Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes
22 juni 2016
Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.
Het algemene doel van dit protocol is om tolerogeen en volwassen dendritische cellen uit monocyten te genereren voor experimenten of vaccinontwikkeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie door een model te bieden om de ontwikkeling, rijping en antigeenpresentatie van dendritische cellen te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de generatie van grote aantallen dendritische cellen in vitro voor experimenten mogelijk maakt.
Begin met monocytenverrijking door 20 microliters van eerder bereide perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC-celsuspensie, te mengen met 20 microliters tripan blauw, om het aantal levende cellen te tellen met behulp van een cytometer. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie. Zuig de supernatant volledig af en suspendeer het celpellet opnieuw in een concentratie van 80 microliters kleuringsbuffer voor 10 tot de zevende cellen.
Voeg 20 microliters CD-4 microkralen toe per 10 tot de zevende cellen. Meng goed en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen met één milliliter kleuringsbuffer per 10 tot de zevende cellen en centrifugeer de cellen.
Zuig de supernatant volledig af en suspendeer het celpellet opnieuw. Verkrijg een mediumkolom voor maximaal twee keer 10 tot de achtste totaal aantal cellen en plaats de kolom in het magnetische veld van de separator. Spoel vervolgens de kolom met 500 microliters kleuringsbuffer.
Pipetteer de celsuspensie op de kolom en verzamel de ongelabelde cellen die door de kolom gaan in een 15-milliliter buis. Vervang een nieuwe 15-milliliter buis onder de kolom en was de kolom drie keer met 500 microliters kleuringsbuffer. Zorg ervoor dat de kolomreservoir leeg is voordat u nieuwe kleuringsbuffer tussen de wasbeurten toevoegt.
Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze op een verse 15-milliliter buis. Pipetteer één milliliter kleuringsbuffer op de kolom en spoel onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen uit door de plunjer stevig in de kolom te duwen. Herhaal vervolgens de magnetische scheidingsstappen met de illudeerde fractie in een nieuwe kolom om de zuiverheid van de CD14 plus cellen te verhogen.
Zaai vier sets CD14 plus monocyten in een concentratie van nul punt drie tot nul punt vijf keer 10 tot de zesde per milliliter celcultuurmedium van IL-4 in zes welbplaten. Incubeer de cellen in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius met vijf procent CO2. Op dag vier verwijdert u 850 microliters medium uit de cultuur en centrifugeert u.
Zuig de supernatant af en suspendeer het pellet in één milliliter celcultuurmedium. Voeg het cellenmengsel terug toe aan de cultuur. Op dag vijf voegt u één microliter vitamine D3-voorraad en één microliter dexamethazon-voorraad per één liter medium toe aan twee van de sets, om tolerogeen moDCs te genereren.
Op dag zes voegt u 200 nanogram per milliliter GMCSF en 200 nanogram per milliliter IL-4 toe aan alle sets. Voeg één microgram per milliliter LPS toe aan een van de sets behandeld met alleen GMCSF en IL-4 om volwassen moDCs te genereren. Voeg één microgram per milliliter LPS toe aan een set van de tolerogeen moDCs om LPS tolerogeen moDCs te genereren.
Ten slotte, op dag zeven, oogst u de verschillende soorten moDCs door de kweekschaal te spoelen met PVS EDTA. De onvolgroeide moDCs werden gegenereerd door GMCSF en IL-4 toe te voegen aan gezuiverde CD-14 plus monocyten op dagen nul, vier en zes. Toevoeging van vitamine D3 en dexamethazon na GMCSF en IL-4 resulteerde in de differentiatie van onvolgroeide moDCs in tolerogeen moDCs.
LPS werd toegevoegd om de rijping van onvolgroeide moDCs tot volwassen moDCs te induceren. En tolerogeen moDCs werden gestimuleerd met LPS om weerstand tegen rijping te verifiëren. Een analyse van DC-oppervlaktemarkers onthulde dat volwassen moDCs de hoogste niveaus van rijpingsmarkers HLA-DR, CD80, CD83 en CD86 tot expressie brengen.
Omgekeerd vertoonden tolerogeen moDCs een verhoogde expressie van CD14, BDCA3 en immunoglobuline-achtige transcripten in vergelijking met onvolgroeide en volwassen moDCs. Met behulp van rood CMXRos om de mitochondriale activiteit weer te geven, werd waargenomen dat tolerogeen moDCs een hogere mitochondriale activiteit hadden in vergelijking met de andere moDC-gedifferentieerde subtypes. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immunologie om metabolische kenmerken in dendritische cellen te verkennen voor de ontwikkeling van vaccins en immunotherapie.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van tolerogene en mature dendritische cellen uit monocyten, die kunnen worden gebruikt voor immunologisch onderzoek en vaccinontwikkeling. De methode maakt de differentiatie van immature monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC's) mogelijk naar verschillende fenotypes met variërende metabole kenmerken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Dendritische celbiologie
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- Dendritische cellen spelen een cruciale rol bij het reguleren van immuniteit en tolerantie.
- Inzicht in de differentiatie van moDC's kan leiden tot een beter begrip van immuunresponsen.
- Tolerogene dendritische cellen kunnen nuttig zijn bij de ontwikkeling van therapieën voor auto-immuunziekten.
- Rijpe dendritische cellen zijn essentieel voor een effectieve antigeenpresentatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het in vitro genereren van grote aantallen dendritische cellen.
- Om de metabole kenmerken van dendritische cellen tijdens de differentiatie te onderzoeken.
- Om een model te bieden voor het bestuderen van de rijping en functie van dendritische cellen.
Gebruikte methoden
- Verrijking van monocyten uit perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs).
- Magnetische scheiding om CD14+ monocyten te isoleren.
- Kweek van monocyten met specifieke cytokinen en verbindingen om differentiatie te induceren.
- Analyse van oppervlaktemarkers van dendritische cellen en metabolische activiteit.
Belangrijkste resultaten
- Tolerogene moDC's vertoonden een hogere mitochondriale activiteit in vergelijking met andere subtypen.
- Mature moDC's vertoonden verhoogde expressieniveaus van maturatiemarkers zoals HLA-DR en CD80.
- Tolerogene moDC's vertoonden een verhoogde expressie van CD14 en immunoglobulin-achtige transcripten.
- Het differentiatieprotocol heeft succesvol verschillende dendritische celpopulaties gegenereerd voor onderzoek.
Conclusies
- Deze methode maakt de effectieve generatie van dendritische cellen voor immunologische studies mogelijk.
- Inzicht in de metabole profielen van dendritische cellen kan helpen bij de ontwikkeling van vaccins.
- De bevindingen dragen bij aan de kennis van de biologie van dendritische cellen en hun rol bij de immuunregulatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het genereren van dendritische cellen met gedefinieerde immunogene of tolerogene fenotypes maakt een nauwkeurige analyse mogelijk van immuunmechanismen die relevant zijn voor immunotherapie en de ontwikkeling van vaccins. Deze mogelijkheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie in een vroeg stadium en vermindert de risico's van translationele programma's door gestandaardiseerde, schaalbare cellulaire modellen te bieden. Deze aanpak is direct relevant voor portfolio-teams die discovery-biologie willen afstemmen op downstream klinische translatie in immuunmodulatie.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanistische studies naar de rijping van dendritische cellen en antigenpresentatiepaden mogelijk.
- Ondersteunt de functionele validatie van immuuntargets door in vitro verschillende DC-fenotypes te genereren.
- Faciliteert biologische risicoreductie door de impact van de metabole status op de immuunfunctie te verduidelijken.
- Biedt een reproduceerbaar systeem voor hypothese-gestuurde analyse van immuuntolerantiemechanismen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gevalideerde, fenotypisch verschillende dendritische celpopulaties voor downstream screening-workflows.
- Standaardiseert de karakterisering van oppervlaktemarkers en het metabolische fenotype voor de reproduceerbaarheid van de assay.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van antigeenpresentatie en het potentieel voor T-celactivatie mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare preparatie van DC's voor screeningplatforms voor verbindingen of antigenen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro DC-modellen uit met immuunmodulatiestrategieën die relevant zijn voor ziekten.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie van immunotherapieën en tolerogene interventies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door voorspellende gegevens te leveren over DC-functie en metabolisch fenotype.
- Faciliteert de exploratie van translationele biomarkers gekoppeld aan DC-rijping en tolerantie.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinische fase door het mogelijk maken van de generatie en karakterisering van dendritische cel-subtypes voor immuunmodulatiestudies.
- Discovery Biology: Biedt een platform voor het testen van hypothesen over DC-maturatie, antigeenpresentatie en tolerantie-inductie.
- Screening: Levert reproduceerbare, fenotypisch gedefinieerde DC's voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert kwantitatieve read-outs van oppervlaktemarkers en metabole activiteit voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen voor immuuninterventie en vaccinontwikkeling.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor het genereren van DC's over meerdere immunologieprogramma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van immuuntargets en mechanische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de generatie en karakterisering van DC's voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor immunomodulerende programma's en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immuunmodulerende activa en translationele kandidaten mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in monocytenisolatie, celkweek en immunofenotypering.
- Toegang tot flowcytometrie en assays voor metabolische activiteit is nodig voor de karakterisering van DC.
- Standaardisatie van cytokine- en maturatieprotocollen tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende donorbronnen of ziektemodellen.
- Beperkingen omvatten variabiliteit in primaire celbronnen en potentiële batch-effecten.
