Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten
8 mei 2016
Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele celpopulaties te isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm die vervolgens kunnen worden gebruikt voor flowcytometrische analyse of een alternatieve manier van karakterisering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in mucosale immunologie, zoals hoe de microbiota de ontwikkeling van het darmimmuunsysteem beïnvloedt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat ze snel, reproduceerbaar zijn en geen moeizame percoll-gradienten vereisen.
Plaats om deze procedure te beginnen de muis met de rugzijde naar beneden en spuit de buik in met 70 procent ethanol, voer een laparotomie uit door opeenvolgend de huid en vervolgens de peritoneale fascia langs de ventrale middenlijn van de symphysis pubica tot de processus xiphoideus te snijden, waardoor de buikholte wordt blootgesteld. Scheid vervolgens de dunne darm van de maag door de pylorussfincter te doorknippen. Verwijder voorzichtig de dunne darm uit het peritoneum en verwijder het mesenteriale vet.
Om de dunne darm volledig te verwijderen, maak een tweede snede op de ileocecale junctie. Plaats de geïsoleerde dunne darm in vier graden Celsius RPMI-medium dat 10 procent FBS bevat om de celviabiliteit te maximaliseren. Verwijder voorzichtig grote stukken vet met gebogen forceps en wees voorzichtig om het darmweefsel zelf niet te scheuren tijdens het proces.
Om de darminhoud te verwijderen, canuleer het proximale uiteinde van de dunne darm met een 18 gauge voedingsnaald bevestigd aan een spuit en spoel de darm voorzichtig met 15 tot 20 milliliter koud PBS. Gebruik een schaar om de Peyer-plekken te verwijderen die zich aan de antimesenterische kant van de dunne darm bevinden en eruitzien als een meerlobbige witte massa. Plaats ze vervolgens in koud RPMI-medium dat vijf procent FBS bevat.
Snij vervolgens de dunne darm in segmenten van drie tot vier inch, verwijder het resterende vet door elke dunne darmsegment op een papieren handdoek gedrenkt in RPMI te rollen en gebruik een stomp mes om het vet van het weefsel te verwijderen. Het is van cruciaal belang om de volledige verwijdering van mesenteriaal vet strikt op te volgen om de levensvatbaarheid van lymfocyten te waarborgen, aangezien zelfs minimale stukjes vet de dood van cellen kunnen veroorzaken. Draai daarna het weefsel binnenstebuiten door de darmsegmenten te canuleren met gebogen forceps en het distale uiteinde van het weefsel vast te pakken, gebruik vervolgens een stel rechte forceps om het weefselsegment voorzichtig van het proximale uiteinde te verwijderen, waardoor het weefsel wordt omgekeerd.
Plaats de weefselsegmenten in een beker met 30 milliliter extractiemedium en een roerstaafje. Bevestig het deksel op de dop en roer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Het roeren moet krachtig zijn, maar niet turbulent.
Na 15 minuten, gebruik een stalen zeef om de weefselstukken te scheiden van het epitheel bevattende supernatant dat troebel zou moeten zijn. Roer de weefselstukken handmatig in RPMI-medium om het resterende extractiemedium weg te spoelen. Plaats vervolgens het weefsel op een droge papieren handdoek en draai het enkele keren om de verwijdering van resterend slijm te vergemakkelijken dat niet door het extractiemedium is bevrijd.
Plaats vervolgens de weefselfragmenten in een puntvijf milliliter buis met 600 microliters verteringsmedium. Hak het weefsel totdat de stukken niet meer aan de schaar plakken en de oplossing homogeen lijkt. Deze stap is cruciaal om een volledige enzymatische vertering van het weefsel te garanderen.
Het hakken van het weefsel totdat de stukken niet meer aan de schaar plakken en de oplossing homogeen lijkt, is cruciaal om zowel de celopbrengst als de reproduceerbaarheid van de resultaten te waarborgen. Voeg de gehakte dunne darm toe aan een beker met 25 milliliter verteringsmedium en roer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Halverwege de vertering, zuig het omhoog en neer met een serologische pipet om eventuele grote stukken weefsel te helpen breken.
Filter vervolgens het spijsverteringsweefsel door een 100 micrometer celzeef in een 15 milliliter buis. Spoel de zeef af met 20 milliliter RPMI-medium dat 10 procent FBS bevat. Daarna centrifugeer de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Decanteer voorzichtig het supernatant en hersuspenseer het pellet in één milliliter RPMI-medium dat 10 procent FBS bevat. Filter de hersuspensie door een 40 micrometer celzeef in een 15 milliliter buis. Spoel de zeef af met 20 milliliter RPMI dat 10 procent FBS bevat.
Centrifugeer vervolgens de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer voorzichtig het supernatant en hersuspenseer het pellet in één milliliter RPMI-medium dat twee procent FBS bevat. In deze procedure, breng de uitgesneden Peyer-plekken over naar een beker met 25 milliliter verteringsmedium en een roerstaafje.
Bevestig het deksel en draai gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Filter vervolgens de verteerde Peyer-plekken door een 40 micrometer celzeef in een 15 milliliter buis. Als er nog klontjes achterblijven, pers ze door de zeef met de platte kant van de plunjer van een ene milliliter spuit.
Spoel vervolgens de zeef af met 10 milliliter RPMI-medium dat 10 procent FBS bevat. Centrifugeer de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer vervolgens voorzichtig het supernatant en hersuspenseer het pellet in één milliliter RPMI-medium dat twee procent FBS bevat.
Flowcytometrische analyse van enkele celsuspensies van dunne darm lymfocyten, zou een discreet populatie van cellen moeten opleveren die vergelijkbare voorwaartse en zijwaartse verstrooiingskenmerken hebben als splenocyten. De lymfocyten kunnen beginnen af te sterven als het weefsel niet tijdens de beginfasen van de isolatie op vier graden Celsius wordt gehouden, wat resulteert in een lymfocytenpopulatie met een lagere voorwaartse verstrooiing en moeilijker te scheiden van andere epitheliale en dode cellen. Bovendien, als he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkelvoudige celpopulaties uit verschillende compartimenten van de dunne darm, ter facilitering van flowcytometrische analyse. De techniek is ontworpen om het inzicht in de mucosale immunologie en de rol van intestinale lymfocyten bij gezondheid en ziekte te vergroten.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Gastro-enterologie
Achtergrond
- Intestinale lymfocyten zijn cruciaal voor immuunresponsen.
- Inzicht in hun rol kan bijdragen aan de behandeling van darmziekten.
- Huidige methoden kunnen arbeidsintensief en tijdrovend zijn.
- Dit protocol biedt een efficiënter alternatief.
Doel van de studie
- Om specifieke celpopulaties uit de dunne darm te isoleren.
- Om flowcytometrische karakterisering van deze cellen mogelijk te maken.
- Om de impact van het microbiota op de intestinale immuniteit te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Laparotomie bij de muis om toegang te krijgen tot de dunne darm.
- Scheiding van de dunne darm van het omliggende weefsel.
- Isolatie van lymfocytpopulaties voor analyse.
- Flowcytometrie voor celkarakterisering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van lymfocytenpopulaties.
- Snelle en reproduceerbare resultaten vergeleken met traditionele methoden.
- Potentiële inzichten in de rol van microbiota bij immuniteit.
- Facilitering van verder onderzoek naar mucosale immunologie.
Conclusies
- Deze methode stroomlijnt de isolatie van intestinale lymfocyten.
- Het biedt een basis voor toekomstige studies naar intestinale immuniteit.
- Het vergroot het begrip van de relatie tussen microbiota en immuunontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte isolatie en flowcytometrische karakterisering van lymfocyten uit de dunne darm van muizen pakt een kritieke flessenhals aan in geneesmiddelenonderzoek met een focus op immunologie. Dit gestroomlijnde protocol maakt snelle, reproduceerbare toegang mogelijk tot levensvatbare immuuncelpopulaties uit belangrijke intestinale compartimenten, wat mechanische risicoreductie en targetvalidatie in de mucosale immunologie ondersteunt. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij beslissingen in vroege stadia van het portfolio met betrekking tot interacties tussen darm en immuunsysteem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de ontogenese en functie van immuuncellen in de intestinale micro-omgeving mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door lymfocytpopulaties met een hoge levensvatbaarheid te leveren voor mechanistische studies.
- Faciliteert functionele targetvalidatie in ziekterelateerde mucosale systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert reproduceerbare single-cell suspensies die geschikt zijn voor gestandaardiseerde flowcytometrische assays.
- Verbetert de assay-gereedheid door celverlies te minimaliseren en de levensvatbaarheid te maximaliseren.
- Maakt schaalbare preparatie van immuuncellen mogelijk voor downstream compound screening of fenotypische analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontdekking van translationele biomarkers door karakterisering mogelijk te maken van immuuncelpopulaties die relevant zijn voor darmgerelateerde ziekten.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door robuuste immuuncelpreparaten te leveren voor functionele studies.
- Vermindert het risico bij het verder ontwikkelen van darm-immuuntargets door betrouwbare cellulaire inputs voor preklinische modellen te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waardoor een naadloze overgang mogelijk is van hypothesetoetsing naar functionele validatie in workflows voor mucosale immunologie.
- Ontdekkingsbiologie: Levert hoogwaardige immuuncelsuspensies voor hypothesegedreven studies naar intestinale immuniteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve celpreparaten voor flowcytometrische en functionele assays.
- Analyses: Maakt robuuste meting van lymfocytenviabiliteit, fenotype en subsetdistributie mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met ziekterelateerde biomarkers en preklinische eindpunten.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol dat aanpasbaar is voor meerdere intestinale compartimenten en experimentele modellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar de darm-immuniteit.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows met snelle, reproduceerbare en schaalbare celisolatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en het kapitaalefficiëntie door technische variabiliteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van darm-immuun targets en pathways mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muisdissectie en weefselbehandeling voor een optimale celopbrengst.
- Toegang tot flowcytometrie- en cel-sorteerapparatuur is noodzakelijk voor verdere analyse.
- Strikte naleving van temperatuur- en weefselverwerkingsprotocollen is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar voor zowel de dunne darm als de dikke darm, met optimalisatie voor specifieke wetenschappelijke vraagstukken.
- Potentiële beperkingen omvatten gevoeligheid voor onvolledige vetverwijdering en weefselviabiliteit tijdens de isolatie.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Preparation of a Single Cell Suspension from the Small Intestinal Intraepithelial Layer and Lamina Propria
5:22
Preparation of a Single Cell Suspension from Peyer's Patches
6:20
Results: Intestinal Lymphocytes Have FSC and SSC Characteristics Similar to Splenocytes
7:10
Conclusion
