Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

Het algemene doel van dit experiment is om de energieoverdracht van de ene met kleurstof gemodificeerde DNA-streng naar een andere te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van de moleculaire biologie, zoals RNA-interferentie door de verwerking en integriteit van siRNA in levende cellen in real-time te monitoren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud waarmee de fluorescentie en de kleurverandering kunnen worden gevolgd, wat tot een duidelijk resultaat leidt. Hierdoor worden fout-positieve resultaten geëlimineerd. Om deze procedure te starten, voegt u de juiste reagentia toe, zoals aangegeven in het tekstprotocol, aan een rondbodemkolf van 20 milliliter, voorzien van een magnetische roerkolf en een terugvloeikoeler.

Voeg vervolgens 0,06 ml piperidine toe. Verhit het reactiemengsel gedurende vier uur tot 80 °C. Nadat de reactie is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt het resulterende precipitaat via filtratie verzameld.

Was daarna drie keer met diethyl ether. Voeg vervolgens honderd milliliters diethyl ether toe aan het supernatant. Verzamel het resulterende precipitaat door filtratie.

Na drie keer wassen met diethylether, combineer het neerslag met de geïsoleerde vaste stof uit de eerste filtratie. Voer via de computer, die is verbonden met een DNA-synthesizer, de gewenste DNA-sequentie en de koppelingsmethode in. Volg hierbij de aanwijzingen uit het protocol van de fabrikant.

Monteer vervolgens de kolom met het gecontroleerd gegoten glas, dat is gemodificeerd met één micromol van het eerste vlak, in de synthesizer. Start nu de synthese op de DNA-synthesizer. Voeg na de opwerking van de DNA-strengen de juiste reagentia toe aan het gemodificeerde DNA-monster met gedieethyleerd alkyn, zoals aangegeven in het tekstprotocol.

Incubeer het monster bij 60 °C gedurende 1,5 uur. Breng het monster vervolgens over naar een buis van 10 mL. Voeg na afkoeling tot kamertemperatuur 150 µL van een 0,05 M EDTA-dinatriumzoutoplossing en 450 µL van een 0,3 M natriumacetaatoplossing toe aan het DNA-monster.

Voeg hierna 10 milliliters ethanol toe aan het monster. Bewaar dit gedurende 16 uur bij min 32 graden celsius. Centrifugeer het monster vervolgens 15 minuten bij duizend keer G. Verwijder na afloop de supernatant.

Was het resulterende DNA-pellet met twee milliliter koude 80% ethanol. Droog vervolgens het pellet onder verminderde druk met behulp van een vriesdroger. Zuiver het ruwe DNA-pellet via HPLC. Monitor de run door 260 nanometer en 459 nanometer voor Dye one te controleren.

Of 542 nanometer voor Kleurstof twee. Verzamel de fracties die absorptie vertonen in beide golflengtekanalen. Registreer voor absorptiespectroscopie-metingen van enkelstrengs DNA een blanco-meting die uitsluitend 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolaire natriumfosfaatbuffer bevat.

Breng vervolgens de eerder bereide DNA1-oplossing over naar een kwartzglazen cuvette van één centimeter. Registreer de absorptie. Bepaal daarna de maximale waarde van de kleurstofabsorptie.

Voer voor fluorescentiespectroscopie-metingen van enkelstrengs DNA een blanco-meting uit met enkel 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolair natriumfosfaat, waarbij de excitatiegolflengte van Kleurstof één wordt gebruikt. Plaats vervolgens de cuvette met de DNA1-oplossing in de spectrometer. Registreer het fluorescentiespectrum.

Om de fluorescentiespectroscopie-meting van de dubbelstrengs DNA uit te voeren, plaatst u de cuvet met de oplossing van dubbelstrengs DNA1 en DNA2 in de spectrometer. Registreer vervolgens het fluorescentiespectrum met behulp van de excitatiegolflengte van kleurstof één. Om een beter inzicht te krijgen in wat de geregistreerde spectra laten zien, bestraalt u de cuvetten met handheld UV-lampen.

Observe de verandering in fluorescentiekleur van het enkelstrengs naar het dubbelstrengs DNA. De geregistreerde absorptiespectra tonen maxima op 465 nanometer voor enkelstrengs DNA1 en 546 nanometer voor enkelstrengs DNA2. Het geanneale dubbele streng van DNA1 en DNA2 vertoont maxima op zowel 469 als 567 nanometer.

Beide absorptiemaxima vertonen een bathochrome verschuiving. De kleinste spectroscopische veranderingen zijn het resultaat van excitonic interacties tussen de kleurstoffen binnen de dubbele helixstructuur van het DNA. De overeenkomstige fluorescentiespectra vertonen een maximum op 537 nanometer voor enkelstrengs DNA1.

Op 607 nanometer voor enkelstrengs DNA2. En op 615 nanometer voor geannealeerd, dubbelstrengs DNA1 en DNA2. Dubbelstrengs DNA1 en DNA2 vertonen uitsluitend het emissiemaximum van kleurstof twee, hoewel kleurstof één selectief wordt geëxciteerd, wat bewijst dat de energieoverdracht efficiënt plaatsvindt van kleurstof één naar kleurstof twee.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA synthetisch kan worden gemodificeerd door middel van een reeks katalytische reacties van een alkyn-gelabelde DNA-streng met een A-zijde.