Name: Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de synthese van golflengteverschuivende DNA-hybridisatie sondes met behulp van fotostabiele cyanine kleurstoffen via koper-gekatalyseerde klikchemie. Deze methode maakt real-time moleculaire beeldvorming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiële steun door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), de Research Training Group GRK 2039 (gefinancierd door de DFG) en KIT is dankbaar erkend.

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Verscheidene van de chemicaliën die in deze syntheses zijn toxisch en carcinogeen. Gebruik alle nodige veiligheidsvoorschriften die doorgaans in de organische chemie laboratoria, zoals het dragen van een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen zijn vereist. 1. Synthese van de kleurstoffen Opmerking: Beide kleurstoffen kunnen worden gesynthetiseerd door dezelfde soorten reacties Figuur 2 toont een overzicht van deze reacties.. <ol><li> Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-iumjodide (kleurstof 1) <ol><li> Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylpyridine-1-iumjodide (Figuur 2A, stap a) <ol><li> Oplossen 466 mg 4-picoline en 5,91 g 1,3-diiodopropane in 10 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje en sluit goed door een septumdop. </li><li> Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een roterende verdamper. </li><li> Voeg 20 ml ethylacetaat van de resterende olie en behandelen van het mengsel in een 120 w ultrasoon bad gedurende 3 min. </li><li> Verzamel het gevormde neerslag door filtratie en wassen vijfmaal met ethylacetaat. Droog het vaste product onder vacuüm O / N. </li></ol></li><li> Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridine-1-ium (Figuur 2A, stap b) <ol><li> Oplossen 900 mg 1- (3-joodpropyl) -4-methylpyridine-1-iumjodide in 12 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje, voeg 376 mg natriumazide en lekvrij afsluiten van een septumdop. </li><li> Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper. </li><li> Voeg 15 ml dichloormethaan aan het residu. </li><li> Filter uit en gooi het verkregen neerslag. </li><li> Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotary verdamper waarbij het product als bruine olie. </li></ol></li><li> Synthese van 1-methyl-1H-indool-3-carbaldehyde (Figuur 2A, stap c) <ol><li> Onder inert gas (argon), los 1,45 g indool-3-carbaldehyde, 1,52 g kaliumcarbonaat en 2,70 g dimethylcarbonaat in 10 ml absolute dimethylformamide in een 50 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler. </li><li> Roer het mengsel bij 130 ° C gedurende 19 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, giet het mengsel op ijs. </li><li> Extraheer de waterige laag driemaal met 150 ml ethylacetaat. </li><li> Combineer de organische lagen, was met water, drogen boven natriumsulfaat en verwijdering van het oplosmiddel bij 50 ° C onder verlaagde druk met een rotatieverdamper. </li></ol></li><li> Koppeling met 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-iumjodide (kleurstof 1) (Figuur 2A, stap d) <ol><li> Werken onder argon en onder uitsluiting van vocht. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridine-1-ium en 48 mg 1-methyl-1H-indool-3-carbaldehyde in 4 ml ethanol in een 20 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler. </li><li> Voeg 0,07 ml piperidine en verhit tot 80 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Verzamel het verkregen neerslag door filtratie en was driemaal met diethylether. </li><li> Voeg diethylether aan het supernatant en het verzamelen van het verkregen precipitaat door filtratie. Was driemaal uit met diëthylether. </li><li> Combineer de precipitaten. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-fenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinoline-1-iumjodide (dye 2) <ol><li> Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylchinoline-1-iumjodide (figuur 2B, stap a) <ol><li> Oplossen 715 mg 4-methyl quinoline en 5,91 g 1,3-diiodopropane in 10 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje en sluit goed door een septumdop. </li><li> Warmtetot 85 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper. </li><li> Voeg 20 ml ethylacetaat aan de rest van de olie en behandelen van het mengsel in een 120 w ultrasoon bad gedurende 3 min. </li><li> Verzamel het gevormde neerslag door filtratie en wassen vijfmaal met ethylacetaat. Droog het vaste product onder vacuüm O / N. </li></ol></li><li> Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4-methylchinoline-1-ium (figuur 2B, stap b) <ol><li> Oplossen 900 mg 1- (3-joodpropyl) -4-methylchinoline-1-iumjodide in 12 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje, voeg 333 mg natriumazide en lekvrij afsluiten van een septumdop. </li><li> Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper. </li><li> Voeg 15 ml dichloormethaan aan het residu. </li><li> Filter uit en gooi het verkregen neerslag. </li><li> Verwijder het oplosmiddel under verlaagde druk met een rotatieverdamper om het product als bruine olie. </li></ol></li><li> Synthese van 1-methyl-2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde (figuur 2B, stap c) <ol><li> Onder inert gas (argon), los 1,45 g 2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde, 0,996 g kaliumcarbonaat en 1,77 g dimethylcarbonaat in 10 ml absolute dimethylformamide in een 50 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler. </li><li> Roer het mengsel bij 130 ° C gedurende 19 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur, giet het mengsel op ijs. </li><li> Extraheer de waterige laag driemaal met 150 ml ethylacetaat. </li><li> Combineer de organische lagen, was met water, drogen boven natriumsulfaat en het oplosmiddel verwijderd onder gereduceerde druk gebruikmakend van een roterende verdamper. </li></ol></li><li> Koppeling met 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe nyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinoline-1-iumjodide (figuur 2B, stap d) <ol><li> Werken onder argop en onder uitsluiting van vocht. Los op 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylchinoline-1-ium en 59,7 mg 1-methyl-2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde in 4 ml ethanol in een 20 ml rondbodemkolf uitgerust met terugvloeikoeler. </li><li> Voeg 0,06 ml piperidine en verhit tot 80 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Laat afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Verzamel het verkregen neerslag door filtratie en wassen met diethylether driemaal. </li><li> Voeg diethylether aan het supernatant en het verzamelen van het verkregen precipitaat door filtratie. Was driemaal uit met diëthylether. </li><li> Combineer de precipitaten. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Synthese van de DNA-strengen Noot: De synthese van de DNA-strengen wordt uitgevoerd volgens de fosforamidiet methode op een vaste fase, zoals beschreven door M. Caruthers 11 op een DNA synthesizer. Het functioneren van de synthesizer wordt getest voordat de synthetische procedure en reagentia worden verlengd wanneernoodzakelijk. <ol><li> Prearrangements <ol><li> Ontbinding van de in de handel verkrijgbare 2&#39;-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (CU) in 1,2 ml amidiet verdunner (extra droog acetonitrile). Beweeg oplossing in de flacon met een synthesizer flacon en schroef in synthesizer. </li><li> Voer een &quot;lektest&quot; (volgens de instructies van de fabrikant) om ervoor te zorgen dat er geen argon gaslek bestaat. Als de &quot;lektest&quot; faalt, schroef in de flacon strakker. </li><li> Prime De CU-oplossing door het vullen van de buis die wordt aangesloten op de vaste fase synthese kamer. </li><li> Was alle lijnen met acetonitril. </li></ol></li><li> Synthese van DNA-strengen <ol><li> Met de computer verbonden aan de DNA sequentie en koppelingswerkwij voeren de aanwijzingen van protocol van de fabrikant. De koppelingsstap van de CU bouwsteen duurt 168 sec met 7 pulsen (elke puls 16 ui) in vergelijking met 40 sec met 7 pulsen voor een conventioneelfosforamidiet als bouwstenen. </li><li> Monteer de kolom met de CPG (glas met geregelde poriën) als vaste fase die is gemodificeerd met 1 pmol van de eerste basis (DNA-synthese wordt uitgevoerd van 3 &#39;naar 5&#39;) in de synthesizer. </li><li> Start de synthese van de DNA synthesizer 11. </li></ol></li><li> Opwerking van de gesynthetiseerde DNA-strengen <ol><li> Droog de kolommen met de gesynthetiseerde DNA strengen onder vacuüm O / N. </li><li> Gebruik een tang om de kolom te openen en laat de CPG in een reactie flacon. Voeg 700 gl geconcentreerde waterige ammoniakoplossing het oligonucleotide deprotecteren en laat de DNA-streng van het CPG. </li><li> Sluit het vat en breng een security deksel op het reactievat om te voorkomen dat barsten, en verhit tot 50 ° C gedurende 18 uur. </li><li> Verwijderen ammoniak door centrifugering onder verminderde druk (100 mbar) bij 30 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Begin filtratie van CPG: Centrifuge vat bij 11.000 xg for 3 min. Neem supernatant en breng deze in een centrifugale apparaat met een poriegrootte van 0,45 urn. Centrifugeer bij 1000 g gedurende 4 min. </li><li> Ondertussen voeg 300 gl dubbel gedestilleerd water aan het CPG, vortex gedurende 20 seconden en centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 3 min. Breng de bovenstaande in de centrifugale inrichting en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 4 min. Herhaal deze wasprocedure twee keer. </li><li> Verwijder het water uit de gecombineerde waterige oplossingen door centrifugeren bij 0,1 mbar en 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. &quot;klikken&quot; Procedure <ol><li> Voeg 50 gl dubbel gedestilleerd water, 25 ui van een natriumascorbaat-oplossing (0,4 M in water), 34 gl tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ui van het azide (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) en 17 pi van een tetrakis (acetonitrile) koper (I) hexafluorfosfaat oplossing (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) het gevriesdroogde alkyn gemodificeerd DNA monster. </li&gt; <li> Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 1,5 uur. </li><li> Koel af tot RT. </li><li> Voeg 150 ul Na2 EDTA (0,05 M in water) en 450 ul natriumacetaat (0,3 M in water) om de DNA-monster overgebracht in een 10 ml buis. </li><li> Voeg 10 ml ethanol (100%) en laten -32 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Centrifuge vat gedurende 15 minuten bij 1000 xg en verwijder supernatant. </li><li> Wassen DNA-pellet met 2 ml koude ethanol (80%). </li><li> Droge pellets onder verlaagde druk. </li></ol> 4. HPLC Zuivering Opmerking: Voor het scheiden van de DNA-strengen ervoor zorgen dat de HPLC goed werkt, voldoende oplosmiddel beschikbaar is en de kolom is schoon. Spoel kolom met de uitgangsconcentratie van buffer / acetonitril. <ol><li> Los de ruwe DNA-pellet in 250 ui dubbel gedestilleerd water en breng een HPLC flesje. </li><li> Begin HPLC run van 45 min met een gradiënt van 0% acetonitril tot 15% acetonitril voor kleurstof 1 en een Gradi<html> ent van 0% acetonitril tot 17% acetonitril voor kleurstof 2. Bewaken van de run door het controleren van 260 nm (DNA absorptie) en 459 nm (kleurstof 1) of 542 nm (kleurstof 2). Verzamel de fracties die de absorptie vertonen in beide golflengtekanalen. </li><li> Controleer de verzamelde fracties voor de juiste massa door MALDI (MALDI) massaspectrometrie met behulp van een matrix die bestaat uit 3-hydroxypicolinezuur (3hPa) en diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Bereid de matrix door het mengen van 900 ui van een verzadigde 3-HPA-oplossing in 1: 1-mengsel van acetonitril en water met 100 ui van een diammoniumhydrogencitrate oplossing (100 g / l) in water. </li><li> Pipet 1-2 ul van de DNA-probe op het doel en laat het drogen aan de lucht. </li><li> Voeg 0,2 ul van het 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matrix om het monster en meng tot kristalliseert. </li><li> Voer MALDI massaspectrometrie. </li><li> Combineer die HPLC-fracties die de juiste massa vertonen. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. Bepaling van de concentratie Opmerking: De concentratie wordt bepaald door meting van de absorptie bij 260 nm met een UV / Vis spectrofotometer, gebaseerd op de extinctiecoëfficiënten (ε 260) van de DNA-basen en de kleurstof. <ol><li> Los het DNA in 100-200 gl dubbel gedestilleerd water. </li><li> Breng 1 pl DNA-oplossing op de UV / Vis spectrofotometer. </li><li> Meet de absorptie bij 260 nm. Herhaal dit drie keer. </li><li> Neem de gemiddelde waarde voor de concentratie van de oplossing te berekenen. Voor de berekening van de extinctie-coëfficiënten gebruikt ε 260 nm van de vier natuurlijke basen 12 en ε 260 nm van de gekochte bouwsteen Cu (zogenaamde natuurlijke uridine) 12 op ε 260 nm van de gehele DNA-streng te verkrijgen. Kleurstof 1, gebruik ε = 260nm 10.200 L * mol * -1 cm -1 en kleurstof 2, gebruik ε = 260nm 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Bereken de concentratie van de oplossing volgende Lambert-Beers &#39;, ontleend aan het uitsterven coëfficiënten en gemeten absorpties. 13 </li></ol> 6. Monstervoorbereiding en Spectroscopie <ol><li> Bereiding van de monsters enkele streng <ol><li> Bereid afzonderlijk 1 ml 2,5 pM oplossing van elk van de gemodificeerde DNA1 en DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de streng monsters double <ol><li> Bereid 1 ml van een oplossing die 2,5 uM en 2,5 uM DNA1 van DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7 in een reactievat. </li><li> Bevestig de deksel met een veiligheidsdop en verhit tot 90 ° C gedurende 10 minuten. Schakel vervolgens het verwarmen en laat afkoelen tot RT O / N. </li></ol></li><li> absorptiespectroscopie Opmerking: Om de golflengte van de fluorescentie-spec te bepalentroscopy absorptiespectra worden opgenomen. <ol><li> Enkele streng metingen <ol><li> Neem een blanco meting met alleen 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7. </li><li> Breng de bereide oplossing van DNA1 in een 1 cm kwartsglas cuvet en noteer de absorptie. Corrigeer de meting tegen de lege data. Bepaal de maximale waarde van de kleurstof absorptie. </li><li> Herhaal dit voor DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> fluorescentiespectroscopie <ol><li> Enkele streng metingen <ol><li> Neem een blanco meting met alleen 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7; met de excitatiegolflengte van kleurstof 1. </li><li> Breng de DNA1 oplossing in een 1 cm kwartsglas cuvet. </li><li> Noteer het fluorescentiespectrum. </li></ol></li><li> Dubbele streng meting <ol><li> Breng de dubbele streng oplossing in een kwartsglas cuvet. </li&gt; <li> Noteer het fluorescentiespectrum met de excitatiegolflengte van kleurstof 1. </li></ol></li></ol></li><li> visualisatie experimenten Let op: Juiste oogbescherming moet worden gedragen om UV-schade aan de ogen te voorkomen! <ol><li> Om een beter begrip van wat de opgenomen spectra tonen krijgen, bestralen de cuvettes met handbediende UV-lampen (Figuur 5). Let op de verandering in fluorescentie kleur van de ene naar de dubbelstrengs DNA. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%3B%3A+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">#34;DNA Traffic Lights&#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%3A+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA &#34;Traffic Lights&#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li>
<li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li>
<li>Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+%26%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &#34;DNA Traffic Lights&#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li>
<li>Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li>
<li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%2C+Volume+1%3A+Nucleic+Acids%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids</a>. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).</li>
<li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbance+melting+curves+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li>
<li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Dimers%3A+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li>
<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol toont de volledige procedure te labelen DNA post-synthetisch via CuAAC by-azide gemodificeerde fluorescerende kleurstoffen. Dit omvat de synthese van de kleurstoffen en alkyn-gemodificeerd DNA en de werkwijze voor het merken. De synthese van de kleurstoffen volgt vier stappen. Alle producten kunnen worden verkregen door een vrij eenvoudige neerslag als gevolg van hun positieve lading en geen tijdrovende kolomchromatografie nodig is. De invoering van het azide functionaliteiten v...

Moleculaire beeldvorming is een fundamentele techniek voor het begrijpen van biologische processen in levende cellen. 03/01 De ontwikkeling van fluorescerende nucleïnezuur gebaseerde probes voor dergelijke chemische-biologische toepassingen is een groeiende onderzoeksveld geworden. Deze fluorescerende probes nodig hebt om een ​​paar eisen te voldoen om een ​​geschikte tool voor cell imaging geworden. Ten eerste moet de toegepaste kleurstoffen fluorescentie met hoge kwantumopbrengsten vertonen grote Stokes verschuivingen en vooral hoge photostabilities langdurige in vivo beeldvorming mogelijk. En ten tweede moeten ze een betrouwbare fluorescentie uitlezing te tonen. Conventionele chromofoor-quencher-systemen zijn gebaseerd op het uitlezen van een enkele fluorescentie kleur door eenvoudige veranderingen in fluorescentie-intensiteiten. 4 Deze benadering draagt ​​het risico van vals positieve of vals negatieve resultaten als gevolg van autofluorescentie van intracellulaire componenten of lage signaal-ruisverhouding door ongewenste uitdoving door andere comonderdelen. 4 We hebben onlangs gemeld op het begrip &quot;DNA verkeerslichten &#39;die dubbele fluorescentiekleur uitlezingen tonen door twee verschillende chromoforen. 5-6 Het concept is gebaseerd op de energieoverdracht (ET) vanaf de donorkleurstof de acceptor kleurstof waarvan de fluorescentie verandert kleur (zie figuur 1). Dit maakt een meer betrouwbare uitlezing en verschaft daardoor een krachtig hulpmiddel voor fluorescentie beeldvorming probes. Etikettering van oligonucleotiden met fluorescerende kleurstoffen kan worden bereikt door twee verschillende benaderingen. Kleurstoffen kunnen tijdens de chemische DNA synthese worden opgericht op een vaste fase met overeenkomstige gemodificeerde fosforamidiet bouwblokken. 7 Deze werkwijze is beperkt tot kleurstoffen die stabiel onder standaard fosforamidiet en deprotectie omstandigheden. Als alternatief werden post-synthetische modificatie methoden vastgesteld oligonucleotide chemie. Hier tonen we de synthese van een van onze nieuwe foto&#39;stabel energieoverdracht paren 8,9 en de post-synthetische labeling van DNA door het gebruik van koper-gekatalyseerde 1,3-cycloadditie tussen aziden en alkynen (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">synthese</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technische kwaliteit</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. kwaliteit</td></tr><tr><td>Dichloromethaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technische kwaliteit</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonaat, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide, 99,8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfaat</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99,5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technische kwaliteit</td></tr><tr><td>2-Fenyl-indole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DNA-synthese</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent voor DNA-synthese</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile voor DNA-synthese</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1,0&nbsp;&micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1,0&nbsp;&micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1,0&nbsp;&micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1,0&nbsp;&micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammoniak (waterige oplossing)&nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeerapparaten nanosep 0,45&nbsp;&micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazool (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">nabewerking</td></tr><tr><td>vacuümconcentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>klikprocedure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)koper(I) hexafluorofosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Natrium L-ascorbinezuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dinatriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>gesynthetiseerd volgens een literatuurprocedure1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-systeem</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 kolom</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">concentratiebepaling</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrofotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">monstervoorbereiding en spectroscopie</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthese van golflengteverschuivende dna hybridisatie sondes met behulp fotostabiele cyanine dyes

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In dit protocol tonen we een werkwijze voor de synthese van 2&#39;-alkyn gemodificeerd desoxyribonucleïnezuur (DNA) strengen door geautomatiseerde vaste fase synthese onder toepassing van standaard fosforamidietchemie. Oligonucleotiden worden post-synthetisch gelabeld door twee nieuwe photostable cyaninekleurstoffen met behulp van koper-gekatalyseerde click-chemie. De synthese van donor en acceptor kleurstof wordt beschreven en wordt uitgevoerd in drie opeenvolgende stappen. Het DNA als de omringende architectuur, beide kleurstoffen energieoverdracht ondergaan wanneer zij door hybridisatie dicht bij elkaar worden gebracht. Daarom is annealen van twee enkelstrengs DNA strengen zichtbaar gemaakt door een verandering van fluorescentie kleur. Deze kleurverandering wordt gekenmerkt door fluorescentiespectroscopie maar kunnen ook direct worden waargenomen met behulp van een handheld ultraviolet (UV) lamp. Het concept van een dubbele fluorescentiekleur uitlezing maakt deze oligonucleotideprobes uitstekende instrumenten voor moleculaire beeldvorming vooral bij de beschreven photostable kleurstoffen worden gebruikt. Daardoor wordt fotobleken van de beeldvormende sondes voorkomen en biologische processen in real time worden waargenomen voor een langere tijdsperiode.

Absorptie en fluorescentie spectra van de enkel- en dubbelstrengs DNA worden als getoond in figuur 4. De geregistreerde absorptiespectra (figuur 4 rechts) tonen absorptiemaxima λ max bij 465 nm voor enkelstrengs DNA1 (kleurstof 1) en 546 nm voor enkelstrengs DNA2 (kleurstof 2). De gegloeide DNA1_2 (dye dye 1 &amp; 2) toont maxima bij zowel 469 nm en 567 nm. Beide absorptiemaxima ver...

Fotostabiele cyanine kleurstoffen worden aan oligonucleotiden gekoppeld om hybridisatie te controleren door energieoverdracht.

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Het algemene doel van dit experiment is om de energieoverdracht van de ene met kleurstof gemodificeerde DNA-streng naar een andere te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van de moleculaire biologie, zoals RNA-interferentie door de verwerking en integriteit van siRNA in levende cellen in real-time te monitoren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud waarmee de fluorescentie en de kleurverandering kunnen worden gevolgd, wat tot een duidelijk resultaat leidt. Hierdoor worden fout-positieve resultaten geëlimineerd. Om deze procedure te starten, voegt u de juiste reagentia toe, zoals aangegeven in het tekstprotocol, aan een rondbodemkolf van 20 milliliter, voorzien van een magnetische roerkolf en een terugvloeikoeler.Voeg vervolgens 0,06 ml piperidine toe. Verhit het reactiemengsel gedurende vier uur tot 80 °C. Nadat de reactie is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt het resulterende precipitaat via filtratie verzameld.Was daarna drie keer met diethyl ether. Voeg vervolgens honderd milliliters diethyl ether toe aan het supernatant. Verzamel het resulterende precipitaat door filtratie.Na drie keer wassen met diethylether, combineer het neerslag met de geïsoleerde vaste stof uit de eerste filtratie. Voer via de computer, die is verbonden met een DNA-synthesizer, de gewenste DNA-sequentie en de koppelingsmethode in. Volg hierbij de aanwijzingen uit het protocol van de fabrikant.Monteer vervolgens de kolom met het gecontroleerd gegoten glas, dat is gemodificeerd met één micromol van het eerste vlak, in de synthesizer. Start nu de synthese op de DNA-synthesizer. Voeg na de opwerking van de DNA-strengen de juiste reagentia toe aan het gemodificeerde DNA-monster met gedieethyleerd alkyn, zoals aangegeven in het tekstprotocol.Incubeer het monster bij 60 °C gedurende 1,5 uur. Breng het monster vervolgens over naar een buis van 10 mL. Voeg na afkoeling tot kamertemperatuur 150 µL van een 0,05 M EDTA-dinatriumzoutoplossing en 450 µL van een 0,3 M natriumacetaatoplossing toe aan het DNA-monster.Voeg hierna 10 milliliters ethanol toe aan het monster. Bewaar dit gedurende 16 uur bij min 32 graden celsius. Centrifugeer het monster vervolgens 15 minuten bij duizend keer G. Verwijder na afloop de supernatant.Was het resulterende DNA-pellet met twee milliliter koude 80% ethanol. Droog vervolgens het pellet onder verminderde druk met behulp van een vriesdroger. Zuiver het ruwe DNA-pellet via HPLC. Monitor de run door 260 nanometer en 459 nanometer voor Dye one te controleren.Of 542 nanometer voor Kleurstof twee. Verzamel de fracties die absorptie vertonen in beide golflengtekanalen. Registreer voor absorptiespectroscopie-metingen van enkelstrengs DNA een blanco-meting die uitsluitend 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolaire natriumfosfaatbuffer bevat.Breng vervolgens de eerder bereide DNA1-oplossing over naar een kwartzglazen cuvette van één centimeter. Registreer de absorptie. Bepaal daarna de maximale waarde van de kleurstofabsorptie.Voer voor fluorescentiespectroscopie-metingen van enkelstrengs DNA een blanco-meting uit met enkel 200 millimolair natriumchloride en 50 millimolair natriumfosfaat, waarbij de excitatiegolflengte van Kleurstof één wordt gebruikt. Plaats vervolgens de cuvette met de DNA1-oplossing in de spectrometer. Registreer het fluorescentiespectrum.Om de fluorescentiespectroscopie-meting van de dubbelstrengs DNA uit te voeren, plaatst u de cuvet met de oplossing van dubbelstrengs DNA1 en DNA2 in de spectrometer. Registreer vervolgens het fluorescentiespectrum met behulp van de excitatiegolflengte van kleurstof één. Om een beter inzicht te krijgen in wat de geregistreerde spectra laten zien, bestraalt u de cuvetten met handheld UV-lampen.Observe de verandering in fluorescentiekleur van het enkelstrengs naar het dubbelstrengs DNA. De geregistreerde absorptiespectra tonen maxima op 465 nanometer voor enkelstrengs DNA1 en 546 nanometer voor enkelstrengs DNA2. Het geanneale dubbele streng van DNA1 en DNA2 vertoont maxima op zowel 469 als 567 nanometer.Beide absorptiemaxima vertonen een bathochrome verschuiving. De kleinste spectroscopische veranderingen zijn het resultaat van excitonic interacties tussen de kleurstoffen binnen de dubbele helixstructuur van het DNA. De overeenkomstige fluorescentiespectra vertonen een maximum op 537 nanometer voor enkelstrengs DNA1.Op 607 nanometer voor enkelstrengs DNA2. En op 615 nanometer voor geannealeerd, dubbelstrengs DNA1 en DNA2. Dubbelstrengs DNA1 en DNA2 vertonen uitsluitend het emissiemaximum van kleurstof twee, hoewel kleurstof één selectief wordt geëxciteerd, wat bewijst dat de energieoverdracht efficiënt plaatsvindt van kleurstof één naar kleurstof twee.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA synthetisch kan worden gemodificeerd door middel van een reeks katalytische reacties van een alkyn-gelabelde DNA-streng met een A-zijde.

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

We presenteren een nieuwe en krachtige integratie van nanofotonica (QD-FRET) en microfluidics tot de vorming van polyelektrolyt polyplexes, die naar verwachting een betere controle en de synthese van een uniforme en aanpasbare polyplexes voor toekomstige op nucleïnezuur gebaseerde therapieën te onderzoeken.

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

The video demonstrates a method for assessing receptor forces applied by immune cells using polyethylene glycol-anchored gold nanoparticles and DNA hairpin tension probes. CD8-positive T cell interactions trigger probe unfolding, emitting fluorescence while locking strands sustain the signal for quantifying the forces applied by immune cells.

Using DNA-Based Tension Probes to Assess Receptor Forces Applied by Immune Cells

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

Dit protocol beschrijft een toepassing van fluorescentie met één molecuul in situ hybridisatie (smFISH) om de in vivo kinetiek van mRNA-synthese en -afbraak te meten.

Indringende mRNA Kinetics in ruimte en tijd in Escherichia coli met behulp van Two-Color Single-Molecule Fluorescentie in Situ Hybridisatie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van DNA-gebaseerde spanningsondes om de receptorkrachten in beeld te brengen die door immuuncellen worden toegepast. Deze aanpak kan receptorkrachten &gt;4,7pN in realtime in kaart brengen en krachten in de loop van de tijd integreren.

DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Leer de synthese van golflengteverschuivende DNA-hybridisatie sondes met behulp van fotostabiele cyanine kleurstoffen via koper-gekatalyseerde klikchemie. Deze methode maakt real-time moleculaire beeldvorming mogelijk.

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

Meer video's verkennen