Name: Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer de isolatie en flowcytometrische karakterisatie van lymfocyten uit de dunne darm van muizen. Deze methode versnelt onderzoek naar mucosale immunologie en de rol van microbiota bij darmgezondheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NKS wordt ondersteund door NIH award K08 AI108690.

Alle studies werden uitgevoerd onder strikte toetsing en richtlijnen op basis van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Harvard Medical School, waar de veterinaire normen van de American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) in te stellen voldoet. 1. horizontale overdracht van bacteriën via Co-behuizing (optioneel) <ol><li> Om exogene besmetting te minimaliseren (in het bijzonder bij gebruik van gnotobiotische muizen), oefenen aseptische techniek tijdens het monteren steriele kooien, met behulp van voedsel en water dat beide zijn geautoclaveerd. </li><li> Gebruik oor stoten of tags om individueel te markeren 6 weken oude C57BL / 6 muizen die verschillende microbiotas haven en huisvesten ze in dezelfde kooi. Omdat muizen Coprofagie eten fecale pellets uit de kooi vloer, microben vanzelf horizontaal doorgegeven tussen de muizen. </li><li> Co-house muizen voor ≥1 week om tijd voor microbiële overdracht en immunologische veranderingen voorafgaand aan de analyse mogelijk te maken. </li></ol&gt; 2. Bereiding van een suspensie van losse cellen van de Small-intestinale Intra-epitheliale Layer en Lamina Propria <ol><li> Voorbereiding van de Solutions <ol><li> Bereid extractiemedium (per dunne darm): 30 ml RPMI + 93 pl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 gl 0,5 M EDTA + 500 ul foetaal runderserum (FBS). Voeg de DTT onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Bereid spijsvertering media (per dunne darm): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg collagenase II + 300 ul FBS. Voeg de dispase en collagenase onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Voor alle incubaties uitgevoerd bij 37 ° C, voorverwarmen oplossingen tot 37 ° C. </li></ol></li><li> Euthanaseren de muis door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Plaats de muis dorsale zijde en spuit de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een ​​laparotomie te voeren door achtereenvolgens het snijden van de huid en vervolgens peritoneale fascia langs de ventrale middellijn weerm de symphysis de processus xiphoideus, waardoor de peritoneale holte bloot. </li><li> Knip met een schaar de dunne darm van de maag te scheiden door doorsnijden de pylorus sfincter. Verwijder de dunne darm van het buikvlies, plagen weg de mesenteriale vet. <ol><li> Om volledig verwijderen van de dunne darm, maak een tweede snede in het ileo-cecal kruising. Plaats de geïsoleerde dunne darm in koude (bijv., 4 ° C) RPMI dat 10% FBS om cellevensvatbaarheid te maximaliseren. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig grote stukken vet met behulp van gebogen pincet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het scheurt darmweefsel zichzelf terwijl het proberen om vet te verwijderen. </li><li> Om darminhoud, voorzichtig spoelen darmen te verwijderen met 15 - 20 ml koud PBS met behulp van een 18 G feeding naald bevestigd aan een injectiespuit. </li><li> Gebruik een schaar om accijnzen PP&#39;s, en leg ze in koud RPMI dat 5% FBS. PP bevinden zich aan de antimesenteric zijde van de dunne darm en verschijnen als een multi-gelobde witmassa. Afhankelijk van de specifieke stam, een muis heeft meestal 8-12 PP. </li><li> Snijd de dunne darm in 3-4 inch segmenten. </li><li> Resten vet door rollen elke dunne darm segment op keukenpapier bevochtigd met RPMI, met een doffe scalpel om het vet van het weefsel plagen. </li><li> Draai het weefsel in cannuleren door de intestinale segmenten gebogen pincet en grijpen het distaal uiteinde van het weefsel. gebruik dan een paar rechte tang verwijder de weefselsegment van de gebogen pincet (vanaf het proximale uiteinde), waardoor het weefsel wordt omgekeerd. </li><li> Plaats weefsel segmenten in een beker met 30 ml van de winning media en een roerstaafje. Bevestig de deksel op de beker, en roer bij 500 rpm gedurende 15 min bij 37 ° C; roeren moet krachtig, maar niet turbulent zijn. </li><li> Na incubatie, gebruik dan een stalen zeef om weefsel stukken scheiden van de epitheel-bevattende supernatant, die troebel moeten verschijnen. Deze supernatant bevat intraepithelial lymfocyten die verder kunnen worden geanalyseerd, desgewenst, door een filtering van het monster in stappen 2,18-2,23. </li><li> Manueel in beweging de weefselstukken in RPMI om resterend extractiemedium wegspoelen. </li><li> Plaats weefsel op een droge papieren handdoek en draai het einde meer dan een paar maal om de verwijdering van de resterende slijm dat niet werd bevrijd door de winning medium te vergemakkelijken. </li><li> Plaats weefselfragmenten in een 1,5 ml buis met 600 ui digestiemedium. </li><li> Gebruik een schaar om het weefsel te vermalen tot stukken niet langer vasthouden aan de schaar en de oplossing lijkt homogeen. Deze stap is essentieel om volledige enzymatische afbraak van het weefsel te verzekeren. </li><li> Voeg gehakt dunne darm een ​​kopje met 25 ml van de spijsvertering media. Roeren bij 500 rpm gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Halverwege de spijsvertering (bijv., 15 min), pipet op en neer met een serologische pipet te helpen breken elke grote brokken van weefsel. </li><li> Filter verteerd weefsel (of epithEliel laag uit stap 2.12 wanneer de verwerking IELs) door een 100 micrometer cel zeef in een 50 ml buis. Spoel het filter met 20 ml RPMI met 10% FBS. </li><li> Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet voorzichtig in 1 ml RPMI met 10% FBS. </li><li> Filter geresuspendeerde cellen door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Spoel zeef met 20 ml RPMI met 10% FBS. </li><li> Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS. </li></ol> 3. Voorbereiding van een enkele celsuspensie van Patches Peyer&#39;s <ol><li> Transfer uitgesneden PP naar een beker met 25 ml van de spijsvertering media en een roerstaafje. Veiligheidsafsluiting en centrifugeren bij 500 rpm gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Filter verteerd PP&#39;s door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Als er klontjes Remain, druk ze door de zeef met het platte uiteinde van de plunjer van een 1 ml spuit. </li><li> Spoel zeef met 10 ml RPMI met 10% FBS. </li><li> Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS. </li></ol> 4. Surface kleuring voor flowcytometrie <ol><li> Aliquot zodanige hoeveelheid van cellen (bijv., 200 pl LPLs) in een 96 putjes ronde bodemplaat. </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer cellen in 90 ui RPMI dat 2% FBS en een 1: 100 verdunning van anti-CD16 / 32 (Fc blok). Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 10 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant dooromkeren van de plaat. </li><li> (Optioneel) Stain cellen met levensvatbaarheid kleurstof, indien gewenst, door volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 gl 1% formaline om de cellen te repareren. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C. </li><li> Voeg 200 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul PBS. Analyseren cellen met een flow cytometer. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

We presenteren een protocol voor de isolatie en flow cytometrische karakterisatie van small-intestinale lymfocyten, met inbegrip van de LPLs, IELs en lymfocyten in de PP. Voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van hoe veranderingen in de microbiota van invloed op de dunne darm immuunsysteem, we detail de eenvoudige stappen die betrokken zijn bij de horizontale overdracht van organismen tussen de muizen die verschillende microbiotas. Hoewel dit protocol is gericht op de dunne darm, de procedure is hetzelfd...

De belangrijkste taak van de dunne darm wordt vaak beschouwd als de vertering en opname van voedingsstoffen 1 zijn. Hoewel deze metabole functie duidelijk essentieel, heeft de dunne darm een even belangrijke rol in de gastheer te beschermen tegen de voortdurende versperring van antigenen uit de omgeving binnen het lumen 2. Het darmkanaal scheidt de buitenwereld (bv., Luminale antigenen) uit de interne omgeving van de gastheer met een epitheellaag dat slechts één cel laag dik. Als zodanig, de dunne darm immuunsysteem de enorme taak van een sluitende drempel reactiviteit, waardoor vreemde antigenen uit de voeding en commensale bacteriën aan het slijmvlies voeren met minimale of geen immuunrespons tijdens het monteren een robuuste respons tegen binnendringende pathogenen en andere &quot;schadelijk&quot; antigenen. Overmatige of ongepaste immuunreacties op deze antigenen kunnen leiden tot een pathologische aandoening (bv., Inflammatory darmziekte, type I diabetes, multiple sclerose), en moet worden vermeden 3-6. In het algemeen wordt het maagdarmkanaal beschouwd als de grootste immuun orgaan in het lichaam vertegenwoordigen, met meer dan 70% van antilichaam uitscheidende cellen 7. De kleine-intestinale immuunsysteem is opgebouwd uit 3 hoofdvakken - de lamina propria (LP), de intra-epitheliale laag en plaques van Peyer (PPS) - die elk bevat een opvallende groep van lymfocyten 2. De LP lymfocyten (LPLs) primair TCRαβ + T-cellen met ~ 20% B-cellen; intra-epitheliale lymfocyten (IELs) bevatten zeer weinig B-cellen meer TCRγδ + T cellen dan TCRαβ + T-cellen; en PP, die secundaire lymfoïde organen ingebed in de kleine darmwand zijn, bevatten ~ 80% B-cellen. Hoewel elk van deze anatomische gebieden heeft iets verschillende functies en ontologische bases, functioneren ze in aharmonized mode naar de host van pathogene beledigingen beschermen. Verder groeit de waardering die de microbiota een bepalende factor voor de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem, met toenemende erkenning van de verwante relatie tussen specifieke microben en de ontogenie van bepaalde cellijnen 8,9. Aangezien bovendien vorming van de intestinale immuunsysteem beïnvloedt immuunresponsen in anatomisch afstand gelegen plaatsen (bv. Artritis, multiple sclerose, pneumonie), is gebleken dat de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem meer ziekteprocessen relevant is dan eerder opgenomen 10 -12. Als zodanig heeft interesse in kwantitatief beoordelen van de intestinale immuunsysteem verlengd tot na gastheer-pathogeen interacties om nu ook gastheer-commensaal interacties en de pathogenese van vele systemische ziekten ook. Gezien de verschillen in de huidige methodenisolatie van intestinale lymfocyten, een methode die is geoptimaliseerd voor opbrengst, levensvatbaarheid en consistentie waarbij een evenwicht de benodigde tijd steeds belangrijker. Protocollen die Percoll gradiënten betrekken zijn tijd en arbeidsintensief en mogelijk meer kans op menselijke fouten, wat leidt tot variabele opbrengst en uitvoerbaarheid 13. Hierin geven we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en karakterisering van lymfocyten uit alle 3 dunne darm immune compartimenten. Daarbij komt steeds meer belangstelling microbe-geïnduceerde veranderingen in het mucosale immuunsysteem, nemen we stappen die kunnen worden gebruikt om de horizontale overdracht van micro-organismen tussen muizen om te bepalen hoe deze veranderingen kwantitatief beïnvloeden de intestinale immuunsysteem.

<table><tbody><tr><td>Sterile Gloves</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>sterile mouse cage</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>bevat deksel, kooibodem en alpha-dri bedden</td></tr><tr><td>Metal feeder</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Water bottle</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Card holder</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>de concentratie in het protocol is gebaseerd op een activiteitsniveau van 1.878 U/mg</td></tr><tr><td>Collagenase, type II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>de concentratie in het protocol is gebaseerd op een activiteitsniveau van 245 U/mg</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Feeding needle (18 G, 2" length)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel (15 blade)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Multi-purpose cups, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Multi-position stir plate, 9-position</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel conical strainer, 3 inch&nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate, round-bottom</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(Optional) Fixable viability dye eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin, neutral buffered</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

De ingewanden - die het grootste aantal immuuncellen van elk orgaan in het lichaam te bevatten - worden voortdurend blootgesteld aan vreemde antigenen, zowel microbiële en dieet. Gegeven een beter begrip dat deze luminale antigenen meehelpen aan de immuunreactie en vorming van immuuncellen in de darm is essentieel voor een aantal systemische aandoeningen, is er toegenomen belangstelling voor het karakteriseren van de intestinale immuunsysteem. Echter, vele gepubliceerde protocollen lastig en tijdrovend. We presenteren hier een eenvoudige protocol voor de isolatie van lymfocyten uit de dunne darm lamina propria, intra-epitheliale laag en plaques van Peyer die snel, reproduceerbaar en vereist geen moeizame Percoll gradiënten. Hoewel het protocol staat de dunne darm, maar ook voor de analyse van de dikke darm. Bovendien zetten we enkele aspecten die extra optimalisatie kan nodig zijn afhankelijk van de specifieke wetenschappelijke wachtrijentie. Deze benadering resulteert in de isolatie van grote aantallen levensvatbare lymfocyten die vervolgens kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse of alternatieve wijze van karakterisering.

Flow cytometrische analyse van enkelvoudige celsuspensies van dunne darm lymfocyten zou een discrete populatie van cellen die soortgelijke voorwaartse en zijwaartse verstrooiing karakteristieken als splenocyten (Figuren 1A en 1B) hebben verkregen. De lymfocyten kan beginnen te sterven als het weefsel tijdens de eerste stadia van de isolatie niet bij 4 ° C wordt gehouden, waardoor de lymfocyt populatie een onderste voorwaartse verstrooiing en zijn moeilijker te scheiden v...

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van enkelvoudige celpopulaties uit verschillende compartimenten van de dunne darm, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor flowcytometrische analyse of een alternatieve methode van karakterisering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de mucosale immunologie, zoals de manier waarop het microbioom de ontwikkeling van het immuunsysteem van de darm beïnvloedt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze snel en reproduceerbaar is en geen arbeidsintensieve percoll-gradiënten vereist.Om deze procedure te starten, plaatst u de muis met de rugzijde naar beneden en spuit u de buik in met 70 procent ethanol. Voer een laparotomie uit door opeenvolgend de huid en vervolgens de peritoneale fascia langs de ventrale middenlijn door te snijden, van de symfyse pubis tot aan het xiphoïdproces, waardoor de peritoneale holte wordt blootgesteld. Scheid vervolgens de dunne darm van de maag door de pylorusring door te snijden. Verwijder voorzichtig de dunne darm uit het peritoneum en verwijder het mesenteriële vet.Om de dunne darm volledig te verwijderen, wordt een tweede incisie gemaakt bij de ileocecale overgang. Plaats de geïsoleerde dunne darm in RPMI-medium van 4 °C met 10% FBS om de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Verwijder voorzichtig grote stukken vet met een gebogen pincet en wees voorzichtig om te voorkomen dat het darmweefsel zelf tijdens dit proces scheurt.Om de darminhoud te verwijderen, wordt het proximale uiteinde van de dunne darm gecannuleerd met een 18 gauge voedingsnaald bevestigd aan een spuit, waarna de darm voorzichtig wordt gespoeld met 15 tot 20 milliliters koud PBS. Gebruik een schaar om de Peyerse platen te excideren, welke zich aan de antimesenteriële zijde van de dunne darm bevinden en verschijnen als een multilobulaire witte massa. Plaats deze vervolgens in koud RPMI-medium met vijf procent FBS.Snijd vervolgens de dunne darm in segmenten van drie tot vier inch, verwijder het resterende vet door elk segment van de dunne darm over een met RPMI bevochtigde papieren handdoek te rollen en gebruik een bot scalpel om het vet van het weefsel weg te scheiden. Het is cruciaal om strikt aandacht te besteden aan de volledige verwijdering van het mesenteriaal vet om de levensvatbaarheid van de lymfocyten te waarborgen, aangezien zelfs minuscule stukjes vet ervoor kunnen zorgen dat cellen afsterven. Draai daarna het weefsel binnenstebuiten door de darmsegmenten te canuleren met gebogen pincetten en het distale uiteinde van het weefsel vast te pakken, en gebruik vervolgens een paar rechte pincetten om het weefselsegment voorzichtig uit het proximale uiteinde te verwijderen, waardoor het weefsel wordt geïnverteerd.Plaats de weefselsegmenten in een bekerglas met 30 milliliters extractiemedium en een roerstaafje. Sluit het deksel stevig af en roer 15 minuten bij 37 graden Celsius. Het roeren moet krachtig zijn, maar niet turbulent.Gebruik na 15 minuten een stalen zeef om de stukjes weefsel te scheiden van het supernatant dat het epitheel bevat en er troebel uit zou moeten zien. Agiteer de weefselstukjes handmatig in RPMI-medium om de resterende extractiemedia weg te wassen. Plaats het weefsel vervolgens op een droog papieren handdoekje en keer het meerdere keren om om de verwijdering van residueus slijm te vergemakkelijken dat niet door het extractiemedium is vrijgemaakt.Plaats vervolgens de weefselfragmenten in een buisje van 1,5 ml met 600 µL digestiemedium. Maal het weefsel fijn totdat de stukjes niet meer aan de schaar blijven kleven en de oplossing homogeen oogt. Deze stap is cruciaal om een volledige enzymatische digestie van het weefsel te garanderen.Het fijnmalen van het weefsel totdat de stukjes niet meer aan de schaar plakken en de oplossing homogeen lijkt, is cruciaal voor het waarborgen van de cellulaire opbrengst en de reproduceerbaarheid van de resultaten. Voeg de fijngehakte dunne darm toe aan een bekerglas met 25 milliliters digestiemedium en roer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Halverwege de digestie wordt de vloeistof met een serologische pipette op en neer gepipetteerd om eventuele grote stukken weefsel verder af te breken.Filter vervolgens het spijsverteringsweefsel door een celzeef van 100 micrometer in een buis van 15 milliliter. Spoel de zeef na met 20 milliliter RPMI-medium met 10 procent FBS. Centrifugeer daarna de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Schenk het supernatant voorzichtig af en resuspendeer de pellet in één milliliter RPMI-medium met 10 procent FBS. Filtreer de geresuspendeerde cellen door een celzeef van 40 micrometer in een buis van 15 milliliter. Spoel de zeef na met 20 milliliter RPMI met 10 procent FBS.Centrifuge vervolgens de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter RPMI-medium, mengandung twee procent FBS. Breng bij deze procedure de weggesneden Peyerse platen over naar een bekerglas met 25 milliliters digestiemedium en een roerkolfje.Sluit het deksel stevig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Filter vervolgens de gedigesteerde Peyerse platen door een cellzeef van 40 µm in een buis van 15 mL. Als er klonten achterblijven, druk deze dan door de zeef met het platte uiteinde van de zuiger van een injectiespuit van 1 mL.Spoel de zeef vervolgens af met 10 milliliters RPMI-medium, mengandung 10 percent FBS. Centrifugeer de gefilterde oplossing gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer daarna voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter RPMI-medium mengandung twee percent FBS.Flowcytometrische analyse van enkelcel-suspensies van lymfocyten uit de dunne darm zou een duidelijk onderscheidbare populatie cellen moeten opleveren met vergelijkbare forward- en side-scatter-kenmerken als splenocyten. De lymfocyten kunnen beginnen af te sterven als het weefsel tijdens de beginfasen van de isolatie niet op vier graden Celsius wordt gehouden, waardoor de lymfocytenpopulatie een lagere forward scatter vertoont en moeilijker te scheiden is van andere epitheelcellen en dode cellen. Bovendien zal er een vrijwel volledig verlies van lymfocyten optreden als het mesenteriële vet niet volledig uit het weefsel van de dunne darm is verwijderd.Doorgaans wordt een levensvatbaarheid van 80 procent behaald voor LP-lymfocyten uit de dunne darm. Eenmaal geoefend, kan men vier muizen verwerken en binnen minder dan vier uur enkelcel-suspensies gereed hebben voor kleuring. Tijdens deze procedure is het belangrijk om al het mesenteriële vet volledig te verwijderen en het weefsel goed fijn te hakken om een volledige digestie te garanderen.Na deze procedure kunnen enkelcel-suspensies worden gebruikt voor andere doeleinden dan flowcytometrie, zoals in vitro experimenten, genexpressieanalyse of adoptieve transfer om de functie van deze cellen verder te karakteriseren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de mucosale immunologie om de ontogenese en functionele implicaties van het immuunsysteem van de darm bij muizen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkelcel-suspensies isoleert uit verschillende compartimenten van de dunne darm, door het mesenteriële vet te verwijderen, de epitheellaag te extraheren en het weefsel te verteren met collagenase.

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Leer de isolatie en flowcytometrische karakterisatie van lymfocyten uit de dunne darm van muizen. Deze methode versnelt onderzoek naar mucosale immunologie en de rol van microbiota bij darmgezondheid.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Meer video's verkennen