Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study
14 juli 2016
Er wordt een reverse-genetics benadering gepresenteerd om genfamilies geassocieerd met menselijke ziekten te begrijpen, waarbij muis als modelsysteem wordt gebruikt, en het daaropvolgende muis fenotyperingsschema wordt beschreven. Omdat muizen met een defect in een gen van belang, HtrA2, Parkinson-symptomen vertoonden, is het fenotyperingsregime gericht op het identificeren van neurologische defecten.
Het algemene doel van dit testregime is om een reeks eenvoudige tests vast te stellen die kunnen worden gebruikt als een eerste fenotyperingspijplijn om vervolgonderzoek naar gedragsfenotypes en de structuur en functie van weefsels te sturen. Of de gedrags- en cellulaire fenotipen van menselijke ziekten worden nagemaakt in het muismodel. Het grote voordeel van deze techniek is dat de tests kunnen worden uitgevoerd in laboratoria zonder eerdere ervaring met dergelijke experimenten zonder aanzienlijke investering en toch geïnformeerde verdere detailstudies.
Voer dagelijks de Hind Limb Test uit vanaf post-natale dag vier tot 10 om proximale achterbeenspierkracht, zwakte en vermoeidheid te evalueren. Laat de muizen om te beginnen 30 minuten wennen aan het testgebied. Bereid intussen een nieuwe 500 milliliter conische buis voor door deze uit te spoelen met 70% ethanol en vervolgens één of twee wattenbolletjes in de bodem van de buis te duwen.
Bevestig deze buis in verticale positie voor de test. Wanneer ze niet worden getest, houd de pups bij de moeder om hun temperatuur te handhaven. Na de helft van de acclimatisatie verwijdert u een pup uit de kooi en noteert u het gewicht.
Vervolgens hangt u de pasgeborene voorzichtig aan zijn achterpoten boven de rand van de buis, zodat de pup naar de watten kijkt. Tel vervolgens het aantal trekpogingen van de pup en meet de latentie tot vallen. Na 30 seconden wachten herhaalt u de test.
Na de tweede test, markeert u de pup met een marker. Wrijf vervolgens de pup voorzichtig met beddengoed uit de thuiskooi en breng hem terug naar de moeder. Omdat oudere P8-pups niet kunnen worden gemarkeerd, identificeert u ze met een teenclip.
Voordat u doorgaat naar de volgende pup, veegt u de testbuis af met 70% ethanol. Voer dagelijks de Weanling Observation Test uit van P19 tot P21 om beweging en algemene activiteitsniveaus te scoren. Begin met het laten wennen van de muizen aan het testgebied gedurende 30 minuten.
Terwijl de pups wennen, bereidt u de arena voor. Markeer een plexiglas testbox met een zes-bij-zes raster van vierkantjes van twee inch. Reinig de box voor gebruik met 70% ethanol.
Plaats vervolgens een videocamera zodat een zijwaartse weergave van de hele box het gezichtsveld vult. Standaardiseer het uiterlijk van de omgeving om vernieuwing te voorkomen. Breng vóór de test de weanling over naar een schone houder en noteer het gewicht.
Begin vervolgens met video-opname. Film eerst een testidentificatiekaart met het identificatienummer van de muis, zijn leeftijd en de huidige datum. Breng vervolgens de muis over van de houder naar het middelste vierkant.
Tel gedurende drie minuten het aantal lijnen dat door beide voorpoten wordt overgestoken. Na drie minuten plaatst u de muis terug in een schone kooi en beëindigt u de video-opname. Reinig tussen elke test de box met 70% ethanol.
Tel uit de video's de rearing-gebeurtenissen, dat wil zeggen wanneer een muis met beide voorpoten zonder steun staat. Tel ook de verzorgingsgebeurtenissen, die optreden wanneer beide voorpoten bezig zijn met schoonmaken. Voer de Grip Strength Test uit op alternatieve dagen tussen P22 en P26 om de neuromusculaire kracht te beoordelen.
Laat de muizen zoals gewoonlijk 30 minuten om zich aan te passen aan het testgebied. Het testapparaat is een plexiglasbox met een gaasrooster. Reinig beide met 70% ethanol.
Bekleed vervolgens de bodem van de box met een laag bubble wrap voor demping en bedek de bubble wrap met papier om uitscheidingen te absorberen. Scheid nu de testmuizen en laad ze in individuele bekers. Plaats nu de eerste muis op het midden van het gaasrooster en draai het rooster langzaam om 10 tot 20 centimeter boven het zachte oppervlak van de box.
Meet de latentie tot vallen of beëindig de test na 60 seconden, als de muis niet valt. Plaats vervolgens de eerste muis terug in de houder. Veeg het gaas tussen de tests af met 70% ethanol en plaats het papier over de bubble wrap.
Voer vervolgens de test uit op de twee andere muizen in de groep. Nadat elke muis eenmaal is getest, herhaalt u het proces nog twee keer voor drie proeven per muis. Als er minder dan drie muizen in een groep zijn, zorg er dan voor dat er een tussenproefhersteltijd van minimaal vijf minuten is.
Voor een NADH Diaphorase Stain combineert u gelijke volumes van vers gemaakte NADH-oplossing en vers gemaakte NBT-oplossing. Voeg vervolgens één milliliter kleuroplossing toe aan elke slide en incubeer de slides in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voor een Succinate Hydrogenase Stain, bereidt u een oplossing van 0,1 molair natriumsuccinaat, 1,25 molair NBT en 0,2 molair fosfaatbuffer.
Voeg vervolgens één milliliter toe aan elke slide. Verpak de slides in een bevochtigde kamer en incubeer de slides bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Na incubatie met een van beide kleurstoffen, aspireert u de kleuroplossing en wast u de slides drie keer met gedistilleerd water.
Was vervolgens de slides door een reeks acetonbaden die toenemen en afnemen in concentratie. Voer voor elke concentratie aceton drie wasbeurten uit gedurende twee minuten per wasbeurt. Spoel de slides tot slot drie keer af met gedistilleerd water.
Monteer vervolgens de slides met een waterige medium. Muizen zonder HTRA2-expressie werden onderzocht met behulp van de beschreven batterij van tests en vergeleken met nestgenoten als controle. Er werd geen verandering in het aantal trekken of de latentie tot vallen gezien tussen P4 en P6. Tussen P7 en P10 werd een vermindering van de neuromusculaire kracht opgemerkt.
In de activiteitstest was er verminderde activiteit van HTRA2 knockout-muizen. HTRA2 knockout-muizen vertoonden ook een vermindering van kracht in de gaasrooster-grijproef. H en E-kleuring toont aan dat de HTRA2 knockout-muizen geen duidelijke veranderingen in retinale structuur hadden in vergelijking met controles bij P35.
Ten slotte werd histochemische kleuring voor de activiteit van het elektronentransportketenuitzicht gebruikt om veranderingen in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een reverse-genetica benadering om genfamilies te onderzoeken die gekoppeld zijn aan menselijke ziekten met behulp van een muismodell. De focus ligt op het gen HtrA2, dat geassocieerd wordt met Parkinsoniaanse symptomen, en er wordt een fenotyperingsregime beschreven om neurologische defecten te identificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Muismodellen
Achtergrond
- Het begrijpen van genfuncties is essentieel om deze te kunnen koppelen aan menselijke ziekten.
- Muismodellen worden veelvuldig gebruikt om genetische aandoeningen te bestuderen.
- HtrA2 is geïmpliceerd bij de ziekte van Parkinson.
- Fenotypering helpt bij het identificeren van specifieke neurologische defecten.
Doel van de studie
- Om een fenotyperingspijplijn op te zetten voor initiële beoordelingen van gedragsmatige en cellulaire fenotypen.
- Om vast te stellen of muismodellen de humane ziektefenotypen accuraat weerspiegelen.
- Om verdere gedetailleerde onderzoeken naar de effecten van genetische mutaties te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Uitvoeren van de hind limb test om spierkracht en vermoeidheid te evalueren.
- Dagelijkse tests van postnatale dag vier tot tien.
- Acclimatisatie van de muizen aan het testgebied voorafgaand aan de beoordelingen.
- Voorbereiden van de testapparatuur onder steriele omstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Vaststelling van een eenvoudig testregime voor fenotypering.
- Identificatie van gedragsmatige en neurologische defecten bij HtrA2-deficiënte muizen.
- Demonstratie van de haalbaarheid van de tests in beginnende laboratoria.
- Inzicht in de relatie tussen genmutaties en ziektesymptomen.
Conclusies
- De fenotyperingspijplijn is effectief voor initiële beoordelingen.
- Muismodellen kunnen aspecten van menselijke ziekten nabootsen.
- Deze aanpak kan toekomstig onderzoek naar genetische aandoeningen sturen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het vaststellen van een gestandaardiseerde fenotyperingspijplijn maakt vroege detectie van gedragsmatige en cellulaire fenotypes in genetisch gemodificeerde muismodellen mogelijk, wat de validatie van targets voor ouderdomsgerelateerde ziekten zoals AMD en Parkinson ondersteunt. Deze aanpak vermindert mechanistische ambiguïteit door genetische modificaties te koppelen aan observeerbare functionele resultaten, wat bijdraagt aan go/no-go beslissingen in preklinische programma's. De eenvoud van het regime maakt brede adoptie door discovery-teams mogelijk, waardoor de reproduceerbaarheid en de cross-functionele afstemming bij inspanningen om targets te ontrisken worden verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de neuromusculaire kracht en activiteitsniveaus in HtrA2-deficiënte muizen te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk via systematische gedragsscreening zonder dat hiervoor gespecialiseerde expertise nodig is.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door fenotypes te identificeren die menselijke ziektemechanismen kunnen weerspiegelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-assays door baseline-metrieken voor gedrag en weefselfunctie vast te stellen.
- Operationele waarde: Bevordert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via gedefinieerde acclimatisatie-, test- en sanitatieprotocollen.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform in verschillende laboratoria dankzij minimale apparuureisen en een eenvoudige uitvoering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt genetische modificaties aan ziekterelevante fenotypes in neurale en musculaire systemen, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het bieden van kwantificeerbare, reproduceerbare resultaten.
- Risicobeperking: Informeert beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door tekortkomingen in de motorische functie en mitochondriale activiteit aan te tonen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het fenotyperingsregime is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor hypothesetests en biologische risicoreductie mogelijk zijn voorafgaand aan de compoundscreening.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests door de kracht van de achterpoten, de latentie tot vallen en het opricht- en verzorgingsgedrag te meten als indicatoren voor neurologische functies.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, kwantitatieve outputs zoals het aantal trekkrachten, latentiemetingen en activiteitsscores.
- Analytica: Genereert vergelijkbare datasets over verschillende genotypen en tijdstippen, wat statistische evaluatie van neuromusculaire en gedragsmatige tekortkomingen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door mitochondriële dysfunctie te identificeren in hersengebieden die relevant zijn voor de pathologie van de ziekte van Parkinson.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het evalueren van meerdere genetisch gemodificeerde modellen over diverse ziektegebieden.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door mechanistische ambiguïteit bij de mapping van gen naar fenotype te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende locaties en teams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie, en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen targetprogramma's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van vroege fenotypische screening.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van muizen, neonataal testen en basisstijf-histologische kleuringstechnieken.
- Afhankelijk van standaard laboratoriumapparatuur, waaronder conische buizen, plexiglas arena's, videorecordingsystemen en incubatoren voor histochemische kleuring.
- Vereist standaardisatie tussen teams van acclimatisatieperioden, testtijdstippen en sanitatieprotocollen om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van het regime op verschillende modelsystemen, leeftijden of genetische achtergronden.
- Beperkt tot observeerbare gedragsmatige en cellulaire fenotypes; legt mogelijk complexe cognitieve of laat optredende degeneratieve processen niet vast zonder aanvullende assays.
