14. Onderscheiden van de 'real-time' caspase-biosensoren zoals SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 en iCasper52 dat sporen gaande caspase activiteit, de CaspaseTracker biosensor bovendien wezenstrek naar de vermogen voor permanent label cellen die uitdrukkelijke caspase-activiteit zelfs Transient. Daarom wordt het de CaspaseTracker biosensor lange termijn bijhouden ingeschakeld voor anastasis na omkering van caspase-gemedieerde cel dood proces in vivo.

<table><tbody><tr><td>BENODIGDHEDEN EN REAGENTIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade mounting medium</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium (met DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium met DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont pincet biologie kwaliteit, roestvrij staal</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glazen platen</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA kleurstof</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria kleurstof</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Kleurstof voor actief fragment van caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Medium voor wassen en immunokleuring</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergens voor celpermeabilisatie</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscoop Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissectie</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscoopverlichter, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>Lichtbron</td></tr></tbody></table>

opsporen van anastasis in vivo door caspasetracker biosensor

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Grieks voor "stijgen tot leven") is een recent ontdekte cel herstel fenomeen waarbij cellen sterven kunt omkeren alsnog cel dood processen die in het algemeen wordt verondersteld dat zijn intrinsiek onomkeerbaar. Bevordering van anastasis kan in principe reddings- of behouden gewond cellen die moeilijk te vervangen zoals cardiomyocytes of neuronen, teneinde het herstel van het weefsel. Omgekeerd, onderdrukken van anastasis in kankercellen, apoptosis na anti-kanker therapieën, ondergaan kan zorgen voor de dood van de cel van de kanker en verminderen de kans op herhaling. Echter, deze studies hebben belemmerd door het ontbreken van hulpmiddelen voor het bijhouden van het lot van de cellen die u ondergaan anastasis in levende dieren. De uitdaging is het identificeren van de cellen die de cel dood proces ondanks hun morfologisch normale uiterlijk na herstel hebben omgekeerd. Om deze moeilijkheid te overwinnen, hebben wij ontwikkeld Drosophila en zoogdieren CaspaseTracker biosensor systemen die kunnen identificeren en de anastatic cellen in vitro of in vivopermanent kan bijhouden. Hier presenteren we in vivo protocollen voor de generatie en het gebruik van het systeem van de dubbele biosensor CaspaseTracker op te sporen en het bijhouden van anastasis bij Drosophila melanogaster na voorbijgaande blootstelling aan cel dood prikkels. Terwijl conventionele biosensoren en protocollen cellen actief ondergaat apoptotic celdood etiketteren kunnen, de CaspaseTracker biosensor kan permanent het label van cellen die zijn hersteld na activering van caspase - een waarmerk van laat-stadium apoptosis, en om actieve apoptotic processen gelijktijdig te identificeren. Deze biosensor kan ook het herstel van de cellen die geprobeerd andere vormen van dood van de cel die direct of indirect caspase-activiteiten betrokken bijhouden. Daarom dit protocol stelt ons in staat om continu bijhouden van het lot van deze cellen en hun nakomelingen, vergemakkelijking van toekomstige studies van de biologische functies, moleculaire mechanismen, fysiologische en pathologische gevolgen en therapeutische implicaties van Anastasis. We bespreken ook de nodige controles om te onderscheiden van de cellen die u ondergaan van anastasis uit die het weergeven van niet-apoptotic caspase activiteit in vivo.

Terwijl time-lapse levende cel microscopie een betrouwbare methode om de tractus anastasis in gekweekte cellen20 is, is het uitdagend om te identificeren welke cellen hebben ondergaan anastasis in dieren, omdat de herstelde cellen morfologisch te onderscheiden verschijnen van normale gezonde cellen hebben dat niet geprobeerd celdood. Bijvoorbeeld weergeven menselijke baarmoederhalskanker HeLa cellen morfologische kenmerken van apoptosis1,2...

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Het algemene doel van deze procedure is om de omkering van het celdoodproces na caspase-activering in levende dieren te detecteren en te volgen met behulp van Drosophila melanogaster als model. In reactie op een doodsstimulus ondergaan cellen geprogrammeerde celdood zoals apoptose, wat traditioneel is beschouwd als een onomkeerbare cascade die leidt tot celdood. Interessant genoeg kunnen sommige stervende cellen echter de celdoodproces omkeren, zelfs in een late fase, na verwijdering van de doodsstimulus.Door een nieuw ontdekt celherstelfenomeen genaamd anastasis. Levende celmicroscopie toont aan dat apoptotische stervende cellen unieke morfologische kenmerken vertonen, zoals pleompjeblaasjes in het plasmamembraan, nucleaire condensatie en celkrimp. Over het algemeen wordt verwacht dat deze cellen zullen sterven.Echter, na het wassen en incuberen van de stervende cellen met vers medium, ondergaan ze anastasis, herstellen en kunnen later delen. Het is moeilijk om anastasis in levende dieren te detecteren en te volgen omdat de herstelde cellen morfologisch niet te onderscheiden zijn van de omringende gezonde cellen. Om dit probleem op te lossen, werd het CaspaseTracker biosensor-syst

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Exosomen zijn microvesiculaire structuren die in biovloeistoffen worden aangetroffen en mogelijk belangrijke, voor ziekten discriminerende biomarkers dragen. Hier wordt een nieuwe methode gebruikt om specifiek exosomen te extraheren en het exosomale geladene snel te testen op zowel RNA/eiwitdoelen na de verstoring van exosomen met behulp van niet-uniforme elektrische cyclische vierkante golven.

Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Calciumhomeostase van het endoplasmatisch reticulum is verstoord bij verschillende pathologieën. Een uitgescheiden ER calcium-monitoring-eiwit (SERCaMP) reporter kan worden gebruikt om verstoringen in de ER calciumopslag te detecteren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een Gaussia luciferase SERCaMP om ER calciumhomeostase in vitro en in vivo te onderzoeken.

Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Leer anastasis detecteren in vivo met de CaspaseTracker biosensor in Drosophila melanogaster. Deze methode maakt het mogelijk om celherstel na apoptose te volgen in levende organismen.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Meer video's verkennen