FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Het algemene doel van deze experimentele methode is om realtime bestudering van intracellulaire signalering mogelijk te maken met behulp van FRET-imaging van cellen die zijn ingebed in driedimensionale hydrogels die natuurlijke weefsels nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, farmacologie en regeneratieve geneeskunde, zoals de ontwikkeling van optimale biomaterialen en high-throughput drug screening in engineered 3D-microweefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat FRET kan worden toegepast op een groot aantal cellen in diverse soorten hydrogels met behulp van conventionele wide-field microscopiesystemen.

Nadat de mallen voor het gieten van de hydrogel zijn vervaardigd en de gekweekte cellen in de hydrogeloplossing zijn gesuspendeerd, volgens het tekstprotocol, voegt u in een weefselkweekkast met steriele techniek de celbevattende precursor toe aan de gietmallen. Centrifugeer vóór het crosslinken de cellen die in de hydrogelprecursor zijn gesuspendeerd om de beeldvorming te optimaliseren door de cellen tot één enkel brandvlak te beperken en het signaal buiten het vlak te minimaliseren. Gebruik vervolgens, om PC-hydrogels te crosslinken, een UVA-lichtbron met een belichtingstijd gelijk aan 3,2 joules per centimeter vierkant per millimeter dikte om de celbevattende precursor te bestralen.

Gebruik eventueel een goedkopere handlamp voor tandheelkunde. Vermijd overbelichting van de hydrogel, omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen zal verminderen. Fysisch gecrosslinkte hydrogels worden in plaats daarvan geplaatst bij 37 °C.

Verwijder na crosslinking de mal voor het gieten van de PDMS-hydrogel en vervang deze door de eerder voorbereide PDMS-schaal. Gebruik een steriele spatel om de PDMS op het glas te drukken zodat deze hecht. Voeg fenolvrij serumvrij medium of een chemisch gedefinieerd medium toe aan de put in de PDMS-schaal en plaats een dekglas om de hydrogel ondergedompeld te houden.

Incubeer de schaal bij 37 °C gedurende 30 minuten. Zodra de PDMS-schaal met de hydrogel op de microscooptafel is bevestigd en er olie op het objectief is aangebracht, gebruik dan doorgelaten licht om ten minste 15 cellen voor beeldvorming te lokaliseren en verifieer de transfectie met fluorescentiebeeldvorming. Configureer in de microscoopsoftware de camera-instellingen voor de FRET-beeldkanalen door enkele cellen nabij het centrum van het gezichtsveld te selecteren, en optimaliseer de belichtingstijd en gain per beeldkanaal volgens het tekstprotocol.

Kies cellen die zich dicht bij het centrum van de hydrogel bevinden, binnen het relatief vlakke verlichtingsveld, die noch te helder noch te zwak zijn, en met een FRET-ratio tussen 00 en 1,0. Selecteer vervolgens meerdere gezichtsvelden om beelden te verkrijgen van ten minste 15 getransfecteerde cellen. Schakel het licht na afloop uit om de blootstelling te beperken.

Voer de periodiciteit van de opnames in om de acquisitiesnelheid voor time-lapse beeldvorming te configureren. Gebruik een hoge snelheid voor de acquisitie van het basissignaal, bijvoorbeeld elke vijf seconden per gezichtsveld, en een lagere snelheid voor de daaropvolgende langetermijnkinetiek van de signalering. Selecteer Run now om de beeldacquisitie te starten en leg gedurende vijf minuten beelden vast om een baseline vast te stellen voor de respons van de probe in het aangewezen gezichtsveld.

Na de vijf minuten van beeldacquisitie, pipetteert u de gewenste agonist of antagonist in, mengt u dit door te pipetteren en gaat u verder met de beeldvorming. Nadat de FRET-kalibratie volgens het tekstprotocol is uitgevoerd, selecteert u in de microscoopsoftware het pijltje op het pictogram voor de achtergrond-region of interest en kiest u Teken Elliptische Achtergrond-Region of Interest. Teken en wijs per gezichtsveld één region of interest, of ROI, aan in de buurt van de cellen om het achtergrondniveau te definiëren.

Zorg ervoor dat Keep Updating Background Offset is geselecteerd en activeer vervolgens de weergave van het achtergrondgeïnteresseerde gebied door op het pictogram Background Region of Interest te klikken. Kies alternatief het pictogram voor het geïnteresseerde gebied en stel de eigenschappen van het geïnteresseerde gebied in op Use as Background Region of Interest en Regions of interest are different in each Multi Point. Selecteer vervolgens Subtract Background Using Region of Interest met behulp van het pictogram voor de achtergrond van het geïnteresseerde gebied.

Selecteer in het pop-upvenster onder Subtract Background Region of Interest de optie Every Image en selecteer onder Apply To de optie All Frames. Om voor elk gezichtsveld een region of interest rond de cel te definiëren met behulp van het acceptor-emissiekanaal en een binair masker, gebruikt u het menu Binary, Define Threshold, en selecteert u Apply To Current Frame. Pas vervolgens de onderste drempelwaarde aan om de cellen te selecteren.

Gebruik vervolgens, indien nodig, de functie Binary Close om gaten in het binaire masker op te vullen. Gebruik daarna het Region of Interest-pictogram om Copy Binary to Region of Interest te selecteren, zodat het binaire masker als regio's van belang kan worden opgeslagen. Voeg de regio's van belang voor volgende gezichtsvelden toe aan de bestaande pool van regio's van belang.

Verwijder alle onjuiste regio's van interesse. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de regio's van interesse en controleer of de eigenschappen zijn ingesteld op Use as Standard Region of Interest en dat Regions of Interest are different in each Multi Point. De regio's van interesse voor cellen kunnen handmatig worden getekend, maar er moet zorgvuldig worden toegezien dat onjuiste waarden worden verwijderd.

Het protocol bevat procedures voor cellen die zich buiten het vlakke verlichtingsveld bevinden en voor microscopen die geen vlak veld hebben. Centrifugatie van de hydrogel-precursoren vóór gelering maximaliseerde het aantal cellen in één brandvlak nabij het dekglas. Dit minimaliseerde de achtergrondruis en verhoogde de doorvoer van de beeldvorming.

In dit FRET-experiment, voor de berekening van de FRET-ratio van de gedoofde emissie (QE), waren voor de enkelstrengse binaire ICUE1-probe slechts twee beelden vereist: QE gelijk aan CFP CFP voor excitatie en emissie, en acceptor-emissie gelijk aan YFP YFP voor excitatie en emissie. Er werden meerdere gezichtsvelden geselecteerd waarin verschillende cellen zich binnen het gebied van homogene verlichting bevonden, zoals hier getoond. ROI's voor achtergrondcorrectie van kanaalsignalen en voor celanalyse werden aangewezen met behulp van drempelwaarde-gecorrigeerde beelden van de acceptor-emissie aan het begin van de experimenten.

Daarnaast, zoals hier getoond, werden cellen geselecteerd die voldoende probestroom vertoonden. De QE- en gesensitiseerde emissie-FRET-ratio's per pixel en de gemiddelde FRET-ratio per cel werden berekend. De inverse van de SE-ratio werd berekend en beide ratio's werden genormaliseerd.

Onder stimulatie met forskoline detecteren zowel de op QE als op SE gebaseerde FRET-ratio's de verhoogde cyclisch AMP-activiteit in chondrocyten. Zowel fysiek gecrosslinkte als chemisch gecrosslinkte gels vertoonden een toename van de QE FRET-ratio in de loop van de tijd, wat wijst op een verhoogde cyclisch AMP-signaleringsrespons na toevoeging van forskoline. Deze procedure kan worden gebruikt met andere microscopietechnieken, zoals FRAP, FLIM-FRET en FRET- en anisotropiemetingen, om vragen te beantwoorden zoals wat de verschillen zijn in permeabiliteit en cellulaire signalering tussen verschillende typen microweefsels.

Aangezien de crosslinking nabij het PDMS wordt onderdrukt, is het belangrijk om te onthouden de mallen voor de foto-crosslinked hydrogelen iets groter in diameter te ontwerpen dan de hydrogelen zelf.