Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Het algemene doel van deze procedure is om de omkering van het celdoodproces na caspase-activering in levende dieren te detecteren en te volgen met behulp van Drosophila melanogaster als model. In reactie op een doodsstimulus ondergaan cellen geprogrammeerde celdood zoals apoptose, wat traditioneel is beschouwd als een onomkeerbare cascade die leidt tot celdood. Interessant genoeg kunnen sommige stervende cellen echter de celdoodproces omkeren, zelfs in een late fase, na verwijdering van de doodsstimulus.

Door een nieuw ontdekt celherstelfenomeen genaamd anastasis. Levende celmicroscopie toont aan dat apoptotische stervende cellen unieke morfologische kenmerken vertonen, zoals pleompjeblaasjes in het plasmamembraan, nucleaire condensatie en celkrimp. Over het algemeen wordt verwacht dat deze cellen zullen sterven.

Echter, na het wassen en incuberen van de stervende cellen met vers medium, ondergaan ze anastasis, herstellen en kunnen later delen. Het is moeilijk om anastasis in levende dieren te detecteren en te volgen omdat de herstelde cellen morfologisch niet te onderscheiden zijn van de omringende gezonde cellen. Om dit probleem op te lossen, werd het CaspaseTracker biosensor-systeem voor zoogdieren ontwikkeld om de cellen te identificeren en te volgen die het celdoodproces omkeren na executie of caspase-activering, het kenmerk van apoptose.

Dit biosensor-systeem bestaat uit twee componenten: de caspase-activatiebare transactivator, rtTA, en de Cre LoxP-gebaseerde rtTA-activiteitsreporter. In gezonde cellen, zonder caspase-activiteit, is rtTA verbonden aan een plasmamembraan-anker via een caspase-splitsbare DEVD-linker. Omdat rtTA als zodanig niet kan transloceren van het cytosol naar de kern, blijft de rtTA-reporter inactief.

Echter, bij activering als reactie op celdood-inductie, splitsen caspasen de DEVD-linker, waardoor rtTA vrijkomt om naar de kern te transloceren en de rtTA-reporter activeert. Eenmaal in de kern bindt rtTA zich aan het tet-responselement, of TRE, en activeert de expressie van Cre-recombinase, wat leidt tot een onomkeerbare recombinatiegebeurtenis die het stopcodon-cassette tussen de CAG-promotor en de coderende sequenties voor het rode fluorescente eiwit DsRed verwijdert. Dit resulteert in permanente expressie van DsRed, wat dient als permanente fluorescente marker voor cellen die levend kunnen blijven na het hebben ervaren van caspase-activiteit, evenals hun nakomelingen.

Levende cel-confocale microscopie toont aan dat na tijdelijke celdood-inductie, de CaspaseTracker biosensor-cellen DsRed tot expressie brengen tijdens en na hun herstel, en onderscheiden ze zich daarom van de niet-herstelde cellen, aangegeven met witte pijlen, evenals de controle-biosensor-cellen die niet werden blootgesteld aan de celdood-stimulus. Geprogrammeerde celdood, zoals apoptose, wordt over het algemeen als onomkeerbaar beschouwd omdat het wordt uitgevoerd door een wilde en massale celvernietiging. Echter, we ontdekken dat stervende cellen daadwerkelijk kunnen herstellen, zelfs in een late fase die als het punt van geen terugkeer wordt beschouwd, zoals na de afgifte van cytochroom c, caspase-3-activering, DNA-schade, pleompjeblaasjes in het plasmamembraan, celkrimp en de vorming van apoptotische lichaampjes.

We noemden deze omkering van het celdoodproces anastasis, wat betekent "opkomst tot leven" in het Grieks. Door gebruik te maken van levende celmicroscopie, kunnen we anastasis in gekweekte cellen observeren. Het is echter technisch uitdagend om anastasis in levende dieren waar te nemen, omdat de herstelde dode cel eruit kan zien als normale gezonde cellen die helemaal geen celdood hebben geprobeerd.

Daarom ontwikkelden we een CaspaseTracker biosensor-systeem om anastasis in levende dieren te detecteren en te volgen. De Drosophila-versie van het CaspaseTracker-systeem is een dubbele biosensor die bestaat uit twee componenten: de caspase-activatiebare transcriptiefactor, GAL4, en de GAL4-activiteitsreporter, bekend als G-TRACE. In de cellen zonder caspase-activiteit, is de gisttranscriptiefactor, GAL4, verbonden aan een plasmamembraan-ankerdomein via een caspase-splitsbare DQVD-linker.

Bij caspase-activering splitsen geactiveerde caspasen de DQVD-linker om GAL4 vrij te maken, dat vervolgens naar de kern transloceert om de G-TRACE-reporter te activeren. De nucleaire GAL4 bindt zich aan de specifieke stroomafwaartse activerende sequenties, afgekort als UAS, om de tijdelijke expressie van RFP te activeren, wat dient als de reporter van recente of huidige caspase-activiteit totdat de caspase en de GAL4-activiteit stoppen en het RFP-eiwit wordt afgebroken. GAL4 activeert ook de expressie van de FLP-recombinase, wat leidt tot een recombinatiegebeurtenis die het stopcassette verwijdert tussen het ubiquitine, afgekort als Ubi, promotor en de coatingsequenties voor het nucleair-gerichte GFP.

Dit resulteert in permanente expressie van nucleair GFP, wat dient als een permanente marker voor cellen die caspase-activiteit hebben ervaren maar levend blijven, evenals hun nakomelingen. Dit systeem kan dus cellen met lopende of recente caspase-activiteit identificeren door het tijdelijke RFP-signaal en voorbije caspase-activiteit met het permanente GFP-signaal. Een controle-biosensor heeft de mutatie DQVA op de caspase-splitsplaats, wat ongevoelig is voor caspase-activiteit.

Caspase-gevoelige GAL4 maagdelijke vrouwtjesvliegen werden gekruist met G-TRACE jonge mannetjesvliegen, of omgekeerd, om de CaspaseTracker-vliegen te genereren. Om de omkeerbaarheid van het celdoodproces na caspase-activering te testen, worden de vliegen eerst blootgesteld aan tijdelijke, celdood-inducerende omgevingsstress, zoals koudschok of eiwitgebrek. Vervolgens worden de gestreste vliegen teruggezet in normale kweekomstandigheden voor herstel.

Weefsels werden verkregen uit de eicellen in de eierstokken van de controle-, gestreste of herstelde vliegen. De monsters werden onderworpen aan confocale microscopie om de fluorescente signalen van de CaspaseTracker biosensor te detecteren. Om te beginnen, worden anesthetiseerde, recent uitgekomen caspase-gevoelige DQVD GAL4-vliegen met kooldioxide gebruikt en met een penseel worden