-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Het algemene doel van deze techniek is om het genoombrede DNA-methyleringslandschap in grote patiëntcohorten systematisch te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het epigenetische veld, met name met betrekking tot welke regio's in het DNA-methyleringslandschap gedereguleerd raken bij patiënten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal patiënten op kosteneffectieve wijze kan worden onderzocht.

Deze technologie kan positieve implicaties hebben voor de therapie en diagnose van de patiënt, omdat we bestaande biomarkers kunnen onderzoeken en ook nieuwe biomarkers kunnen identificeren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in een patiëntencohort, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals DNA-methylatie in cellen afkomstig van gekweekte cellijnen uit muis-monsters. De procedure wordt, samen met Dr. Ya-Ting Hsu, gedemonstreerd door Mr. Joseph Liu, een technicus in ons laboratorium.

Het sequentiegedeelte zal worden gedemonstreerd door Ms. Dawn Garcia, een technicus in onze sequencing core. Nadat genomisch DNA uit tumor- of normaal weefsel is geïsoleerd volgens het tekstprotocol, voegt u 1,2 µg totaal genomisch DNA toe aan 96 µl TE-buffer en 24 µl 5X bind wash buffer om een oplossing van 120 µl te maken. Sonicate de DNA-oplossing gedurende 30 seconden en laat deze vervolgens 30 seconden rusten.

Herhaal de sonicatie in totaal 20 tot 25 keer. Gebruik een bioanalyzer-systeem met een commerciële DNA-kit met hoge gevoeligheid volgens het protocol van de fabrikant om één microliter van de gesoniceerde DNA-oplossing te analyseren om de grootte van de fragmenten te controleren. Deze moeten in het bereik van 150 tot 350 baseparen liggen.

Om elutie van een enkele fractie uit te voeren, bereidt u de elutiebuffer door een één-op-één oplossing te maken van buffer met laag zoutgehalte en buffer met hoog zoutgehalte. Gebruik 200 µL van de elutiebuffer om de methyl-bindende DNA- of MBD-beads opnieuw te suspenderen en incubeer de suspensie drie minuten op een rotermenger. Plaats de buis na de incubatie gedurende één minuut op het magnetische rek, pipetteer vervolgens voorzichtig de vloeistof zonder dat de pipetpunt de beads raakt en breng deze over naar een schone, DNase-vrije microcentrifugebuis van 1,5 mL.

Bewaar dit monster op ijs. Herhaal de elutie voor het tweede monster en verzamel dit in dezelfde buis als het eerste monster. Voeg aan elke niet-gevangen was- en verdunningsfractie één microliter glycogeen toe, een tiende van het volume van drie molar natriumacetaat, pH 5.2, en twee monster-volumes 100% ethanol.

Nadat de oplossing goed is gemengd, wordt deze gedurende ten minste twee uur geïncubeerd bij -80 °C. Centrifugeer de reactie vervolgens 15 minuten bij 11.363 ×g en 4 °C. Verwijder voorzichtig de supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg 500 µL koude 70% ethanol toe.

Centrifugeer de buis opnieuw voordat u de ethanolwas herhaalt. Laat het pellet vijf minuten aan de lucht drogen. Gebruik vervolgens DNase-vrij water of buffer om het opnieuw op te lossen.

Controleer of de totale hoeveelheid DNA meer dan 20 nanogram is volgens het tekstprotocol. Plaats het DNA vervolgens op ijs of bewaar het bij -20 °C tot verder gebruik. Gebruik voor de bereiding van de DNA-sequencingbibliotheek een volledig geautomatiseerd systeem voor bibliotheekconstructie en volg het standaardprotocol dat door de fabrikant wordt geleverd.

Selecteer DNA-fragmenten met een lengte van 200 tot 400 basenparen voor de bibliotheekpreparatie. Verwijder na het prepareren de DNA-sequencingbibliotheek uit de reactie en gebruik een fluorometrisch kwantificatiesysteem om de DNA-sequencingbibliotheek te kwantificeren. Voeg voor het opzetten van een PCR-amplificatiereactie 15 µL DNA-sequencingbibliotheek, 25 µL PCR-mastermix, twee µL PCR-primermix en acht µL water toe aan een PCR-buisje.

Gebruik het programma zoals beschreven in het tekstprotocol en breng indien nodig aanpassingen aan op basis van de aanbevelingen van de fabrikant van de PCR-mix. Voer voldoende cycli uit om twee tot 10 millimolair library-DNA te produceren. Na het opzuiveren van de PCR-reacties wordt elk monster voorzien van een barcode en worden vier monsters samengevoegd in één lane van een flowcell.

Gebruik het standaard single-read protocol van 50 basenparen van onze sequencing. Voer de bio-informatica uit volgens het tekstprotocol. Met behulp van MBD-cap werd geprobeerd CpG-eilanden in verschillende genomische regio's te identificeren die differentieel gemethyleerd zijn in tumoren ten opzichte van normaal weefsel; deze studie onthulde dat van het totaal aantal CpG-eilanden in genpromotoren 19,5% differentiële methylering vertoonde in tumoren vergeleken met normaal weefsel.

Op dezelfde wijze vertoonde 55,2% van de onderzochte intragenische CpG-eilanden differentiële methylering. Intragenische promotors vertoonden 28,1% en voor genpromotors zonder CpG-eilanden vertoonde 1,8% differentiële methylering. Deze heatmap beeldt duidelijk de differentieel gemethyleerde regio's uit over 77 borsttumoren, 10 normale borstweefsels en 38 borstkankercellijnen.

In deze figuur wordt de methylering gekwantificeerd in twee subgroepen van endometriumcarcinoom, niet-recidiverend versus recidiverend, bij twee patiënten op verschillende CpG-sites in het CpG-eiland van de promoter van het geïdentificeerde doelgen SFRP1. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vier tot vijf dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eerst de kwaliteit van het genomische DNA dat wordt getest te controleren. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden zoals pyrosequencing worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals: wat zijn de exacte CpG's in de geïdentificeerde differentieel verrijkte regio's die zijn gewijzigd? Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van epigenetica om DNA-methylering in grote patiëntencohorten te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe genomische DNA-methylatie in patiëntmonsters kan worden onderzocht met behulp van de MBD cap sequencing-techniek. Houd er rekening mee dat het soms moeilijk kan zijn om DNA van hoge kwaliteit te verkrijgen uit bijvoorbeeld FFP- en DNA-monsters; daarom wordt er altijd een juiste beoordeling van het genomische DNA uitgevoerd wanneer we de procedure uitvoeren.