Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Het algemene doel van dit protocol is om de zuivering, site-directed spinlabeling en reconstitutie van een penameer ligand-gestuurd kanaal voor elektronenparamagnetische resonantie-onderzoeken te demonstreren. Het bestuderen van de dynamiek van membraaneiwitten in een fysiologisch relevante omgeving is essentieel om volledig te begrijpen hoe dit membraantransporteiwit functioneert. Vanwege deze behoeften is site-directed spinlabeling en de EPR-techniek naar mijn mening bij uitstek geschikt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze niet beperkt wordt door de grootte van het eiwit. Daarom zouden site-directed spin labeling en EPR-spectroscopie de voorkeurstechnieken zijn wanneer u de dynamiek van grote eiwitten of eiwitten gereconstitueerd in membranen wilt bestuderen. Introduceer enkelvoudige cysteine-mutaties in het GLIC-gen via site-directed mutagenese.

Stel een overnight-kweek op van de GLIC-cysteïne-mutant zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 100 milliliter steriele kaliumfosfaatbuffer toe aan het geautoclaveerde terrific broth-medium. Voeg daarna steriele glucose, Kanamycine en 10 milliliter van de overnight-kweek toe.

Incubeer bij 37 °C in een schudmachine op 250 rpm. Voeg 50 milliliters glycerol toe en schud de cultuur verder tot de optische dichtheid bij 600 nanometers 1,0 tot 1,2 bereikt. Nadat de cellen zijn geïnduceerd met 200 micromolair IPTG, stelt u de schudmachine opnieuw in op 250 rpm en incubeert u verder gedurende ongeveer 16 uur bij 18 °C.

Oogst de cellen in centrifugeflessen van één liter door te centrifugeren bij 8500 ×g, vier graden Celsius, gedurende 15 minuten. Giet het supernatant af en weeg de fles met de celpellet zoals beschreven in het tekstprotocol. Resuspendeer de bacteriële pellet in 150 milliliter ijskoude buffer A per één liter cultuur.

Homogeniseer de cellen door ze door een celdisruptor te leiden in een koudekamer van vier graden Celsius. Herhaal dit proces drie keer, zodat het grootste deel van de bacteriën wordt gelyseerd. Centrifugeer de cellen bij 14, 000 ×g gedurende 15 minuten.

Pipette vervolgens het supernatant af en breng dit over in een schone centrifugebuis. Na het centrifugeren van het supernatant bij 168.000 ×g gedurende één uur, wordt het supernatant voorzichtig weggegoten zonder het membraanpellet te verstoren. Neem het membraanpellet van één liter kweek en resuspendeer dit in Buffer A, aangevuld met 10% glycerol, tot een eindvolume van 50 milliliters.

Voeg 0,5 gram DDM toe aan de membraansuspensie en nutate gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Verwijder na membraansolubilisatie de celdebris uit het lysaat door centrifugatie bij 168.000 ×g gedurende één uur. Bereid ondertussen de amylosehars voor.

Breng drie milliliter hars met een pipet over naar een lege chromatografiekolom van polypropyleen. Was de hars door drie keer 10 bedvolumes water door te laten lopen, gevolgd door 10 bedvolumes Buffer A, bestaande uit 0,5 millimolair DDM. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant met een pipet en breng dit over naar een schone conische buis van 50 milliliter.

Voeg voor batchgewijze binding vooraf geëquilibreerde amylosehars toe aan de conische buis. Bind het geëxtraheerde eiwit aan de amylosehars door het mengsel twee uur lang bij vier graden Celsius te nutateren. Laat vervolgens de gehele suspensie door een chromatografiekolom lopen en verzamel de doorstroomfractie.

Verdun het GLIC-eiwit met 10 milliliters Buffer A die 40 milliomolar maltose bevat, naast 0,5 millimolar DDM en 05 millimolar TCEP. TCEP voorkomt oxidatie van cysteïne-zijketens. Verzamel het volledige eluaat.

Concentreer het geëlueerde eiwit met een centrifugale concentrator tot tussen de vier en zes milligram per milliliter. Voeg HRV 3C protease toe en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Om site-directed spin-labeling uit te voeren, wordt eerst een tienvoudige molaire overmaat aan MTSL spin-label toegevoegd aan het met protease verteerde monster, wat resulteert in een molaire verhouding tussen GLIC-monomeer en MTSL van 1:10.

Voeg na een incubatie van één uur meer spinlabel toe in een vijfvoudige molaire overmaat en incubeer nogmaals een uur. Leid het monster door een grootte-uitsluitings-fast protein liquid chromatography-kolom, of FPLC-kolom, die vooraf is geëquilibreerd met Buffer A en 0,5 millimolar DDM om de afgesplitste MBP-tag en het overmaat aan vrij spinlabel van de GLIC-pentameren te scheiden. Concentreer de eiwitoplossing met een centrifugale concentrator tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer acht tot tien milligram per milliliter en plaats deze op ijs.

Het monster is nu klaar voor reconstitutie. Om de liposomen te bereiden, spoelt u een schone rondbodemkolf van 25 milliliter om met vijf milliliter chloroform en droogt u de kolf in een stroom nitrogengas in de zuurkast. Draag vervolgens 10 milligram asolectine over naar de kolf en droog de lipiden onder een continue stroom nitrogengas.

Wanneer het chloroform is verdampt, wordt de kolf gedurende één uur in een vacuüm geplaatst om volledige droging te garanderen. Voeg vervolgens 1 mL reconstitutie Buffer A toe aan het gedroogde lipide en vortex de kolf krachtig om het lipidepellet in suspensie te brengen. Om kleine unilamellaire vesicles te prepareren, wordt de lipidesuspensie gesoniceerd in een koude badsonicator totdat de vesicle-oplossing min of meer transparant wordt en er geen klonten meer waarneembaar zijn.

Voeg aan dit mengsel DDM toe tot een eindconcentratie van 4 mM en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het gezuiverde eiwit toe aan het lipidmengsel om het eiwit te reconstitueren. Na incubatie van het monster gedurende één uur bij 4 °C onder zachte rotatie, wordt het monster verdund tot 15 ml met Buffer A. Verwijder het resterende detergent in de suspensie met behulp van polystyreenkralen met hydrofobe poriën die detergent vangen.

Voeg 80 milligram schone beads toe en incubeer de liposoomsuspensie overnacht op een nutator bij vier graden Celsius. Breng de liposomen de volgende dag met behulp van een kolomfilter over naar een ultracentrifugebuis van 25 milliliter om de beads te verwijderen en verdun het monster verder tot 25 milliliter. Decanteer na het centrifugeren van de monsters bij 168.000 ×g gedurende twee uur het supernatant en resuspendeer het pellet met 100 microliter Buffer B. Om continue-golf EPR-spectroscopie uit te voeren, brengt u eerst de liposoomsuspensie over naar een buisje van 200 microliter en pellet u de monsters met behulp van een centrifuge.

Na het weggooien van het supernatant is het monster klaar voor EPR-metingen. Verwijder zoveel mogelijk buffer uit het liposoommonster. Om de bufferuitwisseling uit te voeren, brengt u 20 µL van het liposoompellet met een pipet over naar een microcentrifugebuisje.

Voeg 180 µL Buffer D toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 42 °C. Centrifugeer het monster, verwijder het supernatant met een pipet en herhaal dit proces drie keer om een volledige bufferuitwisseling te garanderen. Gasdoorlatende plastic capillairen zijn geschikt voor metingen van zowel spectrale lijnvormen als oplosmiddeltoegankelijkheid.

Tik de capillair tegen het gepellette proteoliposoom om het monster naar binnen te trekken en verzegel het uiteinde met botwax. Hier wordt de biochemische karakterisering van spin-gelabelde GLIC-mutanten getoond via het gelfiltratiechromatogram van spin-gelabelde GLIC na proteolytische splitsing van de MBP-tag. De pieken komen overeen met het GLIC-pentameer en vrij MBP.

De SDS-page gel toont het niet-geknipte monomerische GLIC-MBP-fusie-eiwit vóór gelfiltratie, evenals de MBP- en GLIC-fracties verkregen uit gelfiltratie. Er werd een FRET-gebaseerde assay uitgevoerd om de aggregatietoestand van GLIC te monitoren, gereconstitueerd in verschillende membraanlipiden. FRET-metingen werden verricht op monsters na een nacht reconstitutie en na meerdere vries-dooi-cycli van de monsters.

In een inside-out patch, uitgesneden uit gereconstitueerde asolectin-vesikels, wordt GLIC geactiveerd door pH-sprongen met behulp van een snelle oplossing-uitwisselaar. De kanalen activeren in ongeveer 10 milliseconden en desensitiseren met een tijdconstante van één tot drie seconden. Structurele herschikkingen worden waargenomen tijdens de kanaactivatie.

Hier worden continu-golf elektronparamagnetische resonantiespectra voor een positie in de porie-voerende M2-helix gebruikt om veranderingen in amplitude en lijnvorm als reactie op pH-veranderingen aan te tonen. EPR-spectroscopie is een ongeëvenaarde structurele benadering om conformationele veranderingen van membraaneiwitten in hun natuurlijke omgeving te meten, en het biedt een inkijkje in moleculaire details van proteïnedynamiek die verborgen blijven in hoge-resolutie röntgenstructuren of cryo-EM-structuren. Bij het werken met deze techniek is het belangrijk om in gedachten te houden dat mutaties vaak leiden tot een lage en gebrekkige oligomere stabiliteit van het eiwit.

Daarom is het mogelijk dat u een strategie moet bedenken om deze problemen aan te pakken. Door deze bevindingen uit EPR-studies te combineren met functionele metingen, kunnen we een vollediger beeld krijgen om de structuur-functierelatie te bestuderen; toekomstige technologische ontwikkelingen zijn erop gericht deze krachtige aanpak te gebruiken om complexere menselijke kanalen in geavanceerdere lipidemilieus te bestuderen.