Name: FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer FRET-beeldvorming in driedimensionale hydrogels voor de studie van intracellulaire signalering in cellen. Deze methode maakt real-time analyse mogelijk met conventionele microscopie voor onderzoek naar weefselbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen de financiële steun van de School of Dental Medicine aan de Universiteit van Pittsburgh, de National Institutes of Health award K01 AR062598 en subsidie ​​P30 DE030740. De auteurs danken ook Dr. Jin Zhang voor de ICUE1 plasmide, Wayne Rasband voor het ontwikkelen van ImageJ en Michael Cammer voor de ImageJ macro.

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dit werk toont aan hoe FRET beeldvorming kan worden gebruikt om cellulaire signalering analyseren in 3D hydrogels. Hoewel eerdere studies FRET beeldvorming van cellen gezaaid op hydrogel substraten 35-37 van extracellulaire interactie met hydrogels 38 aangetoond, en moleculen opgesloten in hydrogels 39-41, dit is de eerste publicatie FRET gebaseerde beeldvorming intracellulaire analyse van cellen ingebed in beschrijven 3D-hydrogels. Het werk lost verschillende problemen implementatie bij het vertalen van FRET beeldvorming van 2D naar 3D. Eerst worden hoge apertuur doelstellingen numerieke nodig FRET beeldvorming voldoende emissiesignaal verzamelen, maar ze beperken de scherptediepte. De cellen hier mag enigszins regelen via centrifugeren om het aantal cellen in een brandvlak verhogen het venstertje te compenseren. Ten tweede kan 3D-hydrogel steigers drift over het gezichtsveld tijdens de beeldvorming die de analyse bemoeilijkt. De hydrogels hier zijn gebonden aan de coverslip zodat ze vast blijven gedurende het experiment. Ten derde, selectie van geschikte hydrogel samenstellingen voor 3D FRET is essentieel omdat hydrogels visualisatie van de cellen hinderen. Hier transparante hydrogels PC-gel en TR-gel worden gebruikt. Echter, het verzamelen van de cellen met centrifugeren om een brandvlak bij de dekglaasje kan worden gebruikt om beeld cellen in hydrogels met hogere diffraction.The keuze hydrogel afhankelijk van de micro voorwaarden waaraan moet worden gesimuleerd, die kan worden gevonden in een op 42 hydrogelen . Ten vierde wordt een alternatieve methode hier gebruikt voor het FRET verhouding van de enkele keten ICUE1 probe (dwz E QE = QE / CAEM) het aantal kanalen beeld voor de analyse te minimaliseren en daardoor minimaliseren fotobleken. De gemiddelde FRET verhouding per cel wordt berekend als het gemiddelde van de verhoudingsgetallen per pixel in een cel tot een onderschatting van de werkelijke verhouding FRET minimaliseren. Tenslotte lineaire ratiometrische analyse en middelenhet geactiveerde deel van enkelketenige binaire probes berekend, wordt beschreven. Er zijn verschillende kritische aspecten van het uitvoeren van succesvolle FRET experimenten met groothoek microscopie. Met betrekking tot hardware, moet de camera gevoelig genoeg voor kleine signaal veranderingen lossen, waardoor nieuwere wetenschappelijke CMOS camera en elektronenmicroscopie vermenigvuldigen CCD beter dan conventionele CCD&#39;s. Om zo goed analyseren van de ruimtelijke verdeling van de FRET verhouding, moet de camera beschikken minimaal twee keer de ruimtelijke resolutie van de puntspreidingsfunctie van de doelstelling (Nyquist criterium). Dit maakt dual-view systemen minder geschikt voor de taak. Belangrijker is om een ​​juiste belichting en beeldacquisitie tarief voor de gegeven FRET paar selecteren om fotobleken van de fluoroforen te minimaliseren. Een verlaagde opnamesnelheid wordt aanbevolen als duur experiment toeneemt. Het gebruik van snelle filter wielen verhoogt de verwerving en het aantal van de EPB voor analyse, terwijl vermijdening de beeldregistratie problemen met dual-view en torentje filter blokjes. De homogene verlichting gebied bemoeilijkt correctie voor achtergrond fluorescentie die voortvloeit uit het monster autofluorescentie en camera-systeem lawaai. Sommige hydrogels, met name die welke collagene eiwitten zijn zeer autofluorescente 43,44. De FRET-ratio&#39;s worden onderschat zonder achtergrond correctie. Hier gebruiken we een eenvoudige achtergrondcorrectie die gebruikmaakt van de relatief vlakke belichtingsveld die vaak worden geconfigureerd met epi-fluorescentie verlichting over het midden van het beeld (figuur 3B, stap 7,2). Deze methode beperkt daarom cellen van belang voor degenen onder deze verlichting veld. De achtergrondcorrectie hier beschreven houdt geen rekening met cellulaire autofluorescentie in de golflengten lezen de binaire probe. In dat geval moet ongelabelde cellen (geen probe transfectie) worden afgebeeld onder dezelfde omstandigheden en de achtergrond afgetrokken. A mix van gelabelde en ongelabelde cellen kunnen worden gebruikt en ongelabelde cellen geselecteerd voor de achtergrond ROI. Alternatieve methoden die voorzien in de cel analyse over het gehele beeldveld onder andere gebruik van schaduw masker, meerdere achtergrond ROI, of identieke monsters zonder cellen en een protocol is op aanvraag beschikbaar. Specifiek voor 3D beeldvorming FRET probe reactie is zeer gevoelig voor de hydrogel permeabiliteit voor de analyt (figuur 6). Derhalve dezelfde hydrogel gebieden worden vergeleken in experimentele behandelingen, bij voorkeur bij een bijzondere geometrische symmetrie zoals bij een steiger centrum zoals hier gebruikt. Alternatief microfluïdische kamers / bioreactoren kan worden gebruikt om snel en uniform perfuseren de hydrogel met analytoplossing 45. Een FRET signaal kan niet worden gedetecteerd (signaal-ruisverhouding is te laag) als autofluorescentie de hydrogel is te hoog; een dunnere hydrogel of andere probe (verschillende fluoroforen) worden gebruikt.Wat FRET 3D beeldvorming in fotoverknoopte hydrogels, wordt het gebruik van minimale straling blootstelling en golflengtes buiten de excitatie spectra van de probe fluoroforen aanbevolen. LAP kan worden gebruikt met een zichtbare lichtbron bij 405 nm potentiële celschade 31,46 verder te minimaliseren. Gebruikt evenwel LAP met 365 nm straling aanbevolen omdat dit minimaliseert probe bleken. 365 nm ligt aan het uiteinde van het GVB donor excitatie spectrum, terwijl 405 nm ligt op het hoogtepunt excitatie. Als alternatief kan de probe expressie worden toegestaan ​​voor de ene dag. Gebruik van binaire probes minimaliseert problemen van gevoeligheid voor verschillen in expressieniveaus en moleculaire diffusie van donor en acceptor fluoroforen. Niet-binaire probes worden gebruikt, maar in plaats van SE QE beeldvorming en aanvullende correctie voor spectrale doorbloeding van excitatie- en emissie-spectra (zie hieronder). Voorts is de lage commerciële beschikbaarheid en de complexiteit van het ontwerp FRET probeskan een belemmering. De belangrijkste factor voor een succesvolle experimenten blijft goede correctie en analyse van de fluorescentiesignalen. Een alternatieve methode van het FRET-ratio wordt gebruikt om verschillende andere redenen naast minimalisering van fotobleken. Voor binaire enkele keten sondes, de gemelde verhouding acceptor emissie onder donor excitatie (gesensibiliseerd emissie, SE) om donor emissie onder donor excitatie (geblust emissie, QE), dat wil zeggen, FRET-ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE niet-lineair ten opzichte van veranderingen in FRET efficiëntie 21,22,47. Namelijk het quotiënt een exponentieel niet-lineaire relatie inherente FRET efficiëntie van de sonde (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM gepubliceerd werk. (2015)), waarbij de verhouding meest lineaire voor Ei minder dan ongeveer 15%. SE / QE zal ook onderschatten de fractie van actieve sondes (FAP, dwz fractie van probes binden analyt). Therefore, analyse van SE / QE vereist een omslachtige evenwicht dosis-respons studie en curve fit. Gelukkig is de verhoudingen van SE of QE aan de acceptor emissie onder acceptor excitatie (AEM) zijn lineair met betrekking tot Ei en de FAP, dat wil zeggen, de FRET verhoudingen SE / AEM en QE / Aem. SE / AEM wordt vaak gebruikt voor binaire sondes en vereist alleen end-punts kalibratie (zonder sonde activiteit en volledige sonde activiteit), maar basale cellulaire signalering maakt dit moeilijk. De noodzaak eindpunt kalibratie elimineren, kan SE corrigeren (CSE) voor de spectrale overlap van de donor en acceptor excitatie en emissie spectra (spectrale doorbloeding) en de kwantumopbrengst en spectrale gevoeligheid (QS) van de gecombineerde probe fluoroforen en microscoop afbeeldingssysteem. De gecorrigeerde SE FRET laatste percentage CSE definieert de waargenomen FRET efficiëntie van de probes in elke pixel van een beeld, dat wil zeggen, E SE = cse / Aem. Commerciële en vrije software is beschikbaar om te corrigeren SE voor deze effecten ende lezer wordt verwezen naar het werk van Chen en Periasamy 2006 voor een gedetailleerde uitleg van de methoden 50. Echter, het berekenen van E SE vereist gevangenneming van drie image kanalen per time-point (SE, QE AEM). Daarom is in dit werk hebben we ook gebruik van een alternatieve FRET-ratio E QE = 1 - QE / Caem, die vangst van slechts twee beeld kanalen (QE en AEM) vereist. Het berekenen van E QE van deze kanalen vereist slechts corrigeren Aem voor QS (Caem = Aem x QS). QS = Dem / AEM is gemakkelijk geschat met behulp van twee beelden van de ene kalibratie monster, waarbij Dem is de donor emissie onder donor excitatie met acceptor gebleekt. FAP op elk moment kan worden berekend door E SE of E QE het Ei van de probe. Uiteindelijk moet FRET-ratio selectie (E SE = CSE / AEM vs. E QE = QE / Caem) gebaseerd zijn op de bestudering van het type sonde en de kanalen met de beste signaal. zowel eenpproaches bevatten achtergrondgeluiden correctie van beelden per frame zoals hierboven beschreven om rekening te houden voor veranderingen in de autofluorescentie in de tijd. Ze nemen geen overlap van AEM excitatie licht in de Dem excitatie spectrum, wat vaak het geval is te wijten aan het ontwerp en de microscoop filter configuratie sonde. Enkele keten sondes kunnen gebruik maken en de selectie is gebaseerd op de probe-signaal (helderheid) om de camera ruis en op de achtergrond signaal op SE en QE kanalen. Voor de ICUE1 sonde en de hier gebruikte experimentele omstandigheden (cel en hydrogel types), SE heeft een sterker signaal dan QE. Dubbele ketting probes vereisen gebruik van E SE door niet-equimolaire verdeling van donor en acceptor fluoroforen. Voor probes die daling in FRET bij binding te analyseren zoals ICUE1, FRET-efficiëntie kan worden &quot;geïnverteerd&quot; naar een positief signaal verandering bij binding van de analyt te presenteren als wij hier doen, met E SE = 1 - CSE / AEM of E QE = QE / (AEM x QS). Analyse van the FAP is gevoelig voor de juiste correctie van het FRET-ratio&#39;s en de raming van Ei. Het kan worden geschat met dezelfde kalibratie monster gebruikt voor QS en een conventionele eindpunt FRET efficiency test zoals Ei = 1- (QE / Dem) (QE image gevolgd door acceptor fotobleken en Dem afbeelding) 28, maar zorg moet worden genomen om zoveel mogelijk te beperken toevallige bleken van de donor. We beschrijven een aangepaste versie waarin de schatting van Dem op basis van AEM gecorrigeerd voor QS wordt vervangen, dat wil zeggen, Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternatief kan Ei = CSE / AEM gebruikt. Schatting van Ei in levende cellen vereist dat alle sondes worden gereden om de volledige FRET. Dit is moeilijk te bereiken in de praktijk probes zoals ICUE1 die afnamen in FRET bij binding van de analyt. Een in vitro berekend op basis van het gebruik Ei cellysaten gezuiverd analyt beste, maar buiten het bereik van dit werk. Hier raden we aan 2 &#39;, 5&#39;-dideoxyadenosine aan cAMP in de cellen te verminderen. Echter, zou een relatieve FAP be berekend aan de hand van een Ei schatting afgeleid van het basisniveau van de signalering. Daarom onderzoeken geven meestal het FRET verhouding (vanaf hier gedaan) of een relatieve FAP gebaseerd op eindpunt kalibratie, waarbij de signalering basislijn voor het toevoegen agonist de ondergrens en het signaal na toevoeging van een tweede agonist die signalering verzadigd wordt het bovenste gebonden. Forskoline wordt vaak gebruikt als controle agonist cAMP signaal verzadigen. Alternatief kan een cAMP analoog worden gebruikt, zoals 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-cyclisch monofosfaat. Positieve controles gebruikt bij voltooiing van studies om mogelijke veranderingen in de signaalweg tussen experimentele behandelingen identificeren worden aanbevolen. Berekening van de gemiddelde signalering reactie per cel moet rekening worden gehouden met verschillende factoren. Eerst wordt het gemiddelde FRET verhouding worden berekend als het gemiddelde van de verhoudingen van elke pixel in een cel, dat wil zeggen, (Σ (QE/cAem)) / (aantal pixels), in plaats van de ratio van de gemiddelde QE en AEM in een cel, dat wil zeggen (ΣQE) / (ΣcAem). Hoewel de laatste voorzichtig maskeren niet nodig als achtergrond ruis laag is, ernstig onderschat de werkelijke gemiddelde FRET-ratio. Echter, pixel verhoudingen vereisen floating-point berekeningen en zorgvuldige binaire maskeren van de cel gebied om de ROI te bepalen en de opname van valse verhoudingen gegenereerd op basis van achtergrondruis buiten de cel te voorkomen. De gehele cel gebied moet worden gekwantificeerd om vertekenende resultaten op mobiele vorm te vermijden. Het maskeren moet mogelijk opnieuw worden gedefinieerd in de tijd, afhankelijk van veranderingen in cel vorm en migratie. Als alternatief kan ROI&#39;s groter zijn dan de cel gebruikt worden als uitsluitingscriteria worden gedefinieerd om pixel verhoudingen van QE en AEM signalen die vallen ver onder de cellulaire niveaus en zijn in de buurt van het achtergrondniveau verwijderen. De beschreven analysemethoden detail de basisstappen die in dit werk voor FRET analyse zonder gespecialiseerde software / plugins. Microscoop fabrikanten en andere leveranciers verkopen add-on modulevanwege hun microscoop software, die automatisch ratiometrische ondersteunen en FRET-analyse. Ook het publieke domein ImageJ software heeft diverse plugins beschikbaar voor deeltje en FRET analyse, zoals RiFRET. Ten tweede, de op pixels gebaseerde FRET gemiddelde verhouding onderschat de werkelijke gemiddelde verhouding van de 3D celstructuur omdat een 2D-beeld wordt gebruikt. Het 2D signalen representeren en gemiddeld langs de z-as. Berekening van de 3D ​​ruimtelijke verdeling van FRET verhoudingen in levende cellen kan niet zonder snelle 3D beeldvorming (bv., Middels draaiende schijf confocale microscopie). Dit is een probleem voor zowel 2D- als 3D culturen, maar heeft een groter effect in 3D als meer van de celstructuur bestaat uit het vlak. Dit is van groot belang voor probes die lokaliseren naar cellulaire structuren, zoals de plasmamembraan Epac1 probe PM-ICUE. Zie Spiering et al. 2013 om suggesties te corrigeren voor celdikte effecten op de verhouding tussen berekeningen 24. Analyse van de verdeling van Aem kan worden gebruiktdetecteren of probe accumuleert in gebieden van de cel en beeldvlak gecorrigeerd. Dit zal ook helpen om de ruimtelijke verdeling van FRET verhoudingen interpreteren en valse resultaten te elimineren, bijv., Het identificeren van sonde verzadiging (dat wil zeggen, zal een lage streek Aem lage concentratie sonde te gebruiken en kunnen sonde verzadiging en hoge FRET-ratio vertonen). Ten derde, verschillende FRET uitgangswaarden kan een verschil in transfectie-efficiëntie te geven, sonde uitdrukking of basale signalering tussen experimentele groepen. &quot;Relatief Analysis&quot; (Stap 10.1.1) helpt bij het verwijderen drift in de FRET-ratio in de tijd, indien aanwezig. Het vergemakkelijkt de vergelijking van de relatieve grootte van de reacties tussen de monsters, maar belemmert vergelijking met het tijdsverloop van de respons van het referentiemonster (controle plot is een vlakke lijn). &quot;Absolute Analysis&quot; (Stap 10.1.2) vergemakkelijkt de vergelijking van de snelheid van de respons over monsters, maar belemmert de vergelijking van de omvang van het antwoord, want elke regel wordt geschaald door een dissimilar constant. Studies gebruiken vaak een lineaire regressie op de basislijn te corrigeren voor drift in de FRET verhouding in de tijd. De beschreven werkwijze 3D FRET is een nuttige en praktische wijze te vervaardigen en uitvoeren van time-lapse beeldvorming van cellen beladen 3D hydrogels, die kunnen worden toegepast op andere sondes en beeldvormingsmodaliteiten. Andere FRET systeem naast enkelketenige binaire probes complexere correctie intensiteit gebaseerde signalen vereist, zoals hierboven besproken. Als alternatief kan de fluorescentie levensduur imaging van FRET (FLIM-FRET) worden gebruikt om de FRET-efficiëntie te berekenen via een verandering in de emissie levensduur van de sonde donor. In tegenstelling tot de intensiteit gebaseerde FRET, FLIM-FRET is ongevoelig voor ruis, spectrale bloeden-through, quantum efficiency, en de detector spectrale gevoeligheid 2. Echter, FLIM systemen zijn duur, ingewikkeld en ongewoon, en het beste werken met fluoroforen met enkele exponent verval en geen FLIM run-off 49. De beschreven werkwijze kan ook worden gebruikt met more geavanceerde microscoop platforms (bijv., FRET-TIRF, fluorescentie anisotropie, en spectrale correlatie FRET). Het toepassen van deze methode om 3D-beeldvorming met hoge snelheid confocale microscopie en multi zal een analyse van de sub-cellulaire distributie van signalering reactie te vergemakkelijken en verhoging van de nauwkeurigheid van de signalering analyse. Deze 3D FRET methode in staat zal stellen geavanceerde celbiologie studies in gesimuleerde 3D-cellulaire micro-omgevingen. Als zodanig kan deze gemakkelijk worden toegepast op farmacologie en regeneratieve geneeskunde behoeften, zoals bestuderen intercellulaire signalering en screening geneesmiddelenrespons in gemanipuleerde hydrogel gebaseerde microweefsels.

Cellulaire signalering is complex en gevolgschade voor tal van gebieden, met inbegrip van farmacologie, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Handige onderzoek gereedschap nodig om ons begrip van celbiologie bevorderen en om een ​​optimale materialen voor weefselregeneratie te ontwikkelen. Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een essentieel instrument om de analyse van receptor activering, moleculaire conformatie, en supramoleculaire interacties (bijv., Eiwit / DNA complexatie) in levende cellen. FRET is een type niet-radiatieve energieoverdracht tussen fluoroforen 1. Het heeft een efficiëntie die omgekeerd evenredig met de zesde macht van de afstand tussen een donor fluorofoor en acceptor fluorofoor. Zo kan informatie over de ruimtelijke afstand tussen twee verschillende moleculen of tussen gebieden van één molecuul op nanometerschaal (typisch 1-10 nm) 2. De donor en acceptor fluoroforen kunnen verschillend zijn molecule types (hetero-FRET), waarbij de donor de hogere energie-emissie (kortere golflengte) of van hetzelfde type (homo- FRET). FRET beeldvorming kan worden uitgevoerd op vaste of levende cellen, maar in het algemeen gefixeerde cellen worden gebruikt voor beeldvorming van moleculaire wisselwerkingen bij hoge ruimtelijke resolutie bij hoge snelheid confocale systemen niet beschikbaar. Levende cellen worden gebruikt om interacties en processen die worden geremd of gewijzigd door fixatie, zoals real-time intracellulaire signalering reactie 3 bestuderen. Levende cellen studies die in dienst FRET beeldvorming gebruik tweedimensionale (2D) cellulaire culturen omdat in een deel van de eenvoud en lagere achtergrond (geen uitstoot van uit het vlak cellen). Echter, 2D culturen ook talrijke cellulaire processen te veranderen in vergelijking met de fysiologische micro en driedimensionale (3D) cultuur 4,5. Zo zijn natieve cel tot cel en cel-extracellulaire matrix interacties drastisch veranderd in 2D kweek leidt tot de easily waargenomen veranderingen in celmorfologie en polariteit 6. Membrane microdomeinen (bijv., Caveolae en lipid rafts) en de receptor signalering zijn sterk gereguleerd door de cultuur milieu, voor een deel omdat ze zich binden cytoskelet componenten 7,8 en de structuur mobiele vorm en cytoskelet zijn sterk gereguleerd door de ruimtelijke cultuur milieu 9. Mechanotransductie wordt niet alleen beïnvloed door de 3D-matrix, maar de meer complexe secundaire belastingsomstandigheden veroorzaakt in 3D-omgevingen in vergelijking met 2D culturen 10. Tenslotte de permeabiliteit van 3D matrices is dan het kweekmedium, in het algemeen met een verminderde diffusie en verhoogde binding van cel signaalmoleculen vergelijking met 2D culturen. Met 3D culturen men kunnen maken en zich aan een micro meer vergelijkbaar met de fysiologische opzichte van lijm, chemische en mechanische signalen. Wisselwerking tussen cellen kan worden bevorderd en de hechting kan worden geregeld wet de structuur, samenstelling en architectuur (patroon) van het 3D-materiaal 11-13. De mechanische eigenschappen van het materiaal kan ook worden aangepast door de samenstelling en structuur 14,15. Het kweken van cellen in hydrogels derhalve vergunningen FRET studies op primaire cellen die anders de-differentiëren of verandering in fenotype met gebruikelijke technieken, bijv., Cellen van gewrichtskraakbeen. Derhalve is een werkwijze nodig om FRET assays 3D levende culturen schakelen. Hydrogel scaffolds zijn ideaal voor 3D FRET gebaseerde studies omdat ze optisch transparant kunnen worden gemaakt en afgestemd op de micro controle en cellulaire signalen verschaffen. Hydrogelen gemaakt van natuurlijke polymeren zijn gebruikt in celcultuur decennia, gelatine en fibrine 16. Meer controle over de cellulaire micro-omgeving kan worden bereikt met chemische modificatie van deze polymeren en het gebruik van synthetische polymeren 17,18. hydrOGEL mechanische stijfheid en doorlaatbaarheid kan worden geregeld door het veranderen van de polymere samenstelling en maaswijdte (polymeer en verknopingsdichtheid) 19,20. Verder kan hydrogels bioactief worden via de incorporatie van groeifactoren en cellulaire liganden. Door deze mogelijkheden, de ontwikkeling van hydrogels voor biosensoren, geneesmiddelafgifte en weefselmanipulatie toepassingen is een actief gebied van onderzoek 21. 3D printen van hydrogels is ook in ontwikkeling voor de productie van micro-weefsels en -organs 15. Aldus FRET beeldvorming van cellen in hydrogels is niet alleen nuttig als middel om fysiologische celgedrag benaderen, maar ook als instrument te gaan wat ontworpen weefselgroei. Binaire ratiometrische FRET probes zijn zeer nuttig bij het bestuderen van cellulaire signalering en kunnen worden gebruikt in hydrogel culturen. Voor een gedeeltelijke lijst van gepubliceerde fluorescente en FRET-probes, zie de Cel Migratie Consortium website <sup&gt; 22. De meest voorkomende soort probe bevat twee verschillende fluoroforen die zijn verbonden of gekoppeld door een herkenningselement (s) (analyt kwetsbaar gebied). Deze gebieden ondergaan een conformationele verandering, associatie of dissociatie bij detectie van de analyt (bijv., Binding van een ion of molecuul, enzymatische splitsing van de regio) dat de afstand tussen de fluoroforen en dus de FRET magnitude (hoger of lager) wijzigt 23. Een minder gebruikelijke maar nuttige probe Type voert een analyt gevoelig verandering in de spectrale overlap van de twee fluoroforen, die FRET grootte verandert. &quot;Single-chain&quot; ratiometrische probes maken gebruik van een fluorofoor paar gekoppeld aan een enkel molecuul. &quot;Dual-chain&quot; sondes gebruiken fluorofoor paren op afzonderlijke moleculen, maar hun expressie kan onder dezelfde expressiecassette 24 worden gekoppeld. Unlike studies met enkele fluorofoor expressie (bv. Fluorescerende fusie-eiwitten), studies met ratiometrischeFRET probes geen dubbele transfectie vereisen controle voor transfectie-efficiëntie en cellevensvatbaarheid. Ratiometrische FRET probes zijn relatief ongevoelig voor transfectie-efficiëntie bij het ​​boven een minimumdrempel (concentratie ongevoelig) 23,25 uitgedrukt. Ze zijn ongevoelig voor fluctuaties excitatiebron en andere intracellulaire omgevingsfactoren (bijv., PH, ionen), zolang beide fluoroforen zijn eveneens ontvankelijk. Bovendien is hun reactie niet onder transcriptionele vertraging tegenstelling fluorescente en bioluminescente promoter-reporter constructen 26,27. Ratiometrische FRET probes zijn gemakkelijk en vaak gebruikt in conventionele groothoek epifluorescentiemicroscoop systemen. Widefield microscopen hebben de voorkeur boven lijn scanning confocale systemen voor live-cell imaging vanwege bezorgdheid over de kosten van het systeem, fluorofoor bleken, en de vangst van het signaal veranderingen met voldoende temporele resolutie. Bovendien eencellige analtion over een grote populatie van cellen is mogelijk met een gemotoriseerde podium en beeld vast te leggen over meerdere gezichtsvelden. Widefield microscopie vereist intensiteit gebaseerde analyse van de hetero-FRET-probe signalen. Hoewel de intensiteit analyse complexe hardware zoals andere FRET methoden niet vereist, wordt meer post-acquisitie werkzaamheden die nodig zijn om te corrigeren voor de effecten van de fluorofoor gedrag en microscoop / imaging systeemconfiguraties 28. De vastgelegde emissie-intensiteit van een fluorofoor is een functie van de excitatie-energie, fluorofoor kwantumopbrengst, en de gecombineerde filter en camera / detector spectrale gevoeligheid en de lineariteit 2. Deze kunnen verschillend voor de donor en acceptor en kalibratie voor kwantitatieve analyse vereisen. Bovendien is beeldvorming van de acceptor emissie onder invloed van de spectrale overlap van de fluoroforen (excitatie van acceptor door donor excitatielicht en doordrukken donor emissie naar de acceptor emissiespectra) 2.4; Single-chain &quot;sondes zijn intern genormaliseerd omdat hun fluoroforen zijn equimolaire op nanoschaal, terwijl de fluoroforen van&quot; dual-chain &quot;sondes kunnen bestaan ​​op verschillende stoechiometrieën gedurende een cel 25,28 Als de fluoroforen van.&quot; Single-chain &quot; probes van dezelfde helderheid (functie extinctiecoëfficiënt en kwantumopbrengst), de effecten van niet-lineaire detector gevoeligheid klein en alleen correctie voor achtergrondfluorescentie en gekoppelde kwantumopbrengst / detectorsensitiviteit nodig 23. Aldus &quot;single-chain&quot; ratiometrische FRET probes zijn het meest eenvoudig te implementeren in groothoek microscopie 24. Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om FRET beeldvorming van levende cellen in 3D hydrogel kweken met een gebruikelijke groothoek epifluorescerende microscoop voeren. Het kan gemakkelijk worden vastgesteld door laboratoria die al het uitvoeren van FRET experimenten in 2D, maar ook laboratoria geïnteresseerd in intercellulaire signalering in microweefsels. Hier laten we de methode FRET beeldvorming gebaseerde meting van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus in levende chondrocyten binnen fotoverknoping (PC-gel, polyethyleenglycol dimethacrylaat) en thermoresponsieve (TR-gel, Matrigel) hydrogels. Een ratiometrische FRET probe wordt gebruikt gebaseerd op Epac1 (ICUE1) cAMP niveaus in reactie op forskoline, een chemische agonist voor adenylaatcyclase die de omzetting van ATP naar cAMP katalyseert detecteren. cAMP is een van de belangrijkste second messengers mediëren G-eiwit-gekoppelde receptor-signalering en activeert verschillende factoren, waaronder stroomafwaartse uitwisseling eiwitten direct cAMP (EPACs) geactiveerd. De fluoroforen elkaar bewegen bij cAMP binding aan de EPAC domein resulteert in een afname van FRET. Hier beschreven is de bereiding van de hydrogel materialen, celtransfectie de ICUE1 probe en inbedding van de cellen in 3D hydrogels. De 3D FRET experiment procedure en de beeldanalyse nodigevalueren probe activiteit per cel toegelicht. We bespreken ook de inherente beperkingen van FRET analyse in 2D en 3D met behulp van groothoek microscopie. De techniek die hier is een verbetering ten opzichte van de bestaande methoden 2D omdat daardoor analyse in een fysiologische omgeving en vereist minder beeldcorrectie en kalibratie. Groot nut ligt in het feit dat vele transparante materialen kunnen worden gebruikt tijdens cel en transfectie voorkeuren kunnen worden gehandhaafd.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td><td>Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Dimethyl Phenylphosphonite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Lithium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Sigmacote (siliconizing reagent)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Tolueen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Cellstripper (cell dissociation solution)</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Pipette Tips (10,200,1,000 &mu;l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Poedervrije onderzoekshandschoenen</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Biopsie punch (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Glas dekvlakjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Voorgecoate glazen dekvlakjes (epoxysilane)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Glasplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Steriele flacons (15 ml, 50 ml kegelvormig)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Celcultuur schaal (6-well)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Epifluorescente Microscoop met gemotoriseerde standaard</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Instelbare specimen houder voor XY Stage</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>60X (1.3 NA) objectief (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>CFP/YFP lichtbron en excitatie/emissie filter houders (Lambda lichtbron &amp; wiel, Lambda emissie filter systeem)</td><td>Nikon (Sutter Instrument reseller)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>CYF/YFP filter set</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu reseller)</td><td>77054076</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Prism (spreadsheet en grafiek software)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Versie 6</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System met 365nm filter of andere lichtbron (&lambda; = 365 of 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Pipette Aid&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.&nbsp;</td><td>DP-100</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Vacuüm desiccator kamer/degasseer&nbsp;</td><td>Elk</td><td></td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Weefsel Cultuur Hood&nbsp;</td><td>Elk</td><td></td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood&nbsp;</td><td>Elk</td><td></td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Elk</td><td></td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Spatelka</td><td>Elk</td><td></td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Beker</td><td>Elk</td><td></td><td>Niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>Elk</td><td></td><td>Groot/niet-disposalbaar laboratoriummateriaal</td></tr></tbody></table>

fret imaging in driedimensionale hydrogels

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Beeldvorming van Förster resonance energy transfer (FRET) is een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van celbiologie in real-time. Onderzoeken waarin FRET gewoonlijk gebruiken tweedimensionale (2D) cultuur, waarin de driedimensionale (3D) cellulaire micromilieu niet nabootsen. Werkwijze voor geblust emissie FRET beeldvorming uitgevoerd met gebruikelijke groothoek epifluorescentie microscopie van cellen in een 3D-omgeving hydrogel wordt gepresenteerd. Hier een analysemethode voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering sonde bereik oplevert wordt beschreven. Meting van intracellulair cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus is aangetoond in chondrocyten onder forskoline stimulatie met een probe voor Epac1 activering (ICUE1) en de mogelijkheid om verschillen in cAMP signalering afhankelijk hydrogel materiaalsoort, hierin een fotoverknoping hydrogel (PC-gel detecteren, polyethyleen glycol dimethacrylaat) en een warmteresponsieve hydrogel (TR-gel). Vergeleken met 2D FRET methoden,Deze methode vereist weinig extra werk. Laboratoria al gebruik te maken van FRET beeldvorming in 2D kan eenvoudig deze methode om cellulaire studies uit te voeren in een 3D-micro-omgeving vast te stellen. Het kan verder worden toegepast op hoge doorvoer screenen van geneesmiddelen in gemanipuleerde 3D microweefsels. Bovendien is compatibel met andere vormen van FRET beeldvorming, zoals anisotropie gemeten en fluorescentie lifetime imaging (FLIM), en met geavanceerde microscopie platforms via confocale, gepulseerde of gemoduleerde belichting.

Alle hydrogel voorlopers, cellen en spuitgieten werden bereid zoals hierboven is beschreven. De cel beladen voorloper oplossingen werden gegoten in PDMS mallen en vervolgens gecentrifugeerd voordat gelering / fotoverknopen om cellen te immobiliseren in de buurt van het dekglaasje en FRET vergemakkelijken imaging-analyse (figuur 1). De hydrogels met aangehechte dekglaasjes werden bereid in PDMS imaging putjes microscopische beeldvorming (Figuur 2) geplaatst. De optische configuraties en beeldopname parameters werden vervolgens zoals getoond in figuur 3A. Vastleggen van alle vier FRET aanverwant kanalen voor CFP-YFP fluorofoor paren wordt aangetoond (zie onder &quot;Optical Conf.&quot; In figuur 3), als nodig is voor niet-binaire probes. Maar in dit werk slechts twee beelden nodig zijn voor de enkele keten binaire ICUE1 probe, QE = &quot;CFP CFP&quot; en AEM = &quot;YFP YFP&quot; (excitatie emissie). Meerdere EPB (xy posities) geselecteerd waarin meerdere cellen verbleven in het homogene verlichtingsgebied (Figuur 3B). Na de time lapse overname, werd het signaal gegevens voor de sonde geëxporteerd. ROI voor achtergrondcorrectie van kanaalsignalen en celanalyse aangewezen behulp thresholded Aem beelden van het begin van de experimenten (figuur 4). Cellen gekozen uit de celpool die welke expressie voldoende (niet te zwak), maar niet te hoog is (te lichte) probe (Figuur 4B). De QE en SE FRET-ratio&#39;s per pixel bij elke overname werden berekend met behulp van floating-point deling van de achtergrond afgetrokken afbeelding kanalen. De gemiddelde FRET-ratio per cel (dat wil zeggen, per ROI) werd berekend, genormaliseerd naar de basislijn signaal voorafgaand aan stimulatie (dwz een regressie op de basislijn afgetrokken van alle tijd-punten), en uitgezet met fout bars als de standaard fout van de gemiddelde (SEM). Zowel de QE en CSE gebaseerde FRET verhoudingen detect de verhoogde cAMP activiteit chondrocyten onder forskoline stimulatie (100 nM, figuur 5). De QE FRET ratio gevoeliger voor achtergrondcorrectie dan de CSE FRET verhouding omdat de QE signaal lager was te wijten aan de lage basale niveau van cAMP activiteit chondrocyten ingebed in de hydrogelen. Beide types hydrogel (TR-gel en PC-gel) werd een verhoogde FRET verhouding in de tijd (Figuur 6), wijst op een verhoogde cAMP signalering reactie op de toevoeging van forskoline. Zoals de QE FRET verhouding chondrocyten in PC-gel hydrogelen vertonen een grotere verandering in cAMP (getoond) en een hogere basale niveau van cAMP (E QE = 0,19 in PC-gel versus E QE = 0,09 in TR-gel, niet getoond in de basislijn afgetrokken figuur). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Figuur 1: Cell Distribution in fotoverknoopte Hydrogel (PC-gel) </strong&gt; A: De cel geladen hydrogel voorloper werd gecentrifugeerd om het aantal cellen te maximaliseren in een brandvlak bij de dekglaasje. B: Dit verhoogt het aantal cellen in het FOV en minimaliseert achtergrondsignaal uit uit het vlak cellen. (Schaal bar = 200 micrometer) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Figuur 2: Hydrogel in PDMS Dish De hydrogel werd geplaatst in een hoog PDMS goed (10x volume hydrogel) met een dekglaasje basis voor microscopische beeldvorming en analyseren stimulatie. De PC-gel hydrogels transparant en gehecht aan het dekglaasje zodat zij gedurende de test op hun plaats blijven. De PDMS goed kan groter worden gemaakt dan 10x medium de hydrogel volume met een grotere punch biopsie naast ten bevattenhicker PDMS vel. (Schaal bar = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Figuur 3: Overname configuratie voor FRET Imaging A: De overname is geconfigureerd voor het vastleggen elke 7 seconden op meerdere locaties. Voor QE FRET-ratio berekening, worden slechts twee beeld kanalen die nodig zijn voor de ICUE1 probe hier gebruikt (binair enkele keten sonde), QE = &quot;GVB GVB&quot; en AEM = &quot;YFP YFP&quot; (excitatie emissie) onder de &quot;Optical Conf.&quot; kolom in de tab λ van de microscoop software. B: EPB ( &quot;XY&quot; stand) geselecteerd waarin meerdere cellen verbleven in het homogene verlichtingsgebied. Het perceel onder de afbeelding toont de lichtintensiteit langs de blauwe pijlen lijndat doorkruist door het centrum van de FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Figuur 4: Selectie van ROI voor FRET Imaging Analyse A: Een gebied van belang (ROI) vrij van cellen werd geselecteerd ter correctie van achtergrondsignaal van elk kanaal. Een afbeelding van een celvrije hydrogel kan in plaats daarvan worden gebruikt voor de achtergrond aftrekking als celdichtheid of migratie hoog is, of indien een schaduw masker niet wordt gebruikt wanneer cellen niet binnen een homogeen belichtingsveld liggen. B: De cel ROI&#39;s werden geselecteerd met behulp van het drempelwaarden en binaire maskeren van de Aem kanaal. Selecteren van een ROI groter dan de cellen nadelig beïnvloeden berekening van de gemiddelde FRET verhouding per cel door opname van extracellulaire verhoudingen gegenereerd uit de achtergrond noise. Berekening van de cellulaire FRET-ratio met behulp van het gemiddelde van elk kanaal per cel wordt niet aanbevolen, omdat dit onderschat de ratio. (Schaal bar = 50 pm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Figuur 5: Vergelijking van FRET Ratio&#39;s in thermoresponsieve Hydrogel (TR-gel) Zowel QE en SE gebaseerde FRET verhoudingen detecteren de toegenomen cAMP activiteit in chondrocyten onder forskoline stimulatie. Forskolin is een adenylcyclase agonist die cAMP-productie induceert. FRET af wanneer de ICUE1 probe bindt cAMP, en daardoor de QE FRET verhouding (E = QE SQE / (SAEM x QS)) toeneemt. Omgekeerd, de SE FRET-ratio daalt en wordt dus uitgezet als E SE = 1 - CSE / Saem. In hydrogel ingesloten chondrocyten, het QE FRET verhouding gevoeliger voor achtergrondcorrectie dan SE FRET verhouding omdat de QE signaal laag door het lage basale cAMP activiteit. Error bars = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Figuur 6: Vergelijking van FRET Ratio in verschillende hydrogels De chondrocyten in beide soorten hydrogel reageerde op forskoline stimulatie met een verhoging van cAMP-activiteit zoals aangetoond door de toegenomen QE FRET verhouding in de tijd. Het type hydrogel effecten de cellulaire respons door verschillende effecten, zoals verschillen in permeabiliteit voor forskoline en basale cellulaire cAMP activiteit (E QE = 0,19 in PC-gel versus E QE = 0,09 in TR-gel, niet getoond). Foutbalken = SEM, n voor TR-gel= 25, n voor PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Het algemene doel van deze experimentele methode is om realtime bestudering van intracellulaire signalering mogelijk te maken met behulp van FRET-imaging van cellen die zijn ingebed in driedimensionale hydrogels die natuurlijke weefsels nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, farmacologie en regeneratieve geneeskunde, zoals de ontwikkeling van optimale biomaterialen en high-throughput drug screening in engineered 3D-microweefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat FRET kan worden toegepast op een groot aantal cellen in diverse soorten hydrogels met behulp van conventionele wide-field microscopiesystemen.Nadat de mallen voor het gieten van de hydrogel zijn vervaardigd en de gekweekte cellen in de hydrogeloplossing zijn gesuspendeerd, volgens het tekstprotocol, voegt u in een weefselkweekkast met steriele techniek de celbevattende precursor toe aan de gietmallen. Centrifugeer vóór het crosslinken de cellen die in de hydrogelprecursor zijn gesuspendeerd om de beeldvorming te optimaliseren door de cellen tot één enkel brandvlak te beperken en het signaal buiten het vlak te minimaliseren. Gebruik vervolgens, om PC-hydrogels te crosslinken, een UVA-lichtbron met een belichtingstijd gelijk aan 3,2 joules per centimeter vierkant per millimeter dikte om de celbevattende precursor te bestralen.Gebruik eventueel een goedkopere handlamp voor tandheelkunde. Vermijd overbelichting van de hydrogel, omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen zal verminderen. Fysisch gecrosslinkte hydrogels worden in plaats daarvan geplaatst bij 37 °C.Verwijder na crosslinking de mal voor het gieten van de PDMS-hydrogel en vervang deze door de eerder voorbereide PDMS-schaal. Gebruik een steriele spatel om de PDMS op het glas te drukken zodat deze hecht. Voeg fenolvrij serumvrij medium of een chemisch gedefinieerd medium toe aan de put in de PDMS-schaal en plaats een dekglas om de hydrogel ondergedompeld te houden.Incubeer de schaal bij 37 °C gedurende 30 minuten. Zodra de PDMS-schaal met de hydrogel op de microscooptafel is bevestigd en er olie op het objectief is aangebracht, gebruik dan doorgelaten licht om ten minste 15 cellen voor beeldvorming te lokaliseren en verifieer de transfectie met fluorescentiebeeldvorming. Configureer in de microscoopsoftware de camera-instellingen voor de FRET-beeldkanalen door enkele cellen nabij het centrum van het gezichtsveld te selecteren, en optimaliseer de belichtingstijd en gain per beeldkanaal volgens het tekstprotocol.Kies cellen die zich dicht bij het centrum van de hydrogel bevinden, binnen het relatief vlakke verlichtingsveld, die noch te helder noch te zwak zijn, en met een FRET-ratio tussen 00 en 1,0. Selecteer vervolgens meerdere gezichtsvelden om beelden te verkrijgen van ten minste 15 getransfecteerde cellen. Schakel het licht na afloop uit om de blootstelling te beperken.Voer de periodiciteit van de opnames in om de acquisitiesnelheid voor time-lapse beeldvorming te configureren. Gebruik een hoge snelheid voor de acquisitie van het basissignaal, bijvoorbeeld elke vijf seconden per gezichtsveld, en een lagere snelheid voor de daaropvolgende langetermijnkinetiek van de signalering. Selecteer Run now om de beeldacquisitie te starten en leg gedurende vijf minuten beelden vast om een baseline vast te stellen voor de respons van de probe in het aangewezen gezichtsveld.Na de vijf minuten van beeldacquisitie, pipetteert u de gewenste agonist of antagonist in, mengt u dit door te pipetteren en gaat u verder met de beeldvorming. Nadat de FRET-kalibratie volgens het tekstprotocol is uitgevoerd, selecteert u in de microscoopsoftware het pijltje op het pictogram voor de achtergrond-region of interest en kiest u Teken Elliptische Achtergrond-Region of Interest. Teken en wijs per gezichtsveld één region of interest, of ROI, aan in de buurt van de cellen om het achtergrondniveau te definiëren.Zorg ervoor dat Keep Updating Background Offset is geselecteerd en activeer vervolgens de weergave van het achtergrondgeïnteresseerde gebied door op het pictogram Background Region of Interest te klikken. Kies alternatief het pictogram voor het geïnteresseerde gebied en stel de eigenschappen van het geïnteresseerde gebied in op Use as Background Region of Interest en Regions of interest are different in each Multi Point. Selecteer vervolgens Subtract Background Using Region of Interest met behulp van het pictogram voor de achtergrond van het geïnteresseerde gebied.Selecteer in het pop-upvenster onder Subtract Background Region of Interest de optie Every Image en selecteer onder Apply To de optie All Frames. Om voor elk gezichtsveld een region of interest rond de cel te definiëren met behulp van het acceptor-emissiekanaal en een binair masker, gebruikt u het menu Binary, Define Threshold, en selecteert u Apply To Current Frame. Pas vervolgens de onderste drempelwaarde aan om de cellen te selecteren.Gebruik vervolgens, indien nodig, de functie Binary Close om gaten in het binaire masker op te vullen. Gebruik daarna het Region of Interest-pictogram om Copy Binary to Region of Interest te selecteren, zodat het binaire masker als regio's van belang kan worden opgeslagen. Voeg de regio's van belang voor volgende gezichtsvelden toe aan de bestaande pool van regio's van belang.Verwijder alle onjuiste regio's van interesse. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de regio's van interesse en controleer of de eigenschappen zijn ingesteld op Use as Standard Region of Interest en dat Regions of Interest are different in each Multi Point. De regio's van interesse voor cellen kunnen handmatig worden getekend, maar er moet zorgvuldig worden toegezien dat onjuiste waarden worden verwijderd.Het protocol bevat procedures voor cellen die zich buiten het vlakke verlichtingsveld bevinden en voor microscopen die geen vlak veld hebben. Centrifugatie van de hydrogel-precursoren vóór gelering maximaliseerde het aantal cellen in één brandvlak nabij het dekglas. Dit minimaliseerde de achtergrondruis en verhoogde de doorvoer van de beeldvorming.In dit FRET-experiment, voor de berekening van de FRET-ratio van de gedoofde emissie (QE), waren voor de enkelstrengse binaire ICUE1-probe slechts twee beelden vereist: QE gelijk aan CFP CFP voor excitatie en emissie, en acceptor-emissie gelijk aan YFP YFP voor excitatie en emissie. Er werden meerdere gezichtsvelden geselecteerd waarin verschillende cellen zich binnen het gebied van homogene verlichting bevonden, zoals hier getoond. ROI's voor achtergrondcorrectie van kanaalsignalen en voor celanalyse werden aangewezen met behulp van drempelwaarde-gecorrigeerde beelden van de acceptor-emissie aan het begin van de experimenten.Daarnaast, zoals hier getoond, werden cellen geselecteerd die voldoende probestroom vertoonden. De QE- en gesensitiseerde emissie-FRET-ratio's per pixel en de gemiddelde FRET-ratio per cel werden berekend. De inverse van de SE-ratio werd berekend en beide ratio's werden genormaliseerd.Onder stimulatie met forskoline detecteren zowel de op QE als op SE gebaseerde FRET-ratio's de verhoogde cyclisch AMP-activiteit in chondrocyten. Zowel fysiek gecrosslinkte als chemisch gecrosslinkte gels vertoonden een toename van de QE FRET-ratio in de loop van de tijd, wat wijst op een verhoogde cyclisch AMP-signaleringsrespons na toevoeging van forskoline. Deze procedure kan worden gebruikt met andere microscopietechnieken, zoals FRAP, FLIM-FRET en FRET- en anisotropiemetingen, om vragen te beantwoorden zoals wat de verschillen zijn in permeabiliteit en cellulaire signalering tussen verschillende typen microweefsels.Aangezien de crosslinking nabij het PDMS wordt onderdrukt, is het belangrijk om te onthouden de mallen voor de foto-crosslinked hydrogelen iets groter in diameter te ontwerpen dan de hydrogelen zelf.

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Dit protocol beschrijft de implementatie van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om vasculair-afgeleide, biomimetische microfluïdische netwerken te fabriceren die zijn ingebed in poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogels. Deze biomimetische microfluïdische systemen kunnen nuttig zijn voor weefselengineering toepassingen, generatie van in vitro ziektemodellen en fabricage van geavanceerde "on-a-chip" apparaten.

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Leer FRET-beeldvorming in driedimensionale hydrogels voor de studie van intracellulaire signalering in cellen. Deze methode maakt real-time analyse mogelijk met conventionele microscopie voor onderzoek naar weefselbiologie.

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Meer video's verkennen