FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels
1 augustus 2016
Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.
Het algemene doel van deze experimentele methode is om realtime studie van intracellulaire signalering mogelijk te maken door middel van FRET-beeldvorming van cellen ingebed in driedimensionale hydrogels die natuurlijk weefsel nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, farmacologie en regeneratieve geneeskunde, zoals de ontwikkeling van optimale biomaterialen en hoogdoorvoerige geneesmiddelenscreening in geconstrueerde 3D-microweefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat FRET kan worden gebruikt op een groot aantal cellen in verschillende hydrogeltypen met behulp van conventionele breedveldmicroscoopsystemen.
Na het fabriceren van mallen voor hydrogelgieten en het ophangen van gekweekte cellen in hydrogeloplossing, volgens het tekstprotocol, in een weefselkweekkap, voegt u de celbevattende voorloper toe aan de gietmallen met behulp van een steriele techniek. Voorafgaand aan het verknopen, centrifugeert u de cellen die zijn opgehangen in hydrogelvoorloper om de beeldvorming te optimaliseren door cellen te beperken tot een enkele brandpuntsvlak en het signaal buiten het vlak te minimaliseren. Vervolgens, om PC-hydrogels te verknoppen, gebruikt u een UVA-lichtbron gedurende een belichtingstijd gelijk aan 3,2 joule per vierkante centimeter per millimeter dikte om de celbevattende voorloper te bestralen.
Alternatief kunt u een goedkopere draagbare tandheelkundige lamp gebruiken. Vermijd overbelichting van de hydrogel, omdat dit de celviabiliteit zal verminderen. Fysiek verknoopte hydrogels worden in plaats daarvan op 37 graden Celsius geplaatst.
Na het verknopen verwijdert u de PDMS-hydrogelgietmal en vervangt deze door de eerder voorbereide PDMS-schaal. Gebruik een steriele spatel om de PDMS naar beneden op het glas te drukken om het te hechten. Voeg fenoolvrij serumvrij medium of een chemisch gedefinieerd medium toe aan de put gecreëerd in de PDMS-schaal met een dekglas om de hydrogel ondergedompeld te houden.
Incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Zodra de PDMS-schaal met de hydrogel is bevestigd op de microscoopstandaard en er olie op het objectief is aangebracht, gebruikt u doorgelaten licht om ten minste 15 cellen voor beeldvorming te vinden en bevestigt u de transfectie met fluorescentiebeeldvorming. Configureer in de microscoopsoftware de camera-instellingen voor de FRET-beeldkanalen door een paar cellen te kiezen in de buurt van het centrum van het gezichtsveld en optimaliseer de belichting en versterking per beeldkanaal volgens het tekstprotocol.
Kies cellen die dicht bij het centrum van de hydrogel liggen, binnen het relatief vlakke verlichtingsveld dat noch te helder noch te donker is, en met een FRET-verhouding tussen 00 en 1,0. Selecteer vervolgens meerdere gezichtsvelden om afbeeldingen te maken voor ten minste 15 getransfecteerde cellen. Schakel het licht uit wanneer u klaar bent om de blootstelling te beperken.
Om de opnamefrequentie voor tijd-lapse-beeldacquisitie te configureren, voert u de periodiciteit van de opnames in. Gebruik een snelle snelheid voor de basislijnsignaalopname, zoals elke vijf seconden per gezichtsveld, en een langzamere snelheid voor de daaropvolgende langetermijnsignaleringskinetiek. Selecteer Nu uitvoeren om de beeldacquisitie te starten en maak afbeeldingen gedurende vijf minuten om een basislijn voor de respons van de sonde op het aangewezen gezichtsveld vast te stellen.
Na de vijf minuten beeldacquisitie, pipet de gewenste agonist of antagonist, meng door te pipetten en ga door met beeldvorming. Na het uitvoeren van FRET-kalibratie volgens het tekstprotocol, selecteert u in de microscoopsoftware de pijl op het achtergrondgebied van belangstelling en kiest u Teken elliptisch achtergrondgebied van belangstelling. Teken en wijs één gebied van belangstelling, of ROI, per gezichtsveld aan in de buurt van de cellen om het achtergrondniveau te definiëren.
Zorg ervoor dat Behoud achtergrondoffset bijwerken is geselecteerd, activeer vervolgens het bekijken van het achtergrondgebied van belangstelling door op het pictogram Achtergrondgebied van belangstelling te klikken. Kies alternatief het pictogram Gebied van belangstelling en stel de eigenschappen van het gebied van belangstelling in als Gebruik als achtergrondgebied van belangstelling en Gebieden van belangstelling zijn anders in elke Multi Point. Gebruik het achtergrondpictogram van het gebied van belangstelling en selecteer Achtergrond aftrekken met behulp van het gebied van belangstelling.
Selecteer in het pop-upvenster, onder Achtergrondgebied van belangstelling aftrekken, Elke afbeelding en onder Toepassen op, selecteert u Alle frames. Voor elk gezichtsveld, om een gebied van belangstelling rond de cel te definiëren met behulp van het acceptoremissiekanaal en een binair masker, gebruikt u het menu Binair, Definieer drempel en selecteert u Toepassen op huidige frame. Pas vervolgens de onderste drempel aan om de cellen te selecteren.
Gebruik vervolgens de functie Binair sluiten om gaten in het binaire masker op te vullen, indien nodig. Gebruik vervolgens het pictogram Gebied van belangstelling om Binair naar gebied van belangstelling te kopiëren te selecteren om het binaire masker op te slaan als gebieden van belangstelling. Voeg de gebieden van belangstelling voor volgende gezichtsvelden toe aan de bestaande pool van gebieden van belangstelling.
Verwijder eventuele onjuiste gebieden van belangstelling. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de gebieden van belangstelling en controleer of hun eigenschappen Gebruik als standaard gebied van belangstelling zijn en dat de gebieden van belangstelling in elk Multi Point anders zijn. Celgebieden van belangstelling kunnen met de hand worden getekend, maar u moet ervoor zorgen dat onjuiste waarden worden verwijderd.
Het protocol bevat procedures voor cellen die zich buiten het vlakke verlichtingsveld bevinden en voor microscopen die geen vlak veld hebben. Centrifugatie van de hydrogelvoorlopers vóór gelatie maximaliseerde het aantal cellen op één brandpuntsvlak nabij het dekglas. Dit minimaliseerde achtergrondruis en verhoogde de beeldacquisitiesnelheid.
In dit FRET-experiment waren voor de berekening van de FRET-verhoud
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) beeldvorming van cellen in driedimensionale hydrogel micro-omgevingen. De techniek maakt real-time studies van intracellulair signaalverkeer mogelijk en kan worden toegepast met behulp van conventionele epifluorescentiemicroscopie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- FRET beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Driedimensionale hydrogels kunnen natuurlijke weefselomgevingen nabootsen.
- De methode maakt hoogdoorvoeranalyse van meerdere cellen mogelijk.
- Conventionele microscopietechnieken kunnen voor deze benadering worden gebruikt.
Doel van het onderzoek
- Om real-time observatie van intracellulair signaalverkeer mogelijk te maken.
- Om de ontwikkeling van biomaterialen voor regeneratieve geneeskunde te faciliteren.
- Om geneesmiddelenscreeningsprocessen in geconstrueerde microweefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van mallen voor hydrogelgietvorming.
- Suspensie van gekweekte cellen in hydrogeloplossing.
- Vernetting van hydrogels met behulp van UVA-licht of tandheelkundige lampen.
- Configuratie van microscoopinstellingen voor FRET beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van cellen ingebed in hydrogels.
- Optimalisatie van beeldvormingscondities om achtergrondruis te minimaliseren.
- Establering van basislijnsignalen voor FRET-analyse.
- Effectief gebruik van gebieden van interesse voor achtergrondcorrectie.
Conclusies
- De methode verbetert het vermogen om celsignalering in 3D-omgevingen te bestuderen.
- Het biedt een raamwerk voor toekomstig onderzoek in verschillende biologische veld.
- FRET beeldvorming in hydrogels kan leiden tot vooruitgang in geneesmiddelontdekking.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
FRET imaging in three-dimensional hydrogels enables real-time quantification of intracellular signaling within physiologically relevant microenvironments, directly addressing the limitations of traditional 2D assays. This capability enhances predictive confidence in early discovery and supports mechanistic de-risking for drug screening and biomaterial development. The method's compatibility with standard widefield microscopy and high-throughput workflows positions it as a scalable asset for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of intracellular signaling pathways in 3D, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling tissue-like environments for hypothesis testing.
- Improves predictive confidence by capturing context-dependent cellular responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Supports assay standardization and reproducibility through ratiometric FRET quantification.
- Enables high-throughput imaging and analysis of multiple cells across hydrogel types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro signaling measurements with disease-relevant 3D microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by modeling tissue-specific responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing material-dependent signaling differences.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging the gap between in vitro assays and physiologically relevant models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D cellular contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in engineered microtissues.
- Analytics: Provides ratiometric FRET measurements and background-corrected outputs for robust data comparison.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo-like tissue responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various hydrogel systems and compatible with multiple microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by modeling relevant biology early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FRET probe design and quantitative imaging analysis.
- Needs access to widefield epifluorescence microscopy and compatible hydrogel fabrication tools.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data processing workflows.
- Adaptable across different hydrogel chemistries and cell types with protocol optimization.
- Throughput and imaging depth may be limited by hydrogel opacity and microscope configuration.
