Name: Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een fenotyperingsregime voor genetisch gemodificeerde muizen om gedrags- en neurologische defecten te identificeren. Deze methode gebruikt de Hind Limb Test en gripsterktetests voor initiële beoordelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor dit onderzoek kwam van Rosebay Medical Foundation en een Yale Medical School Dean&#39;s Research Fund (JH). Wij danken Dr. Claire Koenig voor hulp bij gedrags-experimenten. Genetisch gemanipuleerde muis lijnen gegenereerd op Ozgene (Perth, Australië).

Ethiek statement: Studies waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Yale University. 1. Behavioral Testen van genetisch gemodificeerde muizen Opmerking: Alle muizen worden onderworpen aan dezelfde testregeling verschillen in gewenning beperken hanteren. Dienen te worden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip elke keer. <ol><li> Neonatale Hind Limb Test Opmerking: De achterste ledematen test wordt dagelijks uitgevoerd van postnatale dag (P) 4 tot en met P10 tot proximale achterste ledematen spierkracht, zwakte en vermoeidheid te evalueren. <ol><li> Transport muizen testgebied en laten rusten gedurende 30 minuten voor het testen. </li><li> Bereid testinrichting door het reinigen van een 50 ml conische buis met 70% ethanol, duw twee (P4-P8) of één (P9-P10) wattenbolletjes onderaan de tUbe en vastzetten in een verticale positie. </li><li> Verwijder een pup uit de kooi en opnemen gewicht. Blijf jong in die lade op warmte pad wanneer niet testen. </li><li> Voorzichtig schorten de achterste ledematen van de pasgeborene over de rand van de conische buis, zodanig dat deze naar beneden in de richting van de katoenen ballen. Tel het aantal pull pogingen en meet latentie te vallen met een stopwatch. </li><li> Herhaal dit nog een keer dan het etiket van de pup met teller. Daarna identificeren P6 pups door teen knippen. Wrijf zachtjes pups met beddengoed van huis kooi voordat u deze vervangt. </li><li> Veeg conische buis met 70% ethanol. </li><li> Herhaal het testen op de volgende pup totdat het hele nest is getest. </li><li> Gooi katoenen bal en conische buis. Reinig alle apparatuur met 70% ethanol. </li></ol></li><li> Weanling Observation Test Opmerking: De gespeende observatie test wordt dagelijks toegediend vanaf P19 naar P21 om beweging en de algemene activiteit scoren. <ol><li> Transport muizen om testgebied eennd laten rusten gedurende 30 minuten voor het testen. </li><li> Bereid Plexiglas box testen met een 6x6 rooster van vierkanten 2 inch op de basis gekenmerkt door reiniging met 70% ethanol. Opgericht videoapparatuur opzij zodanig is dat de doos in het beeldveld. Houd de set-up en omgeving hetzelfde elke dag om te voorkomen dat er nieuwigheid. </li><li> Verwijder een gespeende uit de kooi en plaats in een schone kop houden. Record gewicht. </li><li> Begin met video-opname door het filmen van de test identificatiekaart, met de muis identificatienummer, de leeftijd en de datum van de test. Transfer muis van met cup naar het centrum plein. Tijd voor drie minuten, het tellen van het aantal lijnen doorkruist door beide voorpoten van de muis tijdens de test. </li><li> Terug muis om een ​​schone kooi en end video-opname. </li><li> Reinig het testapparaat met 70% ethanol. </li><li> Herhaal dit totdat alle nest is getest, dan terug alle pups naar de kooi. </li><li> Reinig alle testen van apparatuur met 70% ethanol. </li><li&gt; Met behulp van de video&#39;s, kwantificeren het aantal van het houden van evenementen die door tellen na de visuele waarneming, waarbij een muis staat met beide voorpoten vrij van steun, en het verzorgen evenementen, waar beide voorpoten zijn bezig met het schoonmaken. </li></ol></li><li> Wire Mesh Grip Strength Test Opmerking: de grijpkracht test wordt uitgevoerd op afwisselende dagen tussen P22 en P26, neuromusculaire sterkte te beoordelen. <ol><li> Transport muizen testgebied en laten rusten in kooi gedurende 30 minuten voor het testen. </li><li> Bereid apparaat met het schoonmaken van een plexiglas doos en rooster met 70% ethanol. Plaats noppenfolie in de bodem van de doos en bedek met papier. </li><li> Afzonderlijke muizen in groepen van drie, het plaatsen van in individueel bedrijf cups. </li><li> Plaats eerste muis op het midden van het gaas en langzaam omkeren 10-20 cm boven het zachte oppervlak van de bodem van de doos plexiglas. Meet de latentie te vallen met een stopwatch. Beëindigen testen na 60 sec zijn verstreken als de muis niet doetvallen. </li><li> Terug muis te houden kopje, doekje gaas met 70% ethanol en papier vervangt over de noppenfolie. Voeren de proef op de resterende twee muizen in de groep alvorens terug te keren naar de eerste. Herhaald tot elke muis werd een totaal drie keer getest. </li><li> Zet de groep een schone kooi en verder met de resterende groepen. Als er minder dan drie muizen in elke groep, ervoor te zorgen dat een 5 min inter-proces herstel interval is toegestaan. </li><li> Terug alle muizen naar de kooi, vervreemden papier en schone testen van apparatuur met 70% ethanol. </li></ol></li></ol> 2. Onderzoek van netvliesstructuur <ol><li> Verdoven dieren bij P30-35 door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Beoordelen van de diepte van de anesthesie door knijpen de voetzool en ga alleen in het uitblijven van een antwoord, in lijn met IACUC richtlijnen. Perfuseren met 4% PFA / PBS 48. </li><li> Om de ogen te verwijderen, de huid schoon te maken bij de incisie siTE met 70% ethanol, voor het snijden door de huid bij de basis van de schedel. Trek de huid aan de schedel en schoon met 70% ethanol bloot te leggen. Met behulp van schone instrumenten, knip voorzichtig door de schedel naar de oogkassen te bereiken en bloot de ogen. Sever de oogzenuw, voorzichtig de ogen te verwijderen uit het stopcontact en spoel in PBS. </li><li> Fix ogen in 4% PFA / PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats ogen in een petrischaaltje met PBS. Voeg een kleine incisie in het midden van de cornea met steek verwijdering schaar. Verwijder het hoornvlies door het snijden van de rand tussen het hoornvlies en sclera. Gebruik een tang om de iris te verwijderen. Tot slot, trek het RPE lagen, waardoor het netvlies intact en de lens op zijn plaats. Opmerking: De 4% PFA / PBS fixatie loslating van RPE waardoor de RPE gemakkelijk worden afgepeld van de buitenkant van het netvlies. </li><li> Re-fix in 4% PFA / 30% sucrose / PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, voordat de ogen van een petrischaaltje met PBS. Trek de lens behulp van een tang, waardoor het glasachtige lichaam met zich mee. </li><li> Cryoprotect in 30% sucrose overnacht bij 4 ° C. </li><li> Coat ogen in Optimale Cutting Temperatuur verbinding (OCT) en transfer naar een inbedding mal met vers oktober Waar zich het oog zodat het sagittale vlak evenwijdig aan het snijvlak, waarbij als weinig bewegingen mogelijk en het vermijden van de introductie van luchtbellen. Flash bevriezen door onderdompeling van de schimmel in een droog ijs / ethanol bad. Opslag blokken bij -80 ° C. </li><li> Met behulp van een cryostaat gesneden 20 urn sagittale secties en verzamelen op vooraf gereinigd dia. </li><li> Vlek secties met hematoxyline en eosine volgens standaardprotocollen 49. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder veld microscopie. </li></ol> 3. Histochemische kleuring <ol><li> monstervoorbereiding <ol><li> Euthanaseren dieren bij P30-35 met behulp van isofluraan overdosis (30% in propyleenglycol) via openbare druppel inademing. Beoordelen van euthanasie door de stopzettingvan de ademhaling, hartslag en het gebrek aan reactie op knijpen de voetzool. Bevestig de dood door cervicale dislocatie en het verwijderen van organen, in lijn met de IACUC richtlijnen. </li><li> Aan de hersenen verwijderd, de huid op de incisieplaats met 70% ethanol reinigen, voor het snijden door de huid bij de basis van de schedel. Trek de huid aan de schedel en schoon met 70% ethanol bloot te leggen. Met behulp van schone instrumenten, knip voorzichtig door de schedel en naar de hersenen bloot te leggen. Verwijder de membranen en voorzichtig de hersenen uit de schedel holte. Spoel in PBS. </li><li> Smeer de hersenen in oktober en transfer naar een inbedding mal met vers oktober Oriënteren de hersenen zodat het sagittale vlak evenwijdig aan het snijvlak, waarbij als weinig bewegingen mogelijk en het vermijden van de introductie van luchtbellen. Flash bevriezing door onderdompeling van de vorm in een droogijs / ethanol bad en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Met behulp van een cryostaat gesneden 10 urn sagittale secties en verzamelen op vooraf gereinigd dia. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH diaforase kleuring <ol><li> Bereid 0,05 M Tris, pH 7,6 door het oplossen van 5,72 g Tris-HCl en 1,66 g Tris base in 1L-gedemineraliseerd water. Bewaren bij 4 ° C gedurende tot zes weken. </li><li> Bereid NADH-oplossing (2,25 mM NADH in 0,05 M Tris buffer). Aliquot en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid NBT oplossing (2,5 mM Nitro-tetrazolium in 0,05 M Tris buffer). Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal zes weken in een glazen fles. </li><li> Combineer gelijke volumes van NADH-oplossing en NBT oplossing voor kleuroplossing te maken en voeg 1 ml aan elke dia. Incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer gedurende 30 minuten. </li><li> Zuig kleuroplossing en was drie keer met dH 2 O. </li><li> Was driemaal elk in stijgende en dalende concentraties van aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel drie keer in dH 2 O en secties te monteren met waterig medium. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder field microscopie. Blauwkleuring overeen met enzymatische activiteit. </li></ol></li><li> Succinaatdehydrogenase Histochemische kleuring <ol><li> Bereid 0,2 M natriumfosfaat monobasisch fosfaat / dH 2 O en 0,2 M natriumfosfaat dibasisch fosfaat / dH 2 O. </li><li> Voeg 0,2 M fosfaatbuffer, pH 7,6 door het combineren van 3 delen monobasisch fosfaat met 20 delen natrium- dibasisch fosfaat. </li><li> Bereid kleuroplossing (0,1 M natriumsuccinaat, 1,25 M NBT in 0,2 M fosfaatbuffer) en voeg 1 ml aan elke dia. Incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer gedurende 60 minuten. </li><li> Zuig kleuroplossing en was drie keer in dH 2 O. </li><li> Was driemaal elk in stijgende en dalende concentraties van aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel drie keer in dH 2 O en secties te monteren met waterig medium. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder veld microscopie. Blauwkleuring overeen met enzymatic activiteit. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben geen concurrentiebelangen om bekend te maken.

Robuuste behandelingen nodig om de gevolgen van de slopende aandoeningen die verband houden met menselijke veroudering te beperken, maar zij blijven ongrijpbaar voor veel aandoeningen. Om potentiële therapeutische targets te identificeren en strategieën voor interventie ontwikkelen, moet de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met veroudering eerst begrepen. Niet alle genetisch gemodificeerde muizen onmiddellijk duidelijk aanwezig met fenotypes die verband houden met de ziekte van belang, zelfs als die gen...

Leeftijdsgebonden ziekten worden steeds overwegend in de moderne samenleving. Als de medische wetenschap verbetert en de levensverwachting toeneemt, de bevolking steeds ouder en de last van deze ziekten groeit. Effectieve behandelingen zijn noodzakelijk om de gevolgen van de slopende omstandigheden te verminderen, maar blijven ongrijpbaar in veel gevallen. Alleen door inzicht in de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met het ouder worden kunnen wetenschappers beginnen om potentiële therapeutische doelen strategieën te identificeren en ontwikkelen voor interventie. Frequente leeftijdsgebonden aandoeningen omvatten neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). PD is de meest voorkomende aandoening veroorzaakt door beweging neurodegeneratie bij mensen. De meeste PD patiënten vertonen symptomen zoals rust tremor, bradykinesie en stijfheid na 50 jaar. Early onset is ook waargenomen bij ongeveer 10% van de gevallen. AMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bijouderen, geleidelijk beschadigen fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel (RPE) in het oog. Centrale visie is verminderd, maar de perifere zicht is over het algemeen niet beïnvloed. Er zijn twee vormen van AMD. In de &quot;droge&quot; vorm, extracellulaire eiwit deposito&#39;s bekend als drusen vorm tussen de RPE en Bruch&#39;s membraan (BM), wat leidt tot geografische atrofie en vervaging van de centrale visie. Hoe ernstiger &quot;natte&quot; vorm resultaten van neovascularisatie van het vaatvlies over BM in de RPE en fotoreceptorcellen lagen en kan leiden tot hamorrhaging onder de retina die permanente schade aan retinale weefsel veroorzaakt. Genome associatiestudies eerder geïdentificeerde loci die zijn geassocieerd met verhoogde gevoeligheid voor deze ziekte en die twee gebieden van belang: complement factor H (CFH) op chromosoom 1 en 10q26 locus, waarbij de leeftijdsgebonden macula degeneratie gevoeligheid 2 (ARMS2) en hoge temperatuur eis factor A1 (HtrA1) genen bevinden zich 1-5 </sup&gt;. Combinaties van deze allelen de kans op AMD op een dosisafhankelijke wijze en specifieke SNPs kunnen bij voorkeur worden tezamen met de natte of droge vormen van AMD 3-6. CFH fungeert als een negatieve regulator van de alternatieve route (AP) van het complementsysteem door remmen van de activering van C3. Een enkel nucleotide polymorfisme (SNP) is gekoppeld aan een verhoogd risico op AMD, waardoor uitwisseling van tyrosine 402 in exon 9 met histidine door een T naar C substitutie 1. AMD wordt aangenomen dat de AP misregulated door functieverlies van CFH maar of de SNP speelt een causale rol onduidelijk. Een hypothese is dat de positief geladen histidine Men denkt dat het vermogen van CFH te binden aan interagerende eiwitten C-reactief proteïne en heparine sulfaat 1,7 ontkrachten. In vitro studies CFH Y402H geven tegenstrijdige resultaten over functionele verschillen tussen de varianten, en vivo werk in &lt;em&gt; CFH - / - muizen die gehumaniseerd CFH is aan de gang 8. ARMS2 ligt stroomopwaarts van HtrA1 in het genoom primaten, hoewel het gen ontbreekt bij muizen. HtrA1 is een serine protease, maar ARMS2 is slecht gekarakteriseerd. De verbindingsevenwichtsafwijking tussen SNPs in de AMD-geassocieerde locus is het moeilijk om de bijdrage aan risico van individuele mutaties van de genen in deze regio te bepalen, maar recent werk heeft gesuggereerd dat het overexpressie van HtrA1 plaats ARMS2 die tot neovascularisatie en subretinale eiwit deposito&#39;s 9-11. Echter, de nabijheid van de genen in deze locus zorgen voor interacties die niet worden bestudeerd gebruikend willekeurig geplaatst transgenen. Naast AMD is de HtrA van serine proteasen geassocieerd met vele menselijke ziekten. Alle eiwitten HtrA een serineprotease-domein gevolgd door ten minste één C-terminale PDZ-domein. HtrA1, HtrA3 en HtrA4 delen grdaarvan eet homologie bestaat uit een signaalpeptide, insuline-achtige groeifactor bindend domein, een Kazal proteaseremmer domein, het serineprotease-domein en een PDZ-domein. HtrA2 een andere N-terminus, bestaande uit een mitochondriaal lokalisatiesequentie, transmembraandomein en inhibitor van apoptose bindingsdomein gevolgd door het protease en PDZ-domeinen 12-16. HtrA1 zoogdieren wordt geregeld door substraat-geïnduceerde remodellering in de actieve plaats van het protease domein 17-20 en HtrA2 kan ook worden gemoduleerd door wisselwerking tussen het serine protease en PDZ-domeinen die proteaseactiviteit 21 onderdrukt. Interessant, heeft het PDZ-domein niet om soortgelijke regelgeving verlenen tegen HtrA3 16. De HtrA proteasen kan ook worden geregeld door extrinsieke factoren: het werd onlangs aangetoond dat er sprake is van een wettelijke interactie tussen HtrA1 en protoporfyrine 22 en HtrA2 kan worden gereguleerd door fosforylering bij activering van de p38 MAP kinaseroute in een PINK1 23 afhankelijke wijze. Het schrappen van individuele leden van de familie HtrA bij muizen is gedocumenteerd echter mechanistische effecten grotendeels onduidelijk mede door gebrek aan zichtbare fenotypen. HtrA1 speelt een belangrijke rol in proteïne kwaliteitscontrole en misregulation of mutatie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten, waaronder artritis, kanker en een verhoogd risico op AMD 3,4,24-32. Verlies van HtrA2 functie in neurale weefsels is geassocieerd met PD fenotypes bij mensen en muizen, terwijl het verlies van niet-neurale weefsels leidt tot versnelde veroudering 33-37. HtrA3 ontregeling is geassocieerd met ziekten zoals pre-eclampsie en bepaalde vormen van kanker 38,39. Up-regulatie van HtrA4 waargenomen in de placenta van preëclampsie patiënten maar knockout muizen openlijk fenotype 40,41 niet weergegeven. Het gebrek aan fenotypen waargenomen bij sommige knockout muizen isverondersteld om een resultaat van de compensatie tussen de HtrA familielid: men denkt dat zowel HtrA4 en HtrA1 interactie met de TGF-B-familie van eiwitten, waardoor compensatie door HtrA1 na verwijdering van HtrA4 41. Ook wordt gedacht dat aangezien HtrA1 HtrA3 en hebben een hoge mate van homologie domein zij zullen complementaire functies 42 hebben. Er is echter gesuggereerd dat HtrA eiwitten gedeeltelijk antagonistische functies kan hebben, concurrerende gemeenschappelijke doelen 43 te regelen. Om verder te onderzoeken deze risicofactoren drie gehumaniseerd knock-in muizen lijnen werden gegenereerd. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh en CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 van het CFH-gen wordt vervangen door exon 9 van de humane homoloog. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codeert voor de niet-ziekte geassocieerd tyrosine residu op positie 402, terwijl CFH TM2 (CFH * 9) jhoh de Y402H, risico&#39;s geassocieerd SNP draagt. InARMS2 tm1jhoh het menselijk ARMS2 sequentie werd gericht op een gebied stroomopwaarts van HtrA1. Een loxP-geflankeerd STOP sequentie stroomopwaarts van de gensequentie maar stroomafwaarts van de opgenomen UbiC promoter werd uitgesneden door kruising met OzCre muizen, die Cre recombinase onder de controle van de promoter Rosa26 expressie, zoals eerder beschreven 34. Naast deze knock-in lijnen voorwaardelijke knockout allelen CFH en HtrA1 (CFH tm1jhoh en HtrA1 tm1jhoh), evenals de andere bekende HtrA familieleden werden gegenereerd: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) en HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De kiem-lijn knockouts zijn gemaakt door kruising OzCre muizen dieren ontworpen om specifieke exons met loxP plaatsen, zodanig dat verwijdering veroorzaakt een frame shift en / of verwijdering van de actieve domein (CFH flank, exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Een neuraal deletie van HtrA2, verwijderd met recombinase Cre onder controle van de promoter Nestin (HtrA2 flox, Tg (Nes-cre) 1Kln / J), is ook beschreven 34. Alleen muizen ontbreekt HtrA2, hetzij systemisch of in zenuwweefsel, weergegeven duidelijke fenotypes, presenteren met Parkinson fenotypes. Aangezien sommige van deze genen van belang worden geponeerd worden gelokaliseerd mitochondria 11,44-47 en verwijdering van HtrA2 gegenereerd Parkinson fenotypen fenotypering een regime met een mitochondriale en neurologische focus is beschreven en representatieve resultaten van de tests van belang verricht . Om genetisch gemanipuleerde muizen geproduceerd mens, leeftijdsgebonden aandoening grondig onderzoek en systematisch werd een eerste fenotypering tijdschema die onderzoeken, die bestaat uit een reeks tests betreffende de tweeziekten van belang: AMD en Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>wattenbolletjes</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>verwarmingsmat</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Houdplaat (ijsblokjesbak)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische stopwatch</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglasdoos</td><td>gebouwd in workshop</td><td></td><td>12" bij 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Camera</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz heldere bekers</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 inch draadgaas</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (in de winkel)</td><td>12" bij 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Kussenfolie</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Rechte specimentang</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Fijne dissectietang met punt</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7.4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost-glazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline kleurstofoplossing</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y kleurstofoplossing</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamidadenine dinucleotide, gereduceerd dinatriumzouthydraat</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazoliumboorchloride</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch monohydraat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinaat dibasisch hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount waterig montagemedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videocamera statief</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimale snijtemperatuur (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat snijdmachine</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Uit productie, maar sindsdien vervangen door CM1950</td></tr></tbody></table>

een fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in human ziekten van aging study

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Leeftijdsgerelateerde ziekten worden steeds vaker gezien en de last blijft groeien naarmate onze bevolking ouder wordt. Effectieve behandelingen zijn noodzakelijk om de impact van invaliderende aandoeningen te verminderen, maar blijven in veel gevallen ongrijpbaar. Alleen door de oorzaken en pathologie van ziekten geassocieerd met veroudering te begrijpen, kunnen wetenschappers beginnen met het identificeren van potentiële therapeutische doelen en strategieën voor interventie te ontwikkelen. De meest voorkomende leeftijdsgerelateerde aandoeningen zijn neurodegeneratieve stoornissen zoals de ziekte van Parkinson en blindheid. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij ouderen. Genome-wide associatiestudies hebben eerder loci geïdentificeerd die geassocieerd zijn met verhoogde vatbaarheid voor deze ziekte en hebben twee gebieden van belang geïdentificeerd: complement factor H (CFH) en het 10q26-locus, waar de leeftijdsgebonden maculopathie susceptibiliteit 2 (ARMS2) en hoog-temperatuur vereiste factor A1 (HtrA1) genen zich bevinden. CFH werkt als een negatieve regulator van de alternatieve weg (AP) van het complementsysteem terwijl HtrA1 een extracellulaire serine protease is. ARMS2 bevindt zich stroomopwaarts van HtrA1 in het primaat genoom, hoewel het gen afwezig is in muizen. Om de effecten van deze genen te bestuderen, werden gehumaniseerde knock-in muislijnen van Cfh en ARMS2, knockouts van Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 en HtrA4 evenals een conditionele neurale deletie van HtrA2 gegenereerd. Van alle genetisch gemanipuleerde muizen die zijn geproduceerd, vertoonden alleen muizen die HtrA2 misten, hetzij systemisch of in neurale weefsels, duidelijke fenotypes. Om deze muizen grondig en systematisch te onderzoeken, werd een initieel fenotyperingsschema vastgesteld, bestaande uit een reeks tests gerelateerd aan twee belangrijke ziekten van belang: AMD en Parkinson. Genetisch gemodificeerde muizen kunnen worden onderworpen aan geschikte experimenten om fenotypes te identificeren die mogelijk gerelateerd zijn aan de geassocieerde ziekten bij mensen. Een fenotyperingsregime met een mitochondriale focus wordt hier gepresenteerd naast representatieve resultaten van de tests van belang.

Dit deel beschrijft voorbeelden van de resultaten verkregen met behulp van deze methoden. In de achterste ledematen test, het aantal pull pogingen en de latentie te vallen zijn gesommeerd over twee opeenvolgende metingen per dag. Deze test kan worden gebruikt om genetisch verschillende groepen muizen te vergelijken met verminderde neuromusculaire sterkte HtrA2 tm1jhoh onderscheiden (HtrA2 KO) muizen in Figuur 1A -. B vertoonden geen v...

Er wordt een reverse-genetics benadering gepresenteerd om genfamilies geassocieerd met menselijke ziekten te begrijpen, waarbij muis als modelsysteem wordt gebruikt, en het daaropvolgende muis fenotyperingsschema wordt beschreven. Omdat muizen met een defect in een gen van belang, HtrA2, Parkinson-symptomen vertoonden, is het fenotyperingsregime gericht op het identificeren van neurologische defecten.

Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Het algemene doel van dit testregime is het vaststellen van een reeks eenvoudige tests die kunnen dienen als een initiële fenotyperingspijplijn om daaropvolgende gedetailleerde onderzoeken naar gedragsfenotypes en de structuur en functie van weefsels te sturen. Hiermee kan worden bepaald of de gedrags- en cellulaire fenotypes van menselijke ziekten worden gereproduceerd in het muismodel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de tests kunnen worden uitgevoerd in laboratoria zonder eerdere ervaring met dergelijke experimenten, zonder dat daarvoor aanzienlijke investeringen nodig zijn, terwijl ze toch een basis bieden voor verder gedetailleerd onderzoek.Voer dagelijks de Hind Limb Test uit van postnatale dag vier tot 10 om de proximale spierkracht, zwakte en vermoeidheid van de achterpoten te evalueren. Laat de muizen eerst 30 minuten wennen aan het testgebied. Bereid ondertussen een nieuwe conische buis van 500 milliliter voor door deze uit te spoelen met 70% ethanol en vervolgens één of twee wattenbollen tegen de bodem van de buis te duwen.Zet deze buis in een verticale positie voor de test. Wanneer er niet wordt getest, houd de pups bij de moeder om hun temperatuur te behouden. Na de acclimatisatie van een half uur haalt u een pup uit de kooi en noteert u het gewicht.Hang de neonatus vervolgens voorzichtig aan de achterpoten over de rand van de buis, zodat het pupje naar het katoen is gericht. Tel daarna het aantal trekpogingen van het pupje en meet de latentietijd tot het vallen. Herhaal de test na een wachttijd van 30 seconden.Label de pup na de tweede test met een marker. Wrijf de pup vervolgens voorzichtig in met nestmateriaal uit de thuiskooi en plaats hem terug bij de moeder. Omdat oudere P8-pups niet gemarkeerd kunnen worden, moeten zij worden geïdentificeerd via een teenknip.Veeg vóórdat u doorgaat naar de volgende pup de reageerbuis af met 70% ethanol. Voer de Weanling Observation Test dagelijks uit van P19 tot P21 om beweging en algemene activiteitsniveaus te scoren. Begin hiermee door de muizen 30 minuten lang te laten wennen aan het testgebied.Terwijl de pups acclimatiseren, bereidt u de arena voor. Markeer een testbox van plexiglas met een raster van zes bij zes vierkantjes van twee inch. Reinig de box met 70% ethanol voordat u deze gebruikt.Plaats vervolgens een videocamera zodanig dat een zijaanzicht van de gehele box het gezichtsveld vult. Standaardiseer het uiterlijk van de omgeving om te voorkomen dat er nieuwe prikkels worden geïntroduceerd. Verplaats het gesapende jong voor de test naar een schone houdbeker en noteer het gewicht.Vervolgens werd de video-opname gestart. Film eerst een testidentificatiekaart met het identificatienummer van de muis, de leeftijd en de huidige datum. Plaats de muis daarna vanuit de opvangbeker in het middelste vierkant.Tel gedurende drie minuten het aantal lijnen dat door beide voorpoten wordt overgestoken. Plaats de muis na drie minuten terug in een schone kooi en beëindig de video-opname. Reinig de box tussen elke test met 70% ethanol.Tel in de video's het aantal rearing-gebeurtenissen, wat het moment is waarop een muis staat met beide voorpoten vrij van ondersteuning. Tel daarnaast de grooming-gebeurtenissen, die plaatsvinden wanneer beide voorpoten betrokken zijn bij het schoonmaken. Voer op om en om dagen tussen P22 en P26 de Grip Strength Test uit om de neuromusculaire kracht te beoordelen.Geef de muizen, zoals gebruikelijk, 30 minuten om te wennen aan het testgebied. De testopstelling bestaat uit een plexiglas bak met een gaasrooster. Reinig beide met 70% ethanol.Bekleed vervolgens de bodem van de doos met een laag bubbeltjesplastic voor demping en bedek het bubbeltjesplastic met papier om uitscheidingen te absorberen. Ga verder met het scheiden van de proefmuizen en plaats ze in individuele bekers. Plaats nu de eerste muis in het midden van het gaas en kantel het gaas langzaam tot 10 tot 20 centimeter boven het zachte oppervlak van de doos.Meet de latentietijd tot het vallen of beëindig de test na 60 seconden, indien de muis niet valt. Plaats de eerste muis vervolgens terug in de houdbeker. Veeg tussen de tests door het gaas af met 70%ethanol en vervang het papier over de noppenfolie.Voer de test vervolgens uit bij de twee andere muizen in de groep. Nadat elke muis één keer is getest, wordt het proces nog tweemaal herhaald voor een totaal van drie proeven per muis. Als er minder dan drie muizen in een groep zijn, moet er een hersteltijd van ten minste vijf minuten tussen de proeven worden aangehouden.Voor een NADH-diaforasekleuring combineert u gelijke volumes van vers bereide NADH-oplossing en vers bereide NBT-oplossing. Voeg vervolgens één milliliter kleuringsoplossing toe aan elk preparaat en incubeer de preparaten in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Voor een succinaatdehydrogenasekleuring bereidt u een oplossing van 0,1 M natriumsuccinaat, 1,25 M NBT en 0,2 M fosfaatbuffer.Voeg vervolgens één milliliter toe aan elk objectglas. Plaats de objectglazen in een bevochtigingskamer en incubeer deze gedurende een uur bij 37 °C. Na incubatie met een van de kleurstoffen wordt de kleuringsoplossing afgezogen en worden de objectglazen drie keer gewassen met gedestilleerd water.Was de objectglazen vervolgens via een reeks acetonbaden met een oplopende en daarna weer dalende concentratie. Voer bij elke acetonconcentratie drie wasbeurten uit van twee minuten per wasbeurt. Spoel de objectglazen tot slot drie keer af met gedestilleerd water.Monteer vervolgens de coupes met een waterig medium. Muizen zonder HTRA2-expressie werden onderzocht met behulp van de beschreven batterij testen en vergeleken met nestgenoot-controles. Er was geen verandering in het aantal trekkingen of de latentietijd tot vallen waargenomen tussen P4 en P6. Tussen P7 en P10 werd een afname in neuromusculaire kracht vastgesteld.In de activiteitstest was er sprake van een verminderde activiteit bij HTRA2-knockoutmuizen. De HTRA2-knockoutmuizen vertoonden daarnaast een afname in kracht tijdens de wire mesh grip-test. H&amp;E-kleuring laat zien dat de HTRA2-knockoutmuizen op P35 geen duidelijke veranderingen in de retinale structuur vertoonden in vergelijking met de controles.Tot slot werd histochemische kleuring voor de activiteit van complexen van de elektronentransportketen gebruikt om veranderingen in de functies van respiratoire enzymen te identificeren. Er was sprake van een verminderde kleuring bij de HTRA2-knockoutmuizen in vergelijking met de controlegroep. Dit werd waargenomen in het cerebellum en het striatum, maar niet in de cortex.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de activiteit en neuromusculaire kracht van genetisch gemodificeerde muizen kunt beoordelen, en hoe u deze studies kunt combineren met cellulaire assen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-phenotyping-regimen-for-genetically-modified-mice-used-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit manuscript beschrijft een Morris water maze (MWM) protocol dat is aangepast voor gebruik met een veelgebruikte muismodel van de ziekte van Alzheimer. De MWM wordt veel gebruikt in transgene muismodellen. Implementatie van een procedure die gevoelig is voor de achtergrondstam van het muismodel is essentieel voor het detecteren van verschillen tussen groepen.

Morris Water Maze Test: Optimalisatie voor Mouse Strain en testomgeving

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Dit videoprotocol beschrijft een gevoelige, betrouwbare en snelle methode voor het evalueren van de neuromusculaire tekorten in een transgene muismodel van amyotrofische laterale sclerose.

Een Quick Fenotypische Neurologische Scoring System voor het evalueren van ziekteprogressie bij de SOD1-G93A muismodel van ALS

Dit witboek beschrijft een protocol voor cognitieve evaluaties voor genetische modellen de de ziekte van Alzheimer met behulp van het IntelliCage systeem, dat een hoge-doorvoer geautomatiseerde gedrags controlesysteem met Operante conditionering is.

Geautomatiseerd, op lange termijn gedrags Assay voor cognitieve functiestoornissen bij meerdere genetische modellen de ziekte van Alzheimer, met behulp van IntelliCage

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Het protocol presenteert de beeldvormings- en computationele workflow om beeldvormingsgebaseerde chromatine en epigenetische leeftijd (ImAge) te extraheren en te valideren.

Meten van eencelveroudering met een beeldvormingsgebaseerde biomarker van chromatine en epigenetische veroudering

De chirurgische procedure gebruikt om experimentele myocardinfarct bij de muis begint met linker thoractomie tussen de derde en vierde ribben om visualiseren het voorste oppervlak van het hart en linker long. De linker coronaire arterie geligeerd, wordt de borst gesloten en de muis mag spontaan herstellen.

Gewijzigd Techniek voor Coronary Artery Ligatie in Muizen

Het kwetsbaarheidssyndroom wordt vaak gezien bij ouderen en weerspiegelt fysiologische veranderingen in meerdere systemen. Echter, met verminderde functionele reserve en veerkracht is bekend dat kwetsbaarheid ook veel voorkomt bij de met HIV geïnfecteerde populatie. Dit onderzoek beschreef een eenvoudig toe te passen screeningstest om HIV-patiënten met kwetsbaarheid te identificeren. Wanneer significante componenten van kwetsbaarheid worden geïdentificeerd, zullen clinici zich kunnen...

Meten Frailty bij HIV-geïnfecteerde individuen. Identificatie van Frail patiënten is de eerste stap naar Verbetering en omkering van Frailty

We demonstreren: (1) procedures voor het verzamelen van speekselmonsters bij cognitief beperkte oudere volwassenen door familieleden in de thuisomgeving, (2) procedures voor het meten van stressactiviteit via speeksel cortisol en alfa-amylase, en (3) representatieve profielen. Protocollen die het mogelijk maken voor onderzoekers om stress-gerelateerde processen te bestuderen, bevorderen ons begrip van biologische gevoeligheid en vatbaarheid.

Het verzamelen van speeksel en meten cortisol en Alpha-amylase in Frail Gemeenschap wonende ouderen via mantelzorgers

Leer een fenotyperingsregime voor genetisch gemodificeerde muizen om gedrags- en neurologische defecten te identificeren. Deze methode gebruikt de Hind Limb Test en gripsterktetests voor initiële beoordelingen.

Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study (Video) | JoVE Journal

Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study

Meer video's verkennen