-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Het algemene doel van deze techniek is om systematisch het genoombrede DNA-methylatielandschap in grote patiëntencohorten te onderzoeken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het epigenetische veld te beantwoorden, vooral met betrekking tot welke regio's in het DNA-methylatielandschap bij patiënten worden ontregeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal patiënten op een kosteneffectieve manier kan worden onderzocht.

Deze technologie kan positieve implicaties hebben voor de therapie en diagnose van de patiënt, omdat we bestaande biomarkers kunnen onderzoeken en ook nieuwe biomarkers kunnen identificeren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de patiëntencohort, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals DNA-methylatie in cellen afgeleid van gekweekte cellijnen van muis-afgeleide monsters. Het demonstreren van deze procedure samen met Dr. Ya-Ting Hsu zal Mr. Joseph Liu zijn, een technicus in ons lab.

Het sequentieonderdeel zal worden gedemonstreerd door Ms. Dawn Garcia, een technicus in onze sequencingcore. Na het isoleren van genomisch DNA uit tumor- of normaal weefsel volgens het tekstprotocol, voegt u 1,2 microgram totaal genomisch DNA toe aan 96 microliter TE-buffer en 24 microliter 5X bindwasbuffer om een oplossing van 120 microliter te maken. Soniceer de DNA-oplossing gedurende 30 seconden en laat deze vervolgens 30 seconden rusten.

Herhaal de sonicatie in totaal 20 tot 25 keer. Gebruik een bioanalyzer-systeem met een commercieel DNA-kit met hoge gevoeligheid volgens het protocol van de fabrikant om één microliter gesoniceerde DNA-oplossing te draaien om de grootte van de fragmenten te controleren. Ze moeten in het bereik van 150 tot 350 basenparen liggen.

Voer een enkele fractie-elutie uit door elutiebuffer te bereiden door een een-op-een-oplossing van laag-zoutbuffer en hoog-zoutbuffer te maken. Gebruik 200 microliter van de elutiebuffer om de methyl-bindende DNA- of MBD-kralen te resuspenderen en incubeer de suspensie gedurende drie minuten op een roterende mixer. Plaats na de incubatie de buis gedurende één minuut op de magnetische rek en pipet vervolgens voorzichtig de vloeistof zonder de punt van de pipet op de kralen aan te raken en breng deze over in een schone DNase-vrije 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Bewaar deze monster op ijs. Herhaal de elutie voor het tweede monster en verzamel het in dezelfde buis als het eerste monster. Voeg aan elke niet-gevangen was- en verdunningsfractie een microliter glycogeen toe, een tiende van het volume van drie molaire natriumacetaat, pH 5,2, en twee monstervolumes van 100% ethanol.

Na goed mengen van de oplossing, incubeer gedurende minimaal twee uur bij min 80 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de reactie gedurende 15 minuten bij 11.363 keer g en vier graden Celsius. Gooi voorzichtig de supernatant weg zonder de pellet te verstoren en voeg 500 microliter koud 70% ethanol toe.

Centrifugeer de buis opnieuw voordat u de ethanolwas herhaalt. Laat de pellet vijf minuten aan de lucht drogen. Gebruik vervolgens DNase-vrij water of buffer om het op te schorten.

Controleer of de totale hoeveelheid DNA volgens het tekstprotocol meer dan 20 nanogram is. Plaats vervolgens het DNA op ijs of bewaar het bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Voor DNA-sequencingbibliotheekvoorbereiding, gebruik een volledig geautomatiseerd bibliotheekconstructiesysteem en volg het standaardprotocol dat door de fabrikant wordt geleverd.

Selecteer DNA-fragmenten van 200 tot 400 basenparen lang voor bibliotheekvoorbereiding. Nadat de DNA-sequencingbibliotheek is voorbereid, verwijder de reactie en gebruik een fluorometrische kwantificeringssysteem om de DNA-sequencingbibliotheek te kwantificeren. Om een PCR-amplificatiereactie op te zetten, voegt u in een PCR-buis 15 microliter DNA-sequencingbibliotheek, 25 microliter PCR-mastermix, twee microliter PCR-primermix en acht microliter water toe.

Gebruik het programma dat in het tekstprotocol is geschetst, waarbij u aanpassingen doet op basis van de aanbevelingen van de fabrikant van het PCR-mengsel. Voer voldoende cycli uit om twee tot 10 millimolair bibliotheek-DNA te produceren. Na het opruimen van de PCR-reacties, barcode elk monster en plaats vier monsters samen in één kanaal van een flowcell.

Gebruik het standaard 50 basenpaar single-read-protocol van onze sequencing. Voer bioinformatica uit volgens het tekstprotocol. Met behulp van MBD cap seek om CpG-eilanden te identificeren in verschillende genomische regio's die differentieel gemethyleerd zijn in tumor ten opzichte van normaal weefsel, onthulde deze studie dat van de totale CpG-eilanden die zich in genregulerende promotoren bevinden, 19,5% differentiële methylering vertoonden in tumoren vergeleken met normaal.

Evenzo vertoonde 55,2% van de intragene CpG-eilanden die werden onderzocht differentiële methylering. Intragene promotoren vertoonden 28,1% En voor genregulerende promotoren zonder CpG-eilanden, vertoonde 1,8% differentiële methylering. Deze hittekaart beeldt duidelijk differentieel gemethyleerde regio's af in 77 borsttumoren, 10 normale borstweefsels en 38 borstkankercellijnen.

In deze figuur wordt methylering gekwantificeerd in twee endometriumkankersubgroepen, niet-recidiverend versus recidiverend, bij twee patiënten op verschillende CpG-sites in het promotor CpG-eiland van het geïdentificeerde doelgen SFRP1. Als deze techniek eenmaal onder de knie is, kan deze in vier tot vijf dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eerst de kwaliteit van een te testen genomisch DNA te testen. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden zoals pyrosequencing worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals, welke zijn de exacte CpG's in de geïdentificeerde differentieel verrijkte regio's die zijn gewijzigd? Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek het pad gebaand voor onderzoekers op het gebied van