Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Het algemene doel van dit protocol is om de functionele beoordeling van uitgebreide, single-site verzadigingsmutagenesebibliotheken van eiwitten te beschrijven, met behulp van high-throughput sequencing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van biochemie en moleculaire evolutie. Zoals, wat zijn de biochemische structurele en evolutionaire beperkingen op eiwitten?

En hoe kunnen we eiwitten met nieuwe functies ontwerpen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een aantal nuttige sequencing-leeslijnen in een volledige-eiwit verzadigingsmutagenesestudie maximaliseert, door multiplexing van bibliotheekconstructie en sequencing. Na het bereiden van een plaat met PCR Master Mix volgens het protocol in de tekst, gebruikt u een multi-kanaals pipet om 10 microliters over te brengen van de 96-well platen met de eerder verdunde zin-mutageneseprimers naar de cognate wells in de PCR platen.

Gebruik een plaatverbinding om elke PCR-plaat af te dekken en centrifugeer gedurende twee minuten bij 200 Gs. Breng vervolgens de PCR-platen over naar een thermocycler en voer het volgende programma uit. Na het uitvoeren van aanvullende PCR en het verdunnen van de reacties, een tot 100, brengt u één microliter van de gemengde en verdunde eerste-ronde mutagene PCR-producten over naar de cognate wells van nieuwe PCR-platen met Master Mix.

Gebruik een plaatverbinding om elke PCR-plaat af te dekken. Centrifugeer de platen gedurende ongeveer twee minuten bij ongeveer 200 Gs. Breng vervolgens de platen over naar de thermocycler en voer hetzelfde programma uit dat eerder in de video is vermeld.

Na het verifiëren van de PCR-productgroottes en het meten van de concentraties volgens het tekstprotocol, mengt u 100 nanogram van elk NNS subbibliotheek PCR-product in vijf NNS subbibliotheekgroepen. Na het uitvoeren van subbibliotheek PCR-reacties en het verteren van kloneringsvectoren in de PCR-reacties, volgens het tekstprotocol, zet u ligatiereacties op volgens deze richtlijnen voor elke verteerde NNS subbibliotheekgroep, met zijn cognate beperkte verteerde kloneringsvector. Bewaar vervolgens een uur op kamertemperatuur.

Zodra elektrocompetente E.coli-cellen zijn ontdooid, voegt u tien microliters cellen toe aan elke gezuiverde ligatiereactie en brengt u deze over naar een elektroporatiecuvet. Elektroporeer de cellen bij 1,8 kilovolt, voeg vervolgens een milliliter SOB-medium toe en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bewaar vervolgens 10 microliters van elke herstelcultuur in 990 microliters LB. Verspreid 100 microliters op LB auger platen met 12 microgram per milliliter tetracycline.

Per herstelcultuur bereidt u een 250-milliliter kweekfles voor met 50 milliliter LB en 50 microliter tet-stock. Breng de resterende ongeveer een milliliter herstelcultuur over naar een fles. Incubeer gedurende een nacht bij 37 graden Celsius en 200 rpm.

Na het tellen van het aantal succesvolle transformanten op de platen en het isoleren van het plasma-DNA van de overnachtelijke culturen, mengt u samen 100 nanogram van elk plasmide. Na het transformeren van de DNA-bibliotheek volgens het tekstprotocol, verdunt u de overnachtelijke cultuur tot een OD-600 gelijk aan 0,1. En voegt u een milliliter toe aan één fles.

Incubeer de pre-selectiecultuur bij 37 graden Celsius en 200 RPM. Controleer periodiek de groei door het meten van de OD-600, totdat deze gelijk is aan 0,1. Breng 100 milliliter van de pre-selectiecultuur over naar twee 50-milliliter conische buizen en centrifugeer gedurende zes minuten bij 4.000 Gs en vier graden Celsius.

Verwijder de meeste supernatant en combineer de pellets in een enkele 15-milliliter conische buis. Verwijder vervolgens na herhaalde centrifugatie alle supernatant. Voeg aan de andere twee flessen tetracycline toe tot een eindconcentratie van 12 microgram per milliliter.

En een volume van de pre-selectiecultuur, zodat de eind-OD-600 gelijk is aan 0,001. Voeg aan één fles één milliliter van 50 milligram per milliliter Ampicilline toe tot een eindconcentratie van 50 microgram per milliliter. Dit is de selectiecultuur.

Tijdens het incuberen van de culturen bij 37 graden Celsius en 200 RPM, controleert u de groei van de cultuur die geen Ampicilline bevat totdat deze een OD-600 bereikt die gelijk is aan 0,1. Meet ook de OD-600 van de selectiecultuur. Na het delen van de OD-600 van de selectiecultuur in 0,1 en het vermenigvuldigen met 100, brengt u dit volume over naar 50-milliliter conische buizen en centrifugeert u bij 4.000 Gs en vier graden Celsius gedurende zes minuten.

Na het verwijderen van de meeste supernatant, combineert u de pellets in een enkele buis voordat u opnieuw centrifugeert en alle supernatant verwijdert. Om high-throughput sequencing uit te voeren, bereidt u een PCR Master Mix voor en brengt u 23 microliter over naar 10 PCR-buizen. Voeg één microliter van 0,5 nanogram per microliter van gezuiverd plasmide-DNA uit de pre-selectiecultuur toe aan buizen één tot vijf.

En uit de selectiecultuur naar buizen zes tot tien. Meng 50 microliter van 50 micromolaire voorwaarts-orthogonale primers, OP1F tot OP5F, met de respectieve achterwaarts-orthogonale primers, OP1R tot OP5R. Breng in dezelfde volgorde één microliter over naar PCR-buizen één tot vijf en zes tot tien.

Breng de PCR-buizen over naar de thermocycler en voer het volgende programma uit. Verdun vervolgens de PCR-reacties 100 keer, door één microliter uit elke buis over te brengen naar 99 microliter water. Meng goed en pipet 99 microliter uit de buizen en gooi weg.

Meng 50 microliter van de voorwaartse en respectieve achterwaartse primers. Breng vervolgens één microliter over naar de PCR-buizen één tot vijf en zes tot tien. Breng na het bereiden van een PCR Master Mix 23 microliter over naar elke PCR-buis en voer het volgende programma uit.

Om de laatste PCR's uit te voeren om indexsequenties toe te voegen, verdunt u de PCR-react