Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

Het algemene doel van dit experiment is om de energieoverdracht van de ene kleurstofgemodificeerde DNA-streng naar de andere te visualiseren. Deze methode kan helpen bij de belangrijkste vragen op het gebied van moleculaire biologie. Bijvoorbeeld RNA-interferentie door het monitoren van siRNA-verwerking en integriteit in levende cellen in realtime.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gemakkelijke monitoring van de fluorescentie en de kleurverandering, wat een duidelijk resultaat oplevert. Zo worden valse positieve resultaten geëlimineerd. Om deze procedure te beginnen, voegt u de juiste reagentia toe zoals aangegeven in het tekstprotocol toe aan een 20 milliliter, ronde bodemkolf, uitgerust met een magnetische roerbare en refluxcondensor.

Voeg vervolgens nul punt nul zes milliliter piperidine toe. En verwarm het reactiemengsel gedurende vier uur tot 80 graden Celsius. Nadat de reactie is afgekoeld tot kamertemperatuur, verzamelt u het resulterende precipitaat door filtratie.

En was het drie keer met di-ethylether. Voeg vervolgens honderd milliliter di-ethylether toe aan het supernatant. En verzamel het resulterende precipitaat door filtratie.

Na het wassen drie keer met di-ethylether, combineert u het precipitaat met het geïsoleerde vaste stof van de eerste filtratie. Gebruik de computer, aangesloten op een DNA-synthesizer, om de gewenste DNA-sequentie en koppelingsmethode in te voeren. Volg hierbij de aanwijzingen van het protocol van de fabrikant.

Montage vervolgens de kolom met het gecontroleerde glas, dat is gemodificeerd met een micro mol van het eerste gezicht in de synthesizer. Start nu de synthese op de DNA-synthesizer. Na de bewerking van de DNA-strengen, voegt u de juiste reagentia toe zoals aangegeven in het tekstprotocol toe aan de gedeïethyliseerde alkyn, gemodificeerde DNA-monster.

Incubeer het monster gedurende anderhalf uur op 60 graden Celsius. Breng vervolgens het monster over naar een 10 milliliter buis. Na afkoeling tot kamertemperatuur, voegt u 150 microliter van een nul punt nul vijf molaarde EDTA-dinatriumzout-oplossing en 450 microliter van een nul punt drie molaarde natriumacetaatoplossing toe aan het DNA-monster.

Voeg daarna tien milliliter ethanol toe aan het monster. En bewaar het gedurende 16 uur bij min 32 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij duizend keer G. Wanneer u klaar bent, verwijdert u het supernatant.

Was de resulterende DNA-pellet met twee milliliter koude 80% ethanol. Droog vervolgens de pellet onder verminderde druk met behulp van een vriesdroger. Zuiver de ruwe DNA-pellet door middel van HP LC. Bewaak de run door het controleren van 260 nanometer en 459 nanometer voor Kleurstof een.

Of 542 nanometer voor Kleurstof twee. Verzamel de fracties die absorptie vertonen in beide golflengtekanalen. Voor metingen van absorptiespectroscopie van enkele strengen, neem een ​​lege meting op die alleen 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolair natriumfosfaatbuffer bevat.

Breng vervolgens de eerder bereide DNA1-oplossing over in een centimeter kwartsglas cuvet. Neem de absorptie op. Bepaal vervolgens de maximale waarde van kleurstofabsorptie.

Voor metingen van fluorescentiespectroscopie van enkele strengen, neem een ​​lege meting op die alleen 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolair natriumfosfaat bevat, met behulp van de excitatiegolflengte van Kleurstof een. Plaats vervolgens de cuvet met de DNA1-oplossing in de spectrometer. Neem het fluorescentiespectrum op.

Voer de dubbelstrengs, fluorescentiespectroscopie-meting uit door de cuvet met de dubbele streng van DNA1 en DNA2-oplossing in de spectrometer te plaatsen. Neem vervolgens het fluorescente spectrum op met behulp van de excitatiegolflengte van Kleurstof een. Om een ​​beter begrip te krijgen van wat de opgenomen spectra laten zien, bestraal de cuvetten met handbediende UV-lampen.

Observeer de verandering in fluorescentiekleur van de enkele naar de dubbelstrengs DNA. De opgenomen absorptiespectra tonen de maxima bij 465 nanometer voor enkele streng DNA1 en 546 nanometer voor enkele streng DNA2. De geanneleerde dubbele streng van DNA1 en DNA2 toont maxima bij zowel 469 als 567 nanometer.

Beide absorptiemaxima vertonen een bathaohromic verschuiving. En de kleinste spectroscopische veranderingen zijn het resultaat van excitonische interacties tussen de kleurstoffen binnen de dubbelhelicale DNA-architectuur. De overeenkomstige fluorescentiespectra vertonen een maxima bij 537 nanometer voor enkele streng DNA1.

Bij 607 nanometer voor enkele streng DNA2. En bij 615 nanometer voor geanneleerde, dubbele streng van DNA1 en DNA2. Dubbelstrengs van DNA1 en DNA2, vertoont uitsluitend het emissiemaximum van Kleurstof twee, hoewel Kleurstof een selectief wordt opgewonden, wat bewijst dat de energieoverdracht efficiënt plaatsvindt van Kleurstof een naar Kleurstof twee.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA postsynthetisch kan worden gemodificeerd door een aantal katalytische reacties van een alkyn-gelabelde DNA-streng met een A-zijde.