Name: Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer antilichamen kovalent immobiliseren op cellulose papieren schijven met glutaraldehyde kruisverbinding voor kleurimetrische immunoassays. Deze methode ondersteunt point-of-care diagnostiek met lage kosten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Singapore, via de Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).

1. Enten Amine functionele groepen op Cellulose papier Discs <ol><li> Bereid een vierkant stuk papier met een afmeting van 1 cm x 1 cm en 100 papierschijven gemaakt van rang No. 1 cellulose papier met een diameter van 6,0 mm (filtreerpapier gemiddeld-stroom) met een perforator. </li><li> Om -NH2 groepen af te leiden op het papier schijven, meng 1 ml APS en 10 ml aceton in een 50 ml glazen fles in de zuurkast. Voeg papierschijven aan de vers bereide APS mengsel van reagentia, en incubeer gedurende 5 uur met orbitaal roeren (200 opm) bij kamertemperatuur 32. Let op: Behandel APS en aceton in de zuurkast. </li><li> Giet overtollige oplossing uit de 50 ml glazen fles in een container organisch afval. </li><li> Voeg 10 ml aceton aan de glazen fles, meng en decanteer volledig om eventueel niet gereageerd APS en andere onzuiverheden te verwijderen. Herhaal deze stap tweemaal. </li><li> Spreid de papieren schijven op het papier handdoek en plaats in een 110 ° C oven gedurende 3 uur. laat depapierschijven afkoelen. Bewaar de schijven in een 50 ml centrifugebuis bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) voor het enten van aminegroepen controleren de cellulose vierkant papier, zoals hieronder beschreven (figuur 3A). <ol><li> Zet de computer en open de FTIR spectroscopie instrument. </li><li> Open de software voor FTIR spectroscopie. </li><li> Ga naar &#39;Measurement → Initialize&#39;. De rechthoeken voor &#39;BS: KBr&#39;: zal &#39;Lamp Infrared&#39; en &#39;Laser&#39; groen wanneer de initialisatie is voltooid. </li><li> Kies &#39;Data&#39; onder de rechthoeken, en selecteer &#39;% Overbrenging &quot;,&quot; Happ-Genzel&#39;, &#39;45&#39;, &#39;4.0&#39; en &#39;Min: 400, Max: 4000&#39; voor &#39;Measurement Mode&#39;, &#39;apodisering&#39;, &#39; Nee. scans &#39;,&#39; Resolution &#39;en&#39; Range (cm-1) &#39;. </li><li> Klik op &#39;Measure&#39;. </li><li> Selecteer &#39;Data file&#39; voor de achtergrond van gegevens. Schrijvenbeneden de commentaren. </li><li> Klik op &#39;BKG&#39; om de basislijn voor de achtergrond te krijgen. </li><li> Bevestig het vierkant papier op de film monsterhouder. </li><li> Selecteer &#39;Data file&#39; voor de steekproef gegevens. Noteer de opmerkingen. </li><li> Klik op &#39;Voorbeeld&#39; om de spectra van het monster te verkrijgen. </li><li> Sluit de FTIR spectroscopie toepassing en schakel de computer uit. </li></ol></li><li> Herhaal de bovenstaande stappen (stappen 1,1-1,6) amine-gefunctionaliseerde rang No. 113 vierkante cellulose papier en schijven (fast-flow filtreerpapier) te bereiden, en het verkrijgen van de FTIR-spectra van de rang No. 113 vierkante papier (Figuur 3B). </li></ol> 2. Covalente immobilisatie van antilichamen op Amine-gefunctionaliseerde Cellulose Paper Discs <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig1.jpg" /> Figuur 1. Covalente immobilisatie van antilichamen op twee manieren.A. Antilichamen geïmmobiliseerd op met amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met perjodaat oxidatie. Het koolhydraat residuen werden geoxideerd met natriumperjodaat tot aldehyde functionele groepen produceren. Vervolgens werden de geoxideerde antilichamen geladen amine-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven. B. De antilichamen werden vervolgens geïmmobiliseerd op met amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met glutaaraldehyde. Het amine gefunctionaliseerde cellulose papier schijven werden ondergedompeld in 0,05% glutaaraldehyde oplossing voor aldehydegroepen kennismaken met de papieren schijven. Na het wassen werden antilichamen op het aldehyde gefunctionaliseerde papier discs geladen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Immobiliseren antilichamen on-amine gefunctionaliseerde cellulose papier schijven door middel van perjodaat oxidatie (Figuur 1A). <ol><li> Meng 1 pl 2,5 mM natrium periodate met 2 pi 0,1 mg / ml konijn anti-humaan IgG-FITC en 7 ui 100 mM pH 5,5 acetaatbuffer in een 1,5 ml buis en incuberen van het mengsel in het donker gedurende 30 min. LET OP: Volg deze volume verhouding meer geoxideerd antilichamen te bereiden indien nodig. Het volume verhouding van de concentratie van natriumperjodaat en konijn anti-humaan IgG-FITC optimaliseren. </li><li> Verdun de bovenstaande antilichaamoplossing met 30 ui 50 mM fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4) tot een eindvolume van 40 pi. </li><li> Bereid drie amine-gefunctionaliseerde medium-flow filter papier schijven en drie-amine gefunctionaliseerde fast-flow papieren schijven (zoals beschreven in paragraaf 1). <ol><li> Belasting 5 pi van de natriumperjodaat geoxideerd konijn anti-humaan IgG-FITC op elk medium stroomfilter papieren schijf en 8 pi op elke fast-flow filterpapier disk. Houd deze papieren schijven in het donker gedurende één uur bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Was beide van de papieren schijf met 0,2 ml wassen buffer (50 mM Tris buffer met 0,15 M NaCl en 0,05% surfactant, pH 7,4). Herhaal het wassen drie keer. </li><li> De fluorescentie beelden door een moleculaire fluorescentie imager om de aanwezigheid van antilichamen te identificeren op elke cellulosepapier schijf 32. Gebruik lege papierschijven (behandeld met dezelfde concentratie van antilichamen bij afwezigheid natriumperjodaat) als controle (Figuur S1 figuur S3). OPMERKING: Bij experimentele optimalisering, de concentratie van één parameter die moet worden geoptimaliseerd en de concentraties van alle andere parameters vast. Een hoge fluorescentie-intensiteit verhoogt de hoeveelheid invangantilichamen die zijn geïmmobiliseerd op de cellulose papierschijven. </li></ol></li><li> Immobiliseren antilichamen op amine gefunctionaliseerd cellulose papier schijven door middel van glutaaraldehyde (Figuur 1B). <ol><li> Voeg de drie APS behandeld medium-flow filter papier schijven en de drie fast-flow filterpapier discs (described in paragraaf 1) tot 2 ml van 50 mM PBS (pH 7,4) die 0,05% glutaaraldehyde bevat gedurende 1 uur met orbitaal roeren bij kamertemperatuur. Let op: Behandel glutaraldehyde in de zuurkast. </li><li> Plaats drie schijven elk in twee 1,5 ml centrifugebuizen. Voeg 1 ml gedeïoniseerd (DI) water aan elke buis en schud de buizen gedurende 10 sec. Verwijder het water door het opzuigen met een pipet. Herhaal dit nog twee keer om eventuele niet-gereageerd glutaaraldehyde te verwijderen. </li><li> Belasting 5 pl 25 ug / ml konijn anti-humaan IgG-FITC (vangantilichaam) op beide aldehyde gefunctionaliseerde medium stroomfilter papieren schijf en voeg 8 pi op elk aldehyde gefunctionaliseerde fast-flow filterpapier disk. Incubeer in het donker gedurende ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 ui 50 mM PBS (pH 7,4) aan elk papieren schijf zonder de antilichamen en incubeer gedurende 40 min voor het amine aldehyde reactie. </li><li> Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. HerhaalWas tweemaal. </li><li> Fotografeer de fluorescentie-beelden door middel van een fluorescentie moleculaire imager om te controleren op de aanwezigheid van antilichamen op elke cellulose papieren schijf 33. Gebruik blanco papier schijven als een controle. Opmerking: In figuur 4, &quot;0&quot; staat voor de blanco papieren schijf die met dezelfde concentratie van FITC-antilichaam in de afwezigheid van glutaaraldehyde werd behandeld; in figuur 5A, werden de lege papierschijven behandeld met glutaraldehyde, maar geen FITC-antilichamen werden op de papierschijven geplaatst. </li></ol></li><li> Droog de papierschijven (van 2.1 en 2,2) bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Blokkeer de papierschijven met 15 pl blokkerende buffer (10% magere melkpoeder in 50 mM Tris buffer, pH 7,4, met 0,15 M NaCl) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Load 5 ul en 8 gl peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG in PBS (1: 10.000) op middelgrote stroming en fast-flow filter papierschijven respectievelijk. Incubeer30 min in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer. Opmerking: Het is niet nodig de wasbuffer verwijdert de resultaten niet worden beïnvloed door de buffer. </li><li> Laad een 10 pi mengsel van 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) en waterstofperoxide oplossing op elke schijf. </li><li> Neem beelden van de papieren schijven met een digitale camera of smartphone na 5 min incubatie. Opmerking: In figuur 5B, &quot;0&quot; staat voor de papierschijven die werden behandeld met glutaraldehyde, gevolgd door het laden antilichaam-HRP (mierikswortelperoxidase) conjugaat in afwezigheid van FITC-antilichaam. </li></ol> 3. Papier-gebaseerde ELISA voor IgG Detection <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave van de papieren ELISA for IgG detectie. invangantilichamen werden covalent geïmmobiliseerd op de aldehyde-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met glutaaraldehyde. De cellulose papierschijven werden geblokkeerd met blokkerende buffer. Doelwit IgG werd vervolgens toegevoegd aan de schijven, gevolgd door het laden van HRP-geconjugeerde antilichamen signaal. Tenslotte werd de TMB en waterstofperoxide mengsel oplossing op elk papieren schijf voor de kleur uitlezing geladen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Voeg 5 ml 0,05% glutaaraldehyde oplossing (bereid in 50 mM PBS, pH 7,4) in een 20 ml glazen fles. Dompel 15 amine-gefunctionaliseerde medium stroomfilter papierschijven in deze oplossing en bewaren 1 uur onder schudden bij kamertemperatuur. <ol><li> Tegelijkertijd Herhaal stap 3.1 tot en met nog eens 15 aldehyde gefunctionaliseerd fast-flow filter papier discs te bereiden. Let op: Behandel glutaraldehyde in de rookkap. </li></ol></li><li> Om ongereageerde glutaaraldehyde uit de papierschijven verwijderen, plaatst het 15 medium stroomfilter papierschijven in een 15 ml centrifugebuis, en de 15 snelle stroomfilter papierschijven in een 15 ml centrifugebuis. Voeg 5 ml van DI water aan elke buis en schud de buizen gedurende 10 sec. Verwijder het water door het opzuigen met een pipet. Herhaal dit twee keer om eventueel niet gereageerd glutaaraldehyde te verwijderen. </li><li> Droog de papieren schijven in een 37 ° C oven. </li><li> Voeg 5 ul en 8 pi 0,025 mg / ml muizen-IgG-Fc-fragment antilichamen tegen elk van de medium-stroom en fast-flow filter papierschijven respectievelijk, en incubeer gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 10 ul van 50 mM PBS (pH 7,4) aan elk papieren schijf zonder de antilichamen en incubeer gedurende 40 min voor het amine aldehyde reactie. </li><li> Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer. </li><li> Droog de papierschijven in een oven op 37 ° C. </li><li> Blokkeer de papieren schijven wi 15 pl blokkerende buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was beide papieren schijf met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer. </li><li> Run IgG-normen. <ol><li> Belasting 10 pl diverse IgG concentraties (bijvoorbeeld 0, 10, 125, 250 en 500 ng / ml in PBS) op elke schijf in drievoud. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li></ol></li><li> Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer. </li><li> Belasting 10 gl HRP geconjugeerd muis-IgG-Fc-fragment antilichamen (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer. Opmerking: Het is niet nodig de wasbuffer verwijdert de resultaten niet worden beïnvloed door de aanwezigheid van buffer. </li><li> Laad een 10 pi mengsel van TMB en waterstofperoxide op elke schijf. </li><li> Take beelden van al het papier schijven met een digitale camera of smartphone na 5 min incubatie. Opmerking: In figuur 6A, &quot;0&quot; staat voor papierschijven behandeld met invangantilichaam immobilisatie, en het antilichaam-HRP / TMB oplossing zonder serum IgG. </li><li> Analyseer de intensiteit van elke papieren schijf in het beeld van Image J. <ol><li> Omzetten van de foto&#39;s genomen in stap 3.15 tot &#39;tif&#39; format. </li><li> Open &#39;Afbeelding J&#39; software. </li><li> Ga naar &#39;Bestand → Open&#39;, kies dan de afbeelding om te analyseren. </li><li> Klik op de knop vorm &#39;Oval&#39;. </li><li> Ga naar &#39;Beeld → Type → 32 bit&#39;. </li><li> Ga naar &#39;Edit → Omkeren&#39;. </li><li> Ga naar &#39;Analyze → Measure&#39;. </li><li> Kopieer en analyseren van de gegevens in een spreadsheet. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+HIV-1+by+reverse-transcription%2C+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP).</a> J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+telemedicine+for+developing+regions%3A+camera+phones+and+paper-based+microfluidic+devices+for+real-time%2C+off-site+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis.</a> Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).</li>
<li>Lode, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+immunotesting%3A+approaching+the+analytical+performance+of+central+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods.</a> Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).</li>
<li>Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+for+on-site+monitoring+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Perspectives for on-site monitoring of progesterone.</a> Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).</li>
<li>Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+developing+technologies+for+monitoring+agents+of+bioterrorism+and+biowarfare%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).</li>
<li>Li, X., Tian, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+patterned+paper+sizing+for+fabrication+of+paperbased+microfluidic+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors.</a> Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).</li>
<li>Nie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+sensing+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 10, 477-483 (2010).</li>
<li>Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenerated+chemiluminescence+detection+in+paper-based+microfluidic+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors.</a> Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).</li>
<li>Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+flow+immunoassay+%28VFA%29+biosensor+for+a+rapid+one-step+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay.</a> Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-based ELISA.</a> Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).</li>
<li>Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+red+blood+cells+agglutination+in+antibody-treated+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper.</a> Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).</li>
<li>Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+and+biocompatible+cellulose+functionalization+for+covalent+antibody+immobilization+on+immunoassay+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes.</a> J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).</li>
<li>Kong, F., Hu, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecule+immobilization+techniques+for+bioactive+paper+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).</li>
<li>Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMC-modified+cellulose+biointerface+for+antibody+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation.</a> Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).</li>
<li>Yu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctional+paper+via+covalent+modification+of+cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Biofunctional paper via covalent modification of cellulose.</a> Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).</li>
<li>Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cellulose+membranes+with+1%2C1%E2%80%B2-carbonyldiimidazole+or+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+as+a+basis+for+the+development+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors.</a> Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).</li>
<li>Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreactive+cellulose+membrane+-+a+novel+matrix+for+covalent+immobilization+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules.</a> J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).</li>
<li>Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmobilization+of+unmodified+carbohydrates+on+activated+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface.</a> J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).</li>
<li>Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+crystalline+cellulose+surfaces+through+the+chemoenzymatic+modification+of+xyloglucan%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).</li>
<li>Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+paper+surfaces+for+the+rapid+hybridization+of+DNA+through+capillary+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport.</a> Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).</li>
<li>Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-enzymatic+Assembly+of+Clickable+Cellulose+Surfaces+via+Multivalent+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22ChemSusChem%22%5BJournal%5D)">Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides.</a> ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).</li>
<li>Filpponen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+method+for+modular+surface+modification+of+cellulosic+materials+in+aqueous+medium+by+sequential+%26%2334%3Bclick%26%2334%3B+reaction+and+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential &#34;click&#34; reaction and adsorption.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).</li>
<li>Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobactericidal+porphyrin-cellulose+nanocrystals%3A+synthesis%2C+characterization%2C+and+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties.</a> Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).</li>
<li>Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+immunoassay+on+a+3D+microfluidic+paper-based+device%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device.</a> Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).</li>
<li>Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+paper-based+electrochemiluminescence+immunodevice+for+multiplexed+measurement+of+biomarkers+and+point-of-care+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing.</a> Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+chemiluminescence+ELISA%3A+lab-on-paper+based+on+chitosan+modified+paper+device+and+wax-screen-printing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing.</a> Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).</li>
<li>Koev, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+covalent+fabrication+of+a+paper+device+and+its+application+in+sensitive+chemiluminescence+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay.</a> Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).</li>
<li>Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+based+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+C-reactive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein.</a> Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).</li>
<li>Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+modification+of+cellulose+paper+with+amino+groups+for+catalytic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications.</a> J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).</li>
<li>Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose%3A+fascinating+biopolymer+and+sustainable+raw+material%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).</li>
<li>Fernandes, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+antimicrobial+and+biocompatible+bacterial+cellulose+membranes+obtained+by+surface+functionalization+with+aminoalkyl+groups%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pharos+FX+plus+molecular+imager+instructions%2C+Catalog+Number+170-9460%22">Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460</a>. , (2005).</li>
<li>Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminosilane-grafted+cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22BioResourses%22%5BJournal%5D)">Aminosilane-grafted cellulose.</a> BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+multiplexed+and+quantitative+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry.</a> Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).</li>
<li>Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+conventional+immunoassay+%28ELISA%29+with+a+surface+plasmon+resonance-based+biosensor+for+IGF-1+detection+in+cows%27+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk.</a> Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).</li>
<li>Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+chemical+and+biological+sensors%3A+Engineering+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects.</a> Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Directe coating van affiniteit gezuiverd geit-anti-muis IgG-Fc capture antilichaam op niet-gemodificeerde cellulose papierschijven werd uitgevoerd IgG concentraties te detecteren. De resultaten gaven aan dat verdere fixatie van de invangantilichamen vereist voor reproduceerbaarheid. Het silaan techniek werd met succes gebruikt voor aminefunctionele groepen te introduceren aan de cellulose papierschijven 34. De concentratie van APS beïnvloedt de immobilisatie van antilichamen. Derhalve werd de hoeveelheid APS ...

De point-of-care testen (POCT) diagnostisch onderzoek is belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor therapeutische, gepersonaliseerde geneeskunde, en thuiszorg 1. Cellulose papier worden veel gebruikt als platforms immunoassays, omdat ze goedkoop toegankelijk, en waarvan de consument 2. Bovendien, de poreuze structuur van cellulose papier bezit het vermogen om vloeistofstroom rijden zonder extra energie impact. Registraties van papieren bioanalyse kan al in de 20 e eeuw, wanneer het papier chromatografie eerst werd uitgevonden in 1952. Het meest voorkomende voorbeeld is immunochromatographic testen 3, zoals zwangerschap en diabetes teststrips worden gevonden. Deze tests leveren relatief snelle analyse tijden en goedkoop analyse 4. Vanwege hun eenvoud, zijn deze conventionele papierstrook testen op grote schaal gebruikt in diagnostische POCT 5. Detectiemethoden waaronder colorimetrische 6, electrochemische 7 en 8 elektrochemiluminescentie methoden zijn gemeld doelen in biologische monsters te meten. Naast deze kwantitatieve methoden, een betrouwbare werkwijze voor het immobiliseren van antilichamen op cellulose papier is ook belangrijk voor de ontwikkeling van diagnostica. Niet-specifieke adsorptie is de belangrijkste strategie voor het modificeren van antilichamen op het oppervlak van de papieren inrichtingen 9, 10 maximale bindingscapaciteit hun doelen na immobilisatie te garanderen. De eerdere studie toonden aan dat antilichamen die zijn geadsorbeerd cellulose papier kan desorberen uit de vezels 11 met 40%. Aldus kan directe adsorptie van antilichamen op cellulose geen reproduceerbare resultaten 12. Covalente immobilisatie van antilichamen die zijn geënt op het papieroppervlak is een alternatieve methode om een doeltreffend papieren bioassays 13. Diverse werkwijzen zijn beschreven voor de modificatie van cellulose 14, 15 </sup&gt;. Idealiter antilichamen hun oorspronkelijke functionaliteit na immobilisatie 12 handhaven. Carbonyldiimidazool gecombineerd met 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluorboraat 16; 1-fluor-2-nitro-4-azidobenzene door een UV gebaseerde activeringsstrategie 17, 18; een chemoenzymatic strategie gebaseerd op xyloglucan modificatie 19; een 1,4-phenylenediisothiocyanate koppelingsmiddel 20; heteropolysaccharide oxidatie 21 klik chemie 22; en kationische porfyrinen 23 zijn gebruikt voor het covalent immobiliseren biomoleculen cellulose papier. Chitosan gemodificeerd papier is gebruikt papier immunodevices 24-26 ontwikkelen omdat het overvloedig en biocompatibel 27. Chitosan kationische en hecht sterk aan anionische cellulose 27. De capture antilichamen worden geïmmobiliseerd op het papier door chitosan coating en glutaaraldehyde verknoping. Perjodaat oxidatie is een andere methode voor het enten van de kapiteinUre antilichamen op het cellulose papier 28. In deze werkwijze wordt natriumperjodaat gespot op het papier 1,2-dihydroxy (glycol) -groepen in cellulose direct omzetten aldehydegroepen. De aldehydegroepen worden dan gebruikt om covalente bindingen tussen polysacchariden en antilichamen 28 te vormen. Hoewel de fabricage eenvoudig is, is het moeilijk om volledig spoelen natriumperjodaat. Ongewassen natriumperjodaat kunnen verdere oxidatie van de antilichamen die zijn geïmmobiliseerd op het cellulose papier veroorzaken, waardoor de activiteit en stabiliteit van de antilichamen N -. (3-dimethylaminopropyl) - N-ethylcarbodiimide hydrochloride en N-hydroxysuccinimide verknopers worden ook gebruikt om covalent immobiliseren antilichamen op electrospun poly-L-melkzuur en celluloseacetaat nanovezels voor de ontwikkeling van nanovezel gebaseerde testen 29. In deze studie werd een silaankoppelingsmiddel techniek om aminefunctionele groepen op cellulos entene paper discs. Deze techniek helpt om de oorspronkelijke poriegrootte wicking en filtratiesnelheid van cellulose filtreerpapier behouden, waardoor maximale verticale doorstroming in immunoassays. Het silaan koppelingsreagens techniek is op grote schaal gebruikt in biosensoren om substraatoppervlakken met secundaire aminegroepen functionaliseren, gevolgd door verdere modificatie gebruikt biomoleculen. Het enten van aminegroepen op het matrijsoppervlak omvat een condensatiereactie tussen -OH-groepen van het organofunctionele silaan agenten en matrixsubstraat 30. De cellulose papier schijven werden gefunctionaliseerd met amine groepen op silaankoppeling tot en met 3-aminopropyltrimethoxysilaan (APS) 31. Dit werd gevolgd door het covalent immobiliseren invangantilichamen op twee verschillende manieren. De eerste methode betrokken binding van perjodaat geoxideerd invangantilichamen het amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven. De tweede methode gebruikt glutaaraldehyde als een verknopingsmiddel om de vangst Antibodi hechtenes aan de amine-groep gefunctionaliseerd cellulose papier discs. De aanwezigheid van invangantilichamen werd bevestigd door konijn anti-humaan IgG-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), met fluorescentie- moleculaire imager. De bindingsactiviteit van konijn-anti-humaan IgG-FITC anti-konijnen IgG geit werd eveneens door peroxidase substraat. De effecten van verschillende concentraties natriumperjodaat, glutaaraldehyde en invangantilichamen onderzocht. De toepassing test van de geïmmobiliseerde capture antilichaam werd succesvol uitgevoerd door de bepaling van IgG serum.

<table><tbody><tr><td>Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper)</td><td>GE Healthcare Pte Ltd Singapore&nbsp;</td><td>1001 110</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper)</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>1113-320</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>G6257</td><td>Grade II, 25% in H2O</td></tr><tr><td>Surfactant</td><td>Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum album&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk powder</td><td>Louis Fran&ccedil;ois&nbsp;</td><td></td><td>Verpakt door Kitchen Capers, Singapore</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Sodium periodate</td><td>Merck</td><td>106597</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>CALBIOCHEM</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS, bevattend 137&nbsp;mmol/L NaCl, 2.7&nbsp;mmol/L KCl, 8.0&nbsp;mmol⁠/⁠L Na2HPO4 en 1.5&nbsp;mmol/L KH2PO4, wordt bereid met water en aangepast tot pH 7.4 met 0.1&nbsp;mol/L NaOH of 0.1&nbsp;mol/L HCl</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore</td><td>9005-68</td><td></td></tr><tr><td>Mengsel van TMB en waterstofperoxide oplossing&nbsp;</td><td>1-Step ultra TMB-ELISA oplossing, Thermo Scientific Pierce</td><td>34029</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Konijn anti-menselijk IgG-FITC</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2278</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2030</td><td></td></tr><tr><td>Affiniteit gezuiverde geit anti-Muis IgG-Fc coating antilichaam</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131A</td><td></td></tr><tr><td>Muis referentie serum</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>RS10-101-5</td><td>9.5 mg/ml</td></tr><tr><td>HRP geconjugeerd geit anti-muis IgG-Fc detectie antilichaam</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131P</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fourier transform infrarood spectrofotometer</td><td>Shimadzu IR Prestige-21&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie moleculaire imager</td><td>Pharos FXTM plus moleculaire imager, Bio-Rad, Singapore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>NUVE FN500</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Turbo mixer VM-2000</td><td>MYC LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RGB, gratis download</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

covalente binding van antilichamen aan cellulose paper discs en hun toepassingen in het blote oog colorimetrisch immuniteitsonderzoeken

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Dit rapport bevat twee methoden voor de covalente immobilisatie van capture antilichamen op cellulose filterpapier graad No. 1 (gemiddeld-flow filter papier) discs en rang No. 113 (fast-flow filter papier) discs. Deze cellulose papierschijven werden geënt met functionele aminegroepen door een silaankoppelingsmiddel techniek voor de antilichamen geïmmobiliseerd daarop. Perjodaat oxidatie en glutaaraldehyde verknopende werkwijzen werden gebruikt om invangantilichamen enten op de cellulose papierschijven. Om de maximale bindingscapaciteit van de invangantilichamen hun doelen na immobilisatie te waarborgen, werden de effecten van verschillende concentraties van natriumperjodaat, glutaaraldehyde en invangantilichamen op het oppervlak van de papierschijven onderzocht. De antilichamen die aan de amine-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven werden bekleed door een glutaaraldehyde verknopingsmiddel vertoonden verbeterde bindingsactiviteit naar het doel ten opzichte van het perjodaat oxidatiewerkwijze. IgG (in muizen referentieserum) werd gebruikt als een meetobject in deze studie de toepassing covalent geïmmobiliseerde antilichamen getest met glutaaraldehyde. Een nieuwe papieren, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) werd met succes ontwikkeld en gevalideerd voor de bepaling van IgG. Deze methode vereist geen apparatuur vereist en kan 100 ng / ml IgG te detecteren. De fast-flow filter papier was gevoeliger dan het filterpapier medium-flow. De incubatietijd van deze assay was kort en vereist kleine monstervolumes. Dit blote oog, kan colorimetrische immunoassay worden uitgebreid naar andere doelen die worden geïdentificeerd met conventionele ELISA gedetecteerd.

<img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig3.jpg" /> Figuur 3. Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectra van onbehandelde en behandelde APS-medium stroomfilter vierkant papier (A) en fast-flow filter vierkant papier (B). A. De spectra voor onbehandelde medium stroomfilter vierkant papier was vergelijkbaar met dat van APS behandelde medium stroomfilter vierkant papier. De toename van de intensiteiten op banden van ...

In dit manuscript worden periodaatoxidatie- en glutaraldehyde-crosslinking-methoden voor covalente immobilisatie van antilichamen op papierschijven gepresenteerd. De bindingsactiviteit van geïmmobiliseerde antilichamen werd geëvalueerd. Op basis van deze resultaten werd een glutaraldehyde-crosslinking-methode gebruikt om een nieuwe papiergebaseerde immunoassay voor immunoglobuline G (IgG) detectie te ontwikkelen.

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Het algemene doel van deze methodologie is het stabiliseren van antilichamen en eiwitten op een cellulosematrix om de ontwikkeling van een colorimetrische immunoassay met het blote oog te faciliteren, wat nuttig kan zijn voor point-of-care-diagnostiek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de point-of-care-diagnostiek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt bij het stabiliseren van eiwitten op cellulose, wat de ontwikkeling van goedkope, op papier gebaseerde diagnostische assays mogelijk maakt.De procedure zal worden gedemonstreerd door Gloria Chang, een student uit mijn laboratorium. Begin met het klaarmaken van één vierkant stukje papier met afmetingen van één centimeter bij één centimeter. Bereid daarnaast 100 papieren schijfjes voor met een diameter van 6,0 millimeter, gemaakt van Whatman grade number one cellulosepapier met behulp van een perforator.Om aminogroepen op de papieren schijfjes aan te brengen, mengt u één milliliter APS en 10 milliliter aceton in een glazen fles van 50 milliliter in de zuurkast. Voeg papieren schijfjes toe aan het vers bereide APS-reagensmengsel. Incubeer de schijfjes vervolgens gedurende vijf uur in het mengsel onder orbitale menging bij kamertemperatuur.Giet het overtollige oplosmiddel uit de glazen fles van 50 milliliter in een container voor organisch afval. Voeg 10 milliliter aceton toe aan de glazen fles, meng goed en giet volledig af om alle ongereageerde APS en andere onzuiverheden te verwijderen. Herhaal deze stap twee keer.Verspreid de papieren schijfjes op het keukenpapier en plaats ze gedurende drie uur in een oven op 110 °C. Laat de papieren schijfjes afkoelen en bewaar ze vervolgens in een centrifugebuis van 50 mL bij kamertemperatuur. Gebruik Fourier-transform infraroodspectroscopie of FTIR om de enting van aminegroepen op het vierkante cellulosepapier te controleren.Open de software voor FTIR-spectroscopie. Ga naar 'measurement initialize'. Kies 'data' onder de rechthoeken en selecteer 'percent transmittance' als meetmodus.Kies vervolgens Happ-Genzel voor de apodisatie, stel het aantal scans in op 45, de resolutie op 4,0 en stel het bereik in van min 400 tot max 4.000. Klik op measure en selecteer vervolgens het gegevensbestand voor de achtergrondgegevens. Klik op BKG om de basislijn voor de achtergrond te bepalen.Bevestig vervolgens het vierkante papier op de houder voor de filmmonsters. Selecteer daarna het gegevensbestand voor de monstergegevens en klik op 'sample' om het spectrum van het monster te verkrijgen. Sluit de FTIR-spectroscopie-applicatie en schakel de computer uit.Voeg vijf milliliter van een 0,05% glutaraldehydelopping toe aan een glazen fles van 20 milliliter. Dompel 15 amine-gefunctionaliseerde medium flow filterpapier schijfjes in deze oplossing en laat deze gedurende één uur schudden bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap gelijktijdig om nog eens 15 aldehyde-gefunctionaliseerde fast flow filterpapier schijfjes voor te bereiden.Om niet-gereageerd glutaaraldehyde uit de papieren schijfjes te verwijderen, plaatst u eerst de medium flow filterpapier-schijfjes en de fast flow filterpapier-schijfjes in afzonderlijke centrifugebuisjes van 15 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter gedeïoniseerd water toe aan elk buisje en schud de buisjes gedurende 10 seconden. Verwijder het water door het met een pipet af te zuigen.Herhaal dit twee keer om alle niet-gereageerde glutaraldehyde te verwijderen. Droog de papieren schijfjes vervolgens in een oven op 37 °C. Zodra ze droog zijn, voegt u 5 µL muis IgG Fc fragment-antilichamen met een concentratie van 0,025 mg/mL toe aan de filterpapierschijfjes met medium flow en 8 µL aan de filterpapierschijfjes met fast flow.Na een incubatie van 20 minuten wordt aan elke papieren schijf 10 µL 50 millimolair PBS pH 7.4 toegevoegd zonder de antilichamen te verwijderen. Incubeer gedurende 40 minuten voor de amine-aldehydereactie. Was de papieren schijven met 0,2 mL wasbuffer op een papieren handdoek.Herhaal de wasstap drie keer. Na het drogen van de papieren schijfjes in een oven bij 37 °C, worden de papieren schijfjes 10 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met 15 µL blokkeringsbuffer. Was vervolgens elk papieren schijfje op een vel keukenpapier met 0,2 mL wasbuffer.Herhaal de wasstap drie keer. Voer vervolgens de IgG-standaarden uit. Breng 10 µL van verschillende IgG-concentraties in triplikaat aan op afzonderlijke schijfjes.Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de papieren schijfjes met 0,2 milliliters wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal de wasstap drie keer.Laad na de wasstappen 10 µL HRP-geconjugeerde muis IgG Fc-fragment antilichamen en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de papieren schijfjes met 0,2 mL wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal de wasbeurt drie keer.Breng ten slotte een mengsel van 10 µL TMB en waterstofperoxide aan op elke schijf. Maak na vijf minuten incubatie foto's van alle papierschijven met een digitale camera of smartphone en analyseer deze zoals besproken in het tekstprotocol. Hier worden de FTIR-spectra getoond van onbehandeld en APS-behandeld medium flow filterpapier en fast flow filterpapier.De toename in intensiteiten bij de banden van 902 en 1.170 cm⁻¹ en 1.210 tot 1.500 cm⁻¹ voor medium-flow filterpapier, evenals de karakteristieke pieken in het bereik van 972 tot 1.180 cm⁻¹ voor fast-flow filterpapier, toonden aan dat APS succesvol is gegraft op het cellulosepapier. De effecten van verschillende concentraties glutaaraldehyde op de immobilisatie van IgG FITC op de papieren schijfjes worden hier weergegeven. De optimale concentratie voor glutaaraldehyde is 0,05%. Op soortgelijke wijze worden de effecten van verschillende concentraties IgG FITC op de immobilisatie van IgG FITC op de papieren schijfjes gepresenteerd.Het verhogen van de belading en concentratie van IgG FITC verhoogt de hoeveelheid geïmmobiliseerd IgG FITC op de papieren schijfjes. Een verhoogde concentratie van geïmmobiliseerd IgG FITC verbetert echter de bindingscapaciteit met het antigeen niet. Hier worden de kalibratiecurves getoond voor de bepaling van IgG via een op papier gebaseerde ELISA.Antilichamen werden met het blote oog gedetecteerd bij een concentratie van één nanogram per milliliter IgG met behulp van deze assay op papierbasis. De concentratie van IgG-serum vertoonde een lineair verband met de colorimetrische intensiteit van nul tot 500 nanogram per milliliter wanneer elke stap gedurende één uur werd geïncubeerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe antilichamen op een cellulaire matrix kunnen worden geïmmobiliseerd voor de ontwikkeling van immunoassays.We kregen het eerste idee toen we werkten aan de ontwikkeling van goedkope diagnostische assays met een beperkte gevoeligheid. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van point-of-care-diagnostiek om de ontwikkeling van goedkope on-site diagnostische tests voor diverse pathogenen te verkennen.

covalent-binding-antibodies-to-cellulose-paper-discs-their

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates the detection of chemically conjugated antibody-antigen complexes via the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, or ELISA, technique. The captured antibody binds to the specific epitope of the antigen of the antibody-antigen conjugate, which can be later visualized using an enzyme-linked secondary antibody.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay to Verify Chemically-Coupled Antibody-Antigen Conjugates

The video demonstrates a paper-based immunoassay, involving amine-functionalized cellulose discs cross-linked with glutaraldehyde. Covalent immobilization of IgG-Fc-specific capture antibodies, followed by the introduction of immunoglobulin G and horseradish peroxidase-conjugated detection antibodies, results in a color change confirming the presence of immunoglobulin G.

A Paper-Based Immunoassay for the Detection of Immunoglobulin G

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Nanodeeltje-gebaseerde optische sondes zijn ontworpen als een voertuig voor het detecteren van antigenen met behulp van Raman en UV-Vis spectroscopie. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van dergelijke sondes voor een UV-Vis/Raman spectroscopie immunoassay op een manier die toekomstige multiplexing mogelijkheden kan integreren.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor de bereiding van latexkorrels voor assays met behulp van IgY-antilichamen voor antigeendetectie.

Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen

Om tegemoet te komen aan dringende behoeften op het gebied van dengue-diagnostiek, introduceren we hier een in de smartphone-app geïntegreerd Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) voor het kwantificeren van de Dengue NS1-antigeenconcentratie in klinische serum-/bloedmonsters. Deze innovatie verbetert de behandeling van dengue door te helpen bij de klinische besluitvorming in verschillende zorgomgevingen, zelfs in omgevingen met beperkte middelen.

Draagbare op papier gebaseerde immunoassay gecombineerd met smartphone-applicatie voor colorimetrische en kwantitatieve detectie van dengue NS1-antigeen

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van quantum dot nanobeads (QDNB) en de detectie van ziektebiomarkers met behulp van QDNB-gebaseerde lateral flow immunoassay strips. De testresultaten kunnen binnen 15 minuten kwalitatief worden beoordeeld onder UV-lichtverlichting en kwantitatief worden gemeten met behulp van een fluorescerende striplezer.

Fluorescerende laterale flow-immunoassay op basis van Quantum Dots nanobeads

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer antilichamen kovalent immobiliseren op cellulose papieren schijven met glutaraldehyde kruisverbinding voor kleurimetrische immunoassays. Deze methode ondersteunt point-of-care diagnostiek met lage kosten.

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken (Video) | JoVE Journal

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken

Meer video's verkennen