Name: Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer site-directed spin labeling en EPR spectroscopie voor membraanproteïne-dynamica met pentamere ligand-ionkanalen. Deze methode is geschikt voor grote proteïnes en biedt inzicht in eiwitgedrag in lipideomgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn erg dankbaar voor de huidige en voormalige leden van de Chakrapani lab voor kritisch lezen en opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​(1R01GM108921) en de American Heart Association (NCRP Wetenschapper Development Grant 12SDG12070069) en SC.

De auteurs hebben niets te onthullen.

EPR spectroscopie heeft zich bewezen als een ongeëvenaarde structurele aanpak in het kwantificeren van conformationele veranderingen in membraaneiwitten in een near-native omgeving. Deze aanpak stelt ons in staat een kijkje in de moleculaire details van eiwitten dynamiek die in hoge resolutie structuren worden verduisterd van X-ray kristallografie en Cryo-elektronenmicroscopie. Het is echter belangrijk om het technische beperkingen van deze benadering die de algemene toepasbaarheid beïnvloeden andere systemen en ook rek...

In de afgelopen tien jaar is de structurele begrip van pentamere-Ionotrope receptor (pLGIC) gegroeid in sprongen en grenzen, als gevolg van massa&#39;s met een hoge resolutie structuren van een aantal leden van de familie. Belangrijke factoren die tot de huidige ontwikkelingen op het gebied omvatten de ontdekking van prokaryote pLGIC kanalen 1-3 belangrijke vooruitgang in eukaryote membraan eiwitexpressie 4-6 en enorme doorbraken in structuurbepaling benaderingen. 7 Deze structuren een duidelijke consensus de totale bescherming van de driedimensionale architectuur van pLGIC. Echter, twee belangrijke gebieden die lijken te achter parcours zijn de functionele karakterisering van deze kanaal voorbereidingen en de mechanistische beschrijving van het kanaal functie. Gating conformationele veranderingen zijn complex en komen dus op 60 een afstand langs de lengte van het kanaal en deze overgangen worden uitgebreid gemoduleerd doormembraanlipiden. Met name negatieve lipiden, cholesterol en fosfolipiden blijkt de functie van pLGIC 8-11 moduleren. Hoewel de precieze rol van deze lipide bestanddelen in kanaal functie nog onbekend is, zou een volledige moleculaire begrip van gating vereist het bestuderen van deze kanalen in hun eigen omgeving. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) en elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie zijn de technieken van de keuze voor het bestuderen van eiwit dynamiek in opgeloste systemen. EPR spectroscopie wordt niet beperkt door de molecuulgrootte (volgens NMR) of optische eigenschap van het monster (volgens fluorescentiespectroscopie), waardoor aldus metingen van volledige lengte constructen opgelost in lipide natieve omstandigheden. De techniek is zeer gevoelig en heeft een relatief lage eisen monster (in de pico-mol bereik). Beide aspecten maken de techniek zeer geschikt voor het bestuderen van grote membraaneiwitten die moeilijk in te drukken in milligramhoeveelheden. Het gebruik van EPR spectroscopie gecombineerd met plaatsgerichte spin labeling werd ontwikkeld door Wayne Hubbell en collega&#39;s, en is aangepast voor het bestuderen van verschillende types eiwit. 12-24 EPR gegevens werden gebruikt om secundaire structuren te onderzoeken, veranderingen in het eiwit conformatie, membraan-insteekdieptes en eiwit-eiwit / eiwit-ligand interacties. De werkwijze omvat cysteïne vervanging op posities plaats door plaatsgerichte mutagenese. Sitespecifieke labeling waarborgen, is het noodzakelijk om natieve cysteïnes te vervangen door een andere aminozuur (bijv. Serine) een cysteïne-less sjabloon. Verreweg de meest populaire spinlabel een thiol-specifieke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate die hecht aan het eiwit via een disulfidebinding brug. Door de hoge specificiteit, relatief kleine omvang (iets groter dan tryptofaan) en flexibaarheid van het linkergebied, heeft deze spinlabel aangetoond uitstekende reactiviteit zelfs met een begraven cysteïne. Voorts tot de reactiviteit te maximaliseren, de markeringsreactie van het eiwit wordt uitgevoerd in de detergens gesolubiliseerde vorm uitgevoerd. Na afscheiding van de overmaat vrije spin-label door gelpermeatiechromatografie, wordt het eiwit opgelost in liposomen of bilaag nabootsen systemen gedefinieerde lipidesamenstelling. In het algemeen wordt cysteine ​​mutagenese goed verdragen in de meeste delen van het eiwit en de betrekkelijk geringe omvang van de spin-probe geeft vrijwel geen storing van de secundaire en tertiaire structuren. Opdat de modificatie vastgehouden wildtype functies kunnen het gemerkte en geregenereerde kanalen worden bestudeerd door de patch-clamp metingen. Het gemerkte-functioneel eiwit wordt vervolgens onderworpen aan spectroscopische metingen, die in wezen bevatten drie hoofdtypen informatie: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamica van lineshaap analyse; toegankelijkheid van de sonde te paramagnetische ontspanning agenten; en afstand distributie. 27 EPR afstanden worden gemeten door twee verschillende benaderingen. De eerste is gebaseerd op de Continuous Wave (CW) techniek, waarbij spectrale verbreding gevolg van dipolaire interacties tussen spin-labels (in de 8-20 Å afstandsbereik). Wordt gebruikt om de afstand te bepalen 28,29 De tweede is een gepulste EPR methode waar afstand metingen tot 70 Å. 30-34 kan worden verlengd in Double Electron Electron Resonance (herten), oscillaties in de spin-echo amplitude worden geanalyseerd om afstanden en de afstand distributies te bepalen. Hier de spin echo gemoduleerd op de frequentie van de dipool interactie. Samen worden deze parameters gebruikt om eiwit topologie, secundaire structurele elementen, en eiwit-conformationele veranderingen te bepalen.

<table><tbody><tr><td>Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF reaction buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM each dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 competent cells</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expression and Purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-&beta;-galactoside)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Amylose resin</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Empty polypropylene Chromatography column</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Spin Labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-&Delta;3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin lipid</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (Polystyrine beads)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher chemicals</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-maleimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-maleimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR measurement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX plastic capillaries</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site gericht spin labeling en epr spectroscopische studies van pentamere ligand-ionkanalen

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ionenkanaal gating is een stimulus-gedreven orkestratie van eiwitbewegingen die leidt tot overgangen tussen gesloten, open en gedessensibiliseerde toestanden. Fundamenteel voor deze overgangen is de intrinsieke flexibiliteit van het eiwit, die kritisch wordt gemoduleerd door de samenstelling van membraanlipiden. Om de structurele basis van kanaalfunctie beter te begrijpen, is het noodzakelijk om eiwitdynamica in een fysiologische membraanomgeving te bestuderen. Elektron Paramagnetische Resonantie (EPR) spectroscopie is een belangrijk hulpmiddel om conformationele overgangen tussen functionele toestanden te karakteriseren. In vergelijking met NMR en röntgenkristallografie is de informatie die uit EPR wordt verkregen intrinsiek van lagere resolutie. Echter, in tegenstelling tot andere technieken, is er in EPR geen bovengrens aan het moleculair gewicht van het eiwit, zijn de monstervereisten aanzienlijk lager en, belangrijker nog, het eiwit wordt niet beperkt door de krachten van het kristalrooster. Daarom is EPR uniek geschikt voor het bestuderen van grote eiwitcomplexen en eiwitten in gereconstitueerde systemen. In dit artikel zullen we algemene protocollen bespreken voor plaatsgerichte spinlabeling en membraanreconstitutie met behulp van een prokaryotisch proton-gegatterde pentamere Ligand-Gegatterde Ionenkanaal (pLGIC) uit Gloeobacter violaceus (GLIC) als voorbeeld. Er zal een combinatie van steady-state Continuous Wave (CW) en Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR benaderingen worden beschreven die een complete kwantitatieve karakterisering van kanaaldynamica mogelijk maken.

Biochemische karakterisering van Spin gelabelde GLIC Mutants Na de hierboven beschreven protocol zou levert doorgaans GLIC MBP-fusie-eiwit in het traject van 10 - 12 mg / l cultuur. Hoewel deze waarde kan variëren in verschillende mutanten, in het bijzonder voor functies begraven in het eiwit, kan de opbrengst aanzienlijk worden aangetast. In deze gevallen kan het kweekmedium volumes vereisen schaalvergroting....

Dit artikel beschrijft methoden voor door de gebruiker bepaalde spinlabeling en reconstituur van pentamere ligand-gebonden kanalen voor studies met Elektronen Paramagnetische Resonantie. Dit protocol kan worden aangepast voor elk membraaneiwit. De hier beschreven reconstituurmethode kan ook worden gebruikt voor patch-clamp metingen van macroscopische en enkele-kanaalstromen in een gedefinieerd lipidensysteem.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Het algemene doel van dit protocol is om de zuivering, site-directed spinlabeling en reconstitutie van een penameer ligand-gestuurd kanaal voor elektronenparamagnetische resonantie-onderzoeken te demonstreren. Het bestuderen van de dynamiek van membraaneiwitten in een fysiologisch relevante omgeving is essentieel om volledig te begrijpen hoe dit membraantransporteiwit functioneert. Vanwege deze behoeften is site-directed spinlabeling en de EPR-techniek naar mijn mening bij uitstek geschikt.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze niet beperkt wordt door de grootte van het eiwit. Daarom zouden site-directed spin labeling en EPR-spectroscopie de voorkeurstechnieken zijn wanneer u de dynamiek van grote eiwitten of eiwitten gereconstitueerd in membranen wilt bestuderen. Introduceer enkelvoudige cysteine-mutaties in het GLIC-gen via site-directed mutagenese.Stel een overnight-kweek op van de GLIC-cysteïne-mutant zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 100 milliliter steriele kaliumfosfaatbuffer toe aan het geautoclaveerde terrific broth-medium. Voeg daarna steriele glucose, Kanamycine en 10 milliliter van de overnight-kweek toe.Incubeer bij 37 °C in een schudmachine op 250 rpm. Voeg 50 milliliters glycerol toe en schud de cultuur verder tot de optische dichtheid bij 600 nanometers 1,0 tot 1,2 bereikt. Nadat de cellen zijn geïnduceerd met 200 micromolair IPTG, stelt u de schudmachine opnieuw in op 250 rpm en incubeert u verder gedurende ongeveer 16 uur bij 18 °C.Oogst de cellen in centrifugeflessen van één liter door te centrifugeren bij 8500 ×g, vier graden Celsius, gedurende 15 minuten. Giet het supernatant af en weeg de fles met de celpellet zoals beschreven in het tekstprotocol. Resuspendeer de bacteriële pellet in 150 milliliter ijskoude buffer A per één liter cultuur.Homogeniseer de cellen door ze door een celdisruptor te leiden in een koudekamer van vier graden Celsius. Herhaal dit proces drie keer, zodat het grootste deel van de bacteriën wordt gelyseerd. Centrifugeer de cellen bij 14, 000 ×g gedurende 15 minuten.Pipette vervolgens het supernatant af en breng dit over in een schone centrifugebuis. Na het centrifugeren van het supernatant bij 168.000 ×g gedurende één uur, wordt het supernatant voorzichtig weggegoten zonder het membraanpellet te verstoren. Neem het membraanpellet van één liter kweek en resuspendeer dit in Buffer A, aangevuld met 10% glycerol, tot een eindvolume van 50 milliliters.Voeg 0,5 gram DDM toe aan de membraansuspensie en nutate gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Verwijder na membraansolubilisatie de celdebris uit het lysaat door centrifugatie bij 168.000 ×g gedurende één uur. Bereid ondertussen de amylosehars voor.Breng drie milliliter hars met een pipet over naar een lege chromatografiekolom van polypropyleen. Was de hars door drie keer 10 bedvolumes water door te laten lopen, gevolgd door 10 bedvolumes Buffer A, bestaande uit 0,5 millimolair DDM. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant met een pipet en breng dit over naar een schone conische buis van 50 milliliter.Voeg voor batchgewijze binding vooraf geëquilibreerde amylosehars toe aan de conische buis. Bind het geëxtraheerde eiwit aan de amylosehars door het mengsel twee uur lang bij vier graden Celsius te nutateren. Laat vervolgens de gehele suspensie door een chromatografiekolom lopen en verzamel de doorstroomfractie.Verdun het GLIC-eiwit met 10 milliliters Buffer A die 40 milliomolar maltose bevat, naast 0,5 millimolar DDM en 05 millimolar TCEP. TCEP voorkomt oxidatie van cysteïne-zijketens. Verzamel het volledige eluaat.Concentreer het geëlueerde eiwit met een centrifugale concentrator tot tussen de vier en zes milligram per milliliter. Voeg HRV 3C protease toe en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Om site-directed spin-labeling uit te voeren, wordt eerst een tienvoudige molaire overmaat aan MTSL spin-label toegevoegd aan het met protease verteerde monster, wat resulteert in een molaire verhouding tussen GLIC-monomeer en MTSL van 1:10.Voeg na een incubatie van één uur meer spinlabel toe in een vijfvoudige molaire overmaat en incubeer nogmaals een uur. Leid het monster door een grootte-uitsluitings-fast protein liquid chromatography-kolom, of FPLC-kolom, die vooraf is geëquilibreerd met Buffer A en 0,5 millimolar DDM om de afgesplitste MBP-tag en het overmaat aan vrij spinlabel van de GLIC-pentameren te scheiden. Concentreer de eiwitoplossing met een centrifugale concentrator tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer acht tot tien milligram per milliliter en plaats deze op ijs.Het monster is nu klaar voor reconstitutie. Om de liposomen te bereiden, spoelt u een schone rondbodemkolf van 25 milliliter om met vijf milliliter chloroform en droogt u de kolf in een stroom nitrogengas in de zuurkast. Draag vervolgens 10 milligram asolectine over naar de kolf en droog de lipiden onder een continue stroom nitrogengas.Wanneer het chloroform is verdampt, wordt de kolf gedurende één uur in een vacuüm geplaatst om volledige droging te garanderen. Voeg vervolgens 1 mL reconstitutie Buffer A toe aan het gedroogde lipide en vortex de kolf krachtig om het lipidepellet in suspensie te brengen. Om kleine unilamellaire vesicles te prepareren, wordt de lipidesuspensie gesoniceerd in een koude badsonicator totdat de vesicle-oplossing min of meer transparant wordt en er geen klonten meer waarneembaar zijn.Voeg aan dit mengsel DDM toe tot een eindconcentratie van 4 mM en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het gezuiverde eiwit toe aan het lipidmengsel om het eiwit te reconstitueren. Na incubatie van het monster gedurende één uur bij 4 °C onder zachte rotatie, wordt het monster verdund tot 15 ml met Buffer A. Verwijder het resterende detergent in de suspensie met behulp van polystyreenkralen met hydrofobe poriën die detergent vangen.Voeg 80 milligram schone beads toe en incubeer de liposoomsuspensie overnacht op een nutator bij vier graden Celsius. Breng de liposomen de volgende dag met behulp van een kolomfilter over naar een ultracentrifugebuis van 25 milliliter om de beads te verwijderen en verdun het monster verder tot 25 milliliter. Decanteer na het centrifugeren van de monsters bij 168.000 ×g gedurende twee uur het supernatant en resuspendeer het pellet met 100 microliter Buffer B. Om continue-golf EPR-spectroscopie uit te voeren, brengt u eerst de liposoomsuspensie over naar een buisje van 200 microliter en pellet u de monsters met behulp van een centrifuge.Na het weggooien van het supernatant is het monster klaar voor EPR-metingen. Verwijder zoveel mogelijk buffer uit het liposoommonster. Om de bufferuitwisseling uit te voeren, brengt u 20 µL van het liposoompellet met een pipet over naar een microcentrifugebuisje.Voeg 180 µL Buffer D toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 42 °C. Centrifugeer het monster, verwijder het supernatant met een pipet en herhaal dit proces drie keer om een volledige bufferuitwisseling te garanderen. Gasdoorlatende plastic capillairen zijn geschikt voor metingen van zowel spectrale lijnvormen als oplosmiddeltoegankelijkheid.Tik de capillair tegen het gepellette proteoliposoom om het monster naar binnen te trekken en verzegel het uiteinde met botwax. Hier wordt de biochemische karakterisering van spin-gelabelde GLIC-mutanten getoond via het gelfiltratiechromatogram van spin-gelabelde GLIC na proteolytische splitsing van de MBP-tag. De pieken komen overeen met het GLIC-pentameer en vrij MBP.De SDS-page gel toont het niet-geknipte monomerische GLIC-MBP-fusie-eiwit vóór gelfiltratie, evenals de MBP- en GLIC-fracties verkregen uit gelfiltratie. Er werd een FRET-gebaseerde assay uitgevoerd om de aggregatietoestand van GLIC te monitoren, gereconstitueerd in verschillende membraanlipiden. FRET-metingen werden verricht op monsters na een nacht reconstitutie en na meerdere vries-dooi-cycli van de monsters.In een inside-out patch, uitgesneden uit gereconstitueerde asolectin-vesikels, wordt GLIC geactiveerd door pH-sprongen met behulp van een snelle oplossing-uitwisselaar. De kanalen activeren in ongeveer 10 milliseconden en desensitiseren met een tijdconstante van één tot drie seconden. Structurele herschikkingen worden waargenomen tijdens de kanaactivatie.Hier worden continu-golf elektronparamagnetische resonantiespectra voor een positie in de porie-voerende M2-helix gebruikt om veranderingen in amplitude en lijnvorm als reactie op pH-veranderingen aan te tonen. EPR-spectroscopie is een ongeëvenaarde structurele benadering om conformationele veranderingen van membraaneiwitten in hun natuurlijke omgeving te meten, en het biedt een inkijkje in moleculaire details van proteïnedynamiek die verborgen blijven in hoge-resolutie röntgenstructuren of cryo-EM-structuren. Bij het werken met deze techniek is het belangrijk om in gedachten te houden dat mutaties vaak leiden tot een lage en gebrekkige oligomere stabiliteit van het eiwit.Daarom is het mogelijk dat u een strategie moet bedenken om deze problemen aan te pakken. Door deze bevindingen uit EPR-studies te combineren met functionele metingen, kunnen we een vollediger beeld krijgen om de structuur-functierelatie te bestuderen; toekomstige technologische ontwikkelingen zijn erop gericht deze krachtige aanpak te gebruiken om complexere menselijke kanalen in geavanceerdere lipidemilieus te bestuderen.

site-directed-spin-labeling-epr-spectroscopic-studies-pentameric

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Beschrijven we een eenvoudig protocol om de hersenen eiwitten die zich binden aan de volledige lengte C-terminus van de ATP-gated P2X2 receptoren te identificeren. De uitbreiding en systematische toepassing van deze aanpak op alle P2X receptoren zal naar verwachting leiden tot een beter begrip van P2X receptor signalering.

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het onderzoeken van ionkanaalactiviteit. Er zijn echter tal van alternatieve benaderingen, waaronder optische methoden. Hier beschrijven we een methode om de activiteit van de leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8) gevormde anionkanalen te monitoren met behulp van een op Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde methode tussen subeenheden.

Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET)

Leer site-directed spin labeling en EPR spectroscopie voor membraanproteïne-dynamica met pentamere ligand-ionkanalen. Deze methode is geschikt voor grote proteïnes en biedt inzicht in eiwitgedrag in lipideomgevingen.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Meer video's verkennen