Name: Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer grote DNA-moleculen visualiseren met fluorescerende eiwit-DNA-bindende peptiden op gemodificeerde glasoppervlakken. Deze microfluidische methode maakt real-time analyse van DNA-dynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Sogang University Research Grant van 201410036.

1. DNA Biotinylatie <ol><li> Biotinylering van stompe uiteinden DNA met behulp van Terminal transferase (TdT) Opmerking: Gebruik T4 DNA (166 kbp), dat een stomp eindigende DNA. <ol><li> Voeg 5 ul van 2,5 mM CoCl2, 5 pi 10 x reactiebuffer, 0,5 pi 10 mM biotine-11-dUTP, 0,5 gl terminale transferase (10 eenheden) en 0,5 pl T4 DNA (0,5 ug / ul) aan het reactiemengsel. Maak een eindvolume van 50 ul door toevoegen van 38,5 pl water. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: uitbreiding reactietijd kan dubbel-gebonden DNA werd verkregen, dat wil zeggen, het is mogelijk dat biotine gelabeld zijn aan beide uiteinden. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Houd de buis bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinylering van kleverige eindigende DNA gebruiken DNA Ligase Opmerking: Gebruik λ DNA (48,5 kbp), dat een klevende uiteinden DNA. &lt;ol&gt; <li> Voeg 1 pl T4 DNA ligase, 5 ui 10 x ligatiebuffer, 1 pl 25 ng / pl λ faag-DNA en voeg 43 ul water tot een eindvolume van 50 pl te maken. </li><li> Houd de buis bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Gefunctionaliseerde Surface Derivatisering Opmerking:. Om een uiteinde van een DNA-molecuul op glasoppervlakte tether, is een primaire aminegroep gesilaniseerd op een dekglaasje gevolgd door biotine-PEG bekleding zoals weergegeven in figuur 1 Dit PEGylatie is van belang voor het individuele molecuul DNA beeldvorming omdat het kan aanzienlijk verminderen willekeurige ruis door aanhechting van ongewenste moleculen op het oppervlak. <ol><li> Piranha Cleaning Opmerking: Piranha oplossingen reageren heftig met organische materialen, dus het moet met zorg worden behandeld, volgens de juiste richtlijnen voor veiligheid. <ol><li> Plaats coverslips op een polytetrafluorethyleen (PTFE) rack, en houd ze by PTFE Draaddichtend tape lengte, helft aan de rand van de oppervlakken en de helft op het rek. Na het verpakken, laat een lang stuk (~ 5 cm) van de tape voor de behandeling van het rek tijdens de reiniging. </li><li> Vul een 1 L glazen beker met 350 ml H 2 SO 4 en 150 ml H 2 O 2 tot piranha oplossing in een zuurkast maken. Plaats het rek piranha-oplossing gedurende 2 uur. </li><li> Lege piranha oplossing uit de beker, en spoel dekglaasjes grondig met gedemineraliseerd water totdat de pH van het water in de beker bereikt neutraal. Gebruik pH-papier stroken. </li><li> Ultrasone trillingen de rekken van de dekglaasjes in de beker met water, gedurende 30 minuten. Lege water uit de beker net voor amino silaneren. Gebruik 75 W van sonicatie vermogen te reinigen en te derivatiseren de glassubstraten. </li></ol></li><li> Aminosilanization op glasoppervlakte <ol><li> Voeg 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethyleendiamine en 10 ml ijsazijn en 200 mlmethylalcohol in een schone polypropyleen houder voor het bereiden van de aminosilanization oplossing. </li><li> Plaats gereinigd dekglaasjes in de polypropyleen container. Schud ze bij 100 rpm en kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Ultrasone trillingen het bekerglas met gederivatiseerde dekglaasjes gedurende 15 minuten bij 75 W. Schud ze op 100 rpm en kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min. </li><li> Leeg de uit de beker, en spoel dekglaasjes voorzichtig, eenmaal met methanol en tweemaal met ethanol. Store dekglaasjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken. </li></ol></li><li> PEGylatie van het dekglaasje <ol><li> Voeg 10 ml 0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3). Filtreer de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter. </li><li> Los 2 mg biotine-PEG-succinimidyl carbonaat (biotine-PEG-SC) en 80 mg PEG-succinimidyl valeraat (mPEG-SVG) in 350 pl van NaHCO3. Gebruik een lichte bescherming buis. </li><li> Vortex de buis krachtig gedurende 10 sec, en centrifuge het op 10.000 xg gedurende 1 min te bellen te verwijderen. </li><li> Spoel een glasplaatje met aceton, gevolgd door spoelen met ethylalcohol. Laat de schuif aan de lucht volledig drogen. </li><li> Een druppel (50 pl) van PEG-oplossing op de schone glasplaatje. Bedek de druppel voorzichtig af met een amino-gesilaniseerd dekglaasje, zonder dat dit tot enige bubbels. </li><li> Plaats dia&#39;s voor 3 uur &#39;s nachts in een donkere, goed genivelleerd vochtige kamer bij kamertemperatuur. Gebruik een lege pipet tip houder als de kamer, met water op de bodem. Seal resterende PEG-oplossing in de buis en houd het bij 4 ° C. </li><li> Spoel de gePEGyleerde dekglaasje grondig met gedemineraliseerd water. Bewaar het in een donkere en droge plaats tot gebruik. </li></ol></li></ol> 3. Het assembleren van een Flow Kamer <ol><li> Fabriceren een geperforeerd acryl houder, zoals in figuur 2. Controleer of de diameter van de buis insert is 0,762 mm, en wijst een gat is een inlaat en de andereeen uitlaat (figuur 2). </li><li> Plaats dubbelzijdige plakband strips (breedte 5-6 mm) op acryl houder (figuur 2), en lijn loodrecht op een inlaat- en uitlaatopening, geen storende elk kanaal gaten. Gebruik deze tape strips als multi-channel muren om kamers te maken. Schrob de tape met behulp van een pipet tip. </li><li> Plaats een gePEGyleerde dekglaasje op de bovenkant om stroom kamers te maken, met de gePEGyleerde zijde omlaag. </li><li> Om te voorkomen dat elke oplossing lekken, drukt u op de top van een dekglaasje over het gebied waar de dubbelzijdige tapes worden geplaatst. Add sneldrogende epoxylijm aan de randen van de kamer bovenaan en onderaan (gele kleur in figuur 2) afsluiten. </li><li> Sluit een kort stukje (2,5 cm) van de buis (buitendiameter, OD, 0,042 &quot;) om een ​​gasdichte spuit en sluit de verbinding met epoxy lijm. </li><li> Sluit een lange flexibele buis (OD: 0,03 &quot;) om de slang verbonden met de spuit en sluit de verbinding met epoxylijm. </li><li> Vul het Tubing verbonden met de spuit met DI water. Zorg ervoor dat er geen luchtbel. </li><li> Plaats de buis in het gat van de stromingskamer afgedicht met epoxylijm. </li><li> Plaats gele punt (200 pl tip) anderzijds hole als reservoir. </li></ol> 4. Sample laden in Flow Kamer Opmerking: neutravidine kan worden vervangen door andere eiwitten zoals avidine streptavidine. Alle reacties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij vermeld. Neem het monster oplossing in een gele tip, en installeer de tip met de oplossing op het gat van acryl houder (Figuur 2b). <ol><li> Stel het debiet van de inspuitpomp 50 pl / min. Load 20 ul avidine-eiwit (25 ug / ml in T50-oplossing, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8) en houdt deze gedurende 10 min. </li><li> Belasting 20 pi van gebiotinyleerd oligodeoxynucleotiden (100 micrometer op 1 × TE), en houd het voor 10 min. Als klem transferase wordt gebruikt, slaat u de laad-van oligodeoxynucleotiden. </li><li> Belasting 20 pl DNA-oplossing van stap 1 in de stroom kamer bij een stroomsnelheid van 10 pl / min en houdt deze gedurende 30 min. </li><li> Was de stroom kamer met 1 x TE, en de belasting 40 pi van FP-DBP 10 (~ 80 nm). </li><li> Observeer DNA onder een fluorescentiemicroscoop met een continue stroom van kleuring moleculen in 1 × TE op een 60X objectief. Gebruik 488 nm solid state laser voor excitatie van FP (eGFP) -DBP. Voor volledige stuk DNA moleculen hanteren verschillende stroomsnelheden volgens de DNA lengtes gebruikt. Breng bijvoorbeeld 50 pl / min gedurende 48,5 kbp van λ DNA, en 100 pl / min gedurende 166 kbp van T4 DNA. <ol><li> Voor de recycling van de acryl houder, genieten gemonteerd stroom kamers in een huishouden reinigingsmiddel 12. Verwijder tapes en epoxy met een scheermesje en wrijf met de handen om ze volledig uit te schakelen. Ontstoppen gaten met injectienaalden. Houd de houders in gedemineraliseerd water tot verder gebruik. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een platform voor het visualiseren van lange DNA-moleculen gebiotinyleerd voor het verankeren op oppervlakken. We hebben een aanpak voor het DNA-moleculen gebonden aan een avidine eiwit gecoate oppervlak met gebiotinyleerd runderserumalbumine. 6 In de eerdere benadering gemeld, vonden we een cruciale kwestie van DNA foto-splitsing veroorzaakt door bis-intercalatie kleurstoffen die DNA-moleculen vlekken vastgebonden op de oppervlak. Aangezien deze voortdurend opgewonden fluoroforen hebben e...

Visualisatie van grote DNA-moleculen gebonden op glas of kraal oppervlakken is gebruikt voor het onderzoeken van DNA-eiwit interacties, eiwit dynamica van DNA-substraat, 1,2 en polymeerfysica. 3,4 Een platform voor single-tethered grote DNA-moleculen heeft een paar verschillende voordelen ten opzichte van andere DNA immobilisatie werkwijzen. 5 Ten eerste, een groot DNA-molecuul gebonden aan het oppervlak een natuurlijke willekeurige coil conformatie zonder shear flow die cruciaal voor een DNA bindend eiwit aan zijn bindingsplaats herkennen. Ten tweede is het zeer gemakkelijk om de chemische omgeving rond DNA moleculen veranderen van een reeks enzymatische reacties in een stromingskamer. Ten derde, een microfluïde afschuifstroming induceert DNA moleculaire uitstrekt tot 100% van de volledige contour lengte, die zeer moeilijk te bereiken alternatieve DNA elongatie zal zoals oppervlakte immobilisatie 6 en nanokanaal opsluiting. 7 Een volledig stretched DNA molecuul ook positie-informatie voor de controle enzymatische bewegingen op de genomische kaart kan zijn. Toch is de DNA-tethering aanpak heeft een kritische tekortkoming in de intercalerende kleurstof zoals YOYO-1 in het algemeen veroorzaakt tethered DNA-moleculen gemakkelijk om gebroken te worden door middel van fluorescentie excitatie licht. In het algemeen grote DNA moleculen te worden gemerkt met een fluorescente kleurstof voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop. Daartoe YOYO-1 of andere TOTO series kleurstoffen worden vooral omdat deze kleurstoffen alleen fluoresceren wanneer ze dubbelstrengs DNA intercaleren. 8 is echter bekend dat bis-intercalerende kleurstof veroorzaakt licht geïnduceerde DNA foto-splitsing omdat intercalatie van de fluoroforen. 9 verder fluorescerend gekleurd DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak zijn kwetsbaarder omdat shear flows uitoefenen brekende krachten op vrij bewegen DNA moleculen. Daarom hebben wij FP-DBP als nieuw DNA-eiwit kleuring kleurstof voor het afbeelden van grote DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak. Het voordeel van FP-DBP is dat het geen foto-splitsing van de DNA-moleculen waaraan het bindt veroorzaakt. 10 Bovendien FP-DBP niet de contour lengte van DNA verhogen, terwijl bis-intercalerende kleurstoffen verhogen de contourlengte ongeveer 33%. Deze video methode introduceert de experimentele aanpak voor tethering grote DNA-moleculen aan een PEG-biotine oppervlak. Figuur 1 toont verschillende benaderingen van aanbinden DNA met stompe uiteinden en sticky ends. Aldus kan deze kleuring worden toegepast op elk soort DNA-molecuul. Figuur 2 toont een schematische weergave van de stromingskamer samenstelling die kan worden gecontroleerd door een spuitpomp om dwarskracht stromen DNA-moleculen strekken en chemische en enzym plaatsen genereren oplossingen. Figuur 3 toont microfoto van volledig gestrekt DNA-moleculen gebonden aan het PEGylated oppervlak 11 en gekleurd met FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. DNA Biotinylering</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotinylering van blunt-end DNA met behulp van Terminal Transferase (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Wordt geleverd met 10x reactiebuffer, 2,5 mM kobaltchloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is ook beschikbaar</td></tr><tr><td>T4GT7 Fag DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleen-diaminetetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotinylering van sticky end DNA met behulp van DNA Ligase</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Wordt geleverd met 10x reactiebuffer</td></tr><tr><td>Lambda Fag DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Ook beschikbaar bij New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">2. Functionele oppervlaktederivatisatie</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha-reiniging</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Dikte</td></tr><tr><td>Teflon rek</td><td></td><td></td><td>Aangepaste fabricage</td></tr><tr><td>PTFE draadverbindingstape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&trade; tape</td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, 95% Zuiverheid</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Tafel-ultrasoonreiniger</td></tr><tr><td colspan="4">2.2) Aminosilanisering op glasoppervlak</td></tr><tr><td>N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethyleendiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glazuur Azijnzuur</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Zuiverheid</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99,9% Zuiverheid</td></tr><tr><td>Polypropyleen Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9% Zuiverheid</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) PEGylering van het dekglas</td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Zuiverheid</td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">3. Het samenstellen van een flowkamer</td></tr><tr><td>Acrylic Ondersteuning</td><td></td><td></td><td>Aangepaste fabricage</td></tr><tr><td>Dubbelzijdig Plakband</td><td>3M</td><td></td><td>Transparant type</td></tr><tr><td>Sneldrogende epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buis</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gasdicht 250 &micro;l Spuit</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Bemonstering laden in de flowkamer</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van surface aangebonden grote dna moleculen met een fluorescent protein dna binding peptide

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Grote DNA-moleculen verankerd op het functionele glazen oppervlak zijn gebruikt in polymeerfysica en biochemie, met name voor het onderzoeken van interacties tussen DNA en zijn bindende eiwitten. Hier beschrijven we een methode die fluorescentiemicroscopie gebruikt voor het visualiseren van grote DNA-moleculen verankerd op het oppervlak. Ten eerste worden glazen dekglasjes gebiotinileerd en gepassiveerd door bedekking met gebiotinileerd polyethyleenglycol, dat specifiek gebiotinileerd DNA bindt via avidine-eiwitlinkers en ongewenst binden van niet-specifieke interacties van eiwitten of DNA-moleculen op het oppervlak aanzienlijk vermindert. Ten tweede worden de DNA-moleculen gebiotinileerd door twee verschillende methoden, afhankelijk van hun terminalen. Het bot eindigende DNA wordt getagd met gebiotinileerd dUTP op zijn 3' hydroxyl-terminus, door terminale transferase, terwijl het kleverige eindigende DNA wordt gehybridiseerd met gebiotinileerde complementaire oligonucleotiden door DNA-ligase. Ten slotte zorgt een microfluïdische schuifstroom ervoor dat enkele DNA-moleculen zich uitstrekken tot hun volledige contourlengte nadat ze zijn gekleurd met een fluorescente eiwit-DNA-bindend peptide (FP-DBP).

Figuur 1 toont twee verschillende DNA tethering methoden afhankelijk terminale structuur van het DNA-molecuul. Figuur 1a toont hoe de kleverige eindigende DNA moleculen worden gehybridiseerd met complementaire gebiotinyleerde oligonucleotiden, die worden geïmmobiliseerd op de met avidine beklede PEG oppervlak. Figuur 1b toont de toevoeging van gebiotinyleerd ddNTP en dNTP om de 3-hydroxylgroep van een stomp eindigende DNA door terminale ...

We presenteren een benadering voor het visualiseren van fluorescente eiwit-DNA-bindend peptide (FP-DBP)-gekleurde grote DNA-moleculen die verankerd zijn op het polyethyleenglycol (PEG) en avidine-gecoate glasoppervlak en gestrekt zijn met microfluïdische afschuiwingsstromingen.

Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Het uiteindelijke doel van deze procedure is het creëren van een handig DNA-analysesysteem voor een epifluorescentiemicroscoop, om enkelvoudige DNA-moleculen op gemodificeerde glasoppervlakken te manipuleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van DNA-visualisatie, bij het onderzoeken van DNA zelf, alsook DNA-bindende eiwitten en andere kleine moleculen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bewegend DNA eenvoudig waar te nemen en te analyseren. Plaats ter beginnning glazen dekglasjes op een PTFE-rek en zet deze vast met een stuk PTFE-afdichtingsband. Laat na het omwikkelen van de dekglasjes een stuk tape van vijf centimeter lang uitsteken, zodat het rek tijdens de reinigingsprocedure gemakkelijk kan worden gehanteerd.Combineer in een zuurkast 350 milliliter zwavelzuur en 150 milliliter waterstofperoxide in een glazen bekerglas van één liter om een piranha-etsoplossing te maken. Plaats vervolgens het rek met dekglasjes in de oplossing. Leeg na twee uur het bekerglas en spoel de dekglasjes grondig af met gedeïoniseerd water.Spoel de dekglasjes door tot de pH van het water in het bekerglas een neutrale pH bereikt. Sonicate vervolgens de rekjes met dekglasjes gedurende 30 minuten in een bekerglas met water om de glazen substraten te reinigen en te derivatiseren. Giet het water uit het bekerglas vlak voor de aminosilanisering. Bereid ter introductie de aminosilaniseringsoplossing door twee milliliters alkoxysilaan en 10 milliliters glaciaal azijnzuur toe te voegen aan 200 milliliters methylalcohol in een schone, polypropyleen houder.Plaats vervolgens de schone dekglasjes in de oplossing. Plaats daarna de gereinigde dekglasjes in de bereide oplossing en schud deze 30 minuten bij kamertemperatuur en 100 rpm. Sonicate vervolgens de container met de gederivatiseerde dekglasjes gedurende 15 minuten bij 75 watt.Schud ze vervolgens opnieuw bij kamertemperatuur en 100 rpm gedurende ten minste 30 minuten. Giet na afloop de oplossing uit de beker en spoel de dekglasjes voorzichtig drie keer af: eenmaal met methylalcohol en tweemaal met ethylalcohol.Bewaar na de laatste spoeling de dekglasjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken. Maak eerst 10 milliliters van een 0,1 molaire natriumbicarbonaatoplossing en filter deze door een 0,22 micron spuitfilter. Los vervolgens twee milligrams biotin PEG succinimidylcarbonaat en 80 milligrams PEG succinimidylvaleraat op in 350 micro liters van de gefilterde natriumbicarbonaatoplossing.Bescherm de oplossing tegen licht met behulp van een lichtbeschermende buis. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden en centrifugeer deze vervolgens 1 minuut op 10.000 x g om eventuele luchtbellen te verwijderen. Spoel daarna een glazen objectglas eerst met aceton en vervolgens met ethylalcohol.Laat het objectglas na het afspoelen volledig aan de lucht drogen. Plaats een druppel van 50 µL van de PEG-oplossing op het schone objectglas. Laat een amino-gesilaniseerd dekglas langzaam onder een kleine hoek op de druppel zakken, zodat er geen luchtbellen onder het dekglas ontstaan.Plaats de objectglazen vervolgens gedurende ten minste drie uur tot overnight, bij kamertemperatuur, in een vlakke, donkere en bevochtigde kamer. Sluit na afloop de resterende PEG-oplossing af in de lichtbeschermende buis en bewaar deze bij vier graden Celsius. Spoel de PEG-gefunctionaliseerde dekglasjes na de incubatie grondig af met gedeïoniseerd water en bewaar ze vervolgens op een donkere en droge plaats tot gebruik.Om de stroomkamer te creëren, plaatst u strips dubbelzijdige plakband op een acrylhouder, zodanig dat deze loodrecht op de in- en uitlaatgaten zijn uitgelijnd en geen van de kanaalgaten blokkeren. Wrijf vervolgens met een pipetpunt over het plakband om de kanalen af te dichten. Plaats daarna een PEGyleerd dekglas, met de PEGyleerde zijde naar beneden, bovenop het plakband om de stroomkamers te vormen.Om te voorkomen dat er een oplossing lekt, wordt de bovenkant van een dekglas over het gebied waar de dubbelzijdige tape is geplaatst, aangedrukt. Voeg vervolgens een sneldrogende epoxylijm toe aan de randen van de kamers om deze op hun plaats te fixeren. Verbind daarna een 2,5 centimeter lang stuk slang met eenten gastichte spuit en dicht de verbinding af met epoxylijm.Sluit vervolgens een lange, flexibele slang aan op de slang die uit de spuit komt. Afdichten van de verbinding met epoxylijm. Vul de slang die aan de spuit is gekoppeld met gedeïoniseerd water en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Plaats vervolgens de slang in de opening van de stroomkamer die is afgedicht met epoxylijm. Plaats een pipetpunt van 200 µL op de andere opening om als reservoir te dienen. Stel de stroomsnelheid van een spuitpomp in op 50 µL per minuut.Stroom vervolgens 20 µL van een avidine-proteïneloplossing in de kamer en laat dit 10 minuten inwerken. Laad daarna 20 µL gebiotineerde oligo-deoxynucleotiden in een spuit. Stroom dit in de kamer en laat dit 10 minuten inwerken.Als er een terminale transferase wordt gebruikt, kan het laden van oligo deoxy-nucleotiden worden overgeslagen. Vul vervolgens een spuit met 20 microliters DNA-oplossing, laat dit met een snelheid van 10 microliters per minuut in de kamer stromen en laat dit 30 minuten inwerken. Was na de incubatie van 30 minuten de doorstroomkamer met 40 microliters 1X TE-buffer bij een snelheid van 50 microliters per minuut.Nadat het gewassen is, vult u de kamer met 40 µL van hetzelfde FP-DBP bij een concentratie van 80 nM in 1X TE. Pas verschillende stroomsnelheden toe op basis van de gebruikte DNA-lengtes om het volledige strekbereik van de DNA-moleculen te zien. Observeer het DNA onder een 60X objectief met een fluorescentiemicroscoop. Hieronder volgt een video van een fluorescentiemicroscoop die bacteriofaag lambda DNA-moleculen toont, die aan het oppervlak zijn gebonden en door de stroming worden uitgerekt na ligatie met gebiotineerde complementaire oligonucleotiden.Onder stroming hebben de volledig uitgerekte DNA-moleculen een lengte van 16,5 micron. In tegenstelling hiermee worden de bacteriofaag T4 DNA-moleculen onder stroming uitgerekt tot een lengte van 56,4 micron. Deze elongatie is reversibel, waardoor het DNA meerdere keren kan worden uitgerekt en ontspannen.Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u FP-DBP kunt gebruiken bij uitgebreide DNA-analyse, evenals het kunnen aantonen van de rek en ontspanning van een DNA-polymeer.

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een nieuwe en krachtige integratie van nanofotonica (QD-FRET) en microfluidics tot de vorming van polyelektrolyt polyplexes, die naar verwachting een betere controle en de synthese van een uniforme en aanpasbare polyplexes voor toekomstige op nucleïnezuur gebaseerde therapieën te onderzoeken.

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

This video describes a method to visualize the assembly of fusion protein condensates on DNA molecules at specific loci using single-molecule imaging. These condensates are formed due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, which allow for the recruitment of RNA polymerase II and enhanced gene transcription.

Single-Molecule Imaging to Visualize Fusion Protein Condensates Assembly on DNA Curtains

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Een single-molecuul magnetische pincet platform te manipuleren van de G-quadruplexes is gemeld, waardoor voor de studie van G4 stabiliteit en verordening door verschillende eiwitten.

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

Leer grote DNA-moleculen visualiseren met fluorescerende eiwit-DNA-bindende peptiden op gemodificeerde glasoppervlakken. Deze microfluidische methode maakt real-time analyse van DNA-dynamica mogelijk.

Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Meer video's verkennen