Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Het uiteindelijke doel van deze procedure is het creëren van een handig DNA-analysesysteem voor een epifluorescentiemicroscoop, om enkelvoudige DNA-moleculen op gemodificeerde glasoppervlakken te manipuleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van DNA-visualisatie, bij het onderzoeken van DNA zelf, alsook DNA-bindende eiwitten en andere kleine moleculen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bewegend DNA eenvoudig waar te nemen en te analyseren. Plaats ter beginnning glazen dekglasjes op een PTFE-rek en zet deze vast met een stuk PTFE-afdichtingsband. Laat na het omwikkelen van de dekglasjes een stuk tape van vijf centimeter lang uitsteken, zodat het rek tijdens de reinigingsprocedure gemakkelijk kan worden gehanteerd.

Combineer in een zuurkast 350 milliliter zwavelzuur en 150 milliliter waterstofperoxide in een glazen bekerglas van één liter om een piranha-etsoplossing te maken. Plaats vervolgens het rek met dekglasjes in de oplossing. Leeg na twee uur het bekerglas en spoel de dekglasjes grondig af met gedeïoniseerd water.

Spoel de dekglasjes door tot de pH van het water in het bekerglas een neutrale pH bereikt. Sonicate vervolgens de rekjes met dekglasjes gedurende 30 minuten in een bekerglas met water om de glazen substraten te reinigen en te derivatiseren. Giet het water uit het bekerglas vlak voor de aminosilanisering. Bereid ter introductie de aminosilaniseringsoplossing door twee milliliters alkoxysilaan en 10 milliliters glaciaal azijnzuur toe te voegen aan 200 milliliters methylalcohol in een schone, polypropyleen houder.

Plaats vervolgens de schone dekglasjes in de oplossing. Plaats daarna de gereinigde dekglasjes in de bereide oplossing en schud deze 30 minuten bij kamertemperatuur en 100 rpm. Sonicate vervolgens de container met de gederivatiseerde dekglasjes gedurende 15 minuten bij 75 watt.

Schud ze vervolgens opnieuw bij kamertemperatuur en 100 rpm gedurende ten minste 30 minuten. Giet na afloop de oplossing uit de beker en spoel de dekglasjes voorzichtig drie keer af: eenmaal met methylalcohol en tweemaal met ethylalcohol.

Bewaar na de laatste spoeling de dekglasjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken. Maak eerst 10 milliliters van een 0,1 molaire natriumbicarbonaatoplossing en filter deze door een 0,22 micron spuitfilter. Los vervolgens twee milligrams biotin PEG succinimidylcarbonaat en 80 milligrams PEG succinimidylvaleraat op in 350 micro liters van de gefilterde natriumbicarbonaatoplossing.

Bescherm de oplossing tegen licht met behulp van een lichtbeschermende buis. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden en centrifugeer deze vervolgens 1 minuut op 10.000 x g om eventuele luchtbellen te verwijderen. Spoel daarna een glazen objectglas eerst met aceton en vervolgens met ethylalcohol.

Laat het objectglas na het afspoelen volledig aan de lucht drogen. Plaats een druppel van 50 µL van de PEG-oplossing op het schone objectglas. Laat een amino-gesilaniseerd dekglas langzaam onder een kleine hoek op de druppel zakken, zodat er geen luchtbellen onder het dekglas ontstaan.

Plaats de objectglazen vervolgens gedurende ten minste drie uur tot overnight, bij kamertemperatuur, in een vlakke, donkere en bevochtigde kamer. Sluit na afloop de resterende PEG-oplossing af in de lichtbeschermende buis en bewaar deze bij vier graden Celsius. Spoel de PEG-gefunctionaliseerde dekglasjes na de incubatie grondig af met gedeïoniseerd water en bewaar ze vervolgens op een donkere en droge plaats tot gebruik.

Om de stroomkamer te creëren, plaatst u strips dubbelzijdige plakband op een acrylhouder, zodanig dat deze loodrecht op de in- en uitlaatgaten zijn uitgelijnd en geen van de kanaalgaten blokkeren. Wrijf vervolgens met een pipetpunt over het plakband om de kanalen af te dichten. Plaats daarna een PEGyleerd dekglas, met de PEGyleerde zijde naar beneden, bovenop het plakband om de stroomkamers te vormen.

Om te voorkomen dat er een oplossing lekt, wordt de bovenkant van een dekglas over het gebied waar de dubbelzijdige tape is geplaatst, aangedrukt. Voeg vervolgens een sneldrogende epoxylijm toe aan de randen van de kamers om deze op hun plaats te fixeren. Verbind daarna een 2,5 centimeter lang stuk slang met eenten gastichte spuit en dicht de verbinding af met epoxylijm.

Sluit vervolgens een lange, flexibele slang aan op de slang die uit de spuit komt. Afdichten van de verbinding met epoxylijm. Vul de slang die aan de spuit is gekoppeld met gedeïoniseerd water en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Plaats vervolgens de slang in de opening van de stroomkamer die is afgedicht met epoxylijm. Plaats een pipetpunt van 200 µL op de andere opening om als reservoir te dienen. Stel de stroomsnelheid van een spuitpomp in op 50 µL per minuut.

Stroom vervolgens 20 µL van een avidine-proteïneloplossing in de kamer en laat dit 10 minuten inwerken. Laad daarna 20 µL gebiotineerde oligo-deoxynucleotiden in een spuit. Stroom dit in de kamer en laat dit 10 minuten inwerken.

Als er een terminale transferase wordt gebruikt, kan het laden van oligo deoxy-nucleotiden worden overgeslagen. Vul vervolgens een spuit met 20 microliters DNA-oplossing, laat dit met een snelheid van 10 microliters per minuut in de kamer stromen en laat dit 30 minuten inwerken. Was na de incubatie van 30 minuten de doorstroomkamer met 40 microliters 1X TE-buffer bij een snelheid van 50 microliters per minuut.

Nadat het gewassen is, vult u de kamer met 40 µL van hetzelfde FP-DBP bij een concentratie van 80 nM in 1X TE. Pas verschillende stroomsnelheden toe op basis van de gebruikte DNA-lengtes om het volledige strekbereik van de DNA-moleculen te zien. Observeer het DNA onder een 60X objectief met een fluorescentiemicroscoop. Hieronder volgt een video van een fluorescentiemicroscoop die bacteriofaag lambda DNA-moleculen toont, die aan het oppervlak zijn gebonden en door de stroming worden uitgerekt na ligatie met gebiotineerde complementaire oligonucleotiden.

Onder stroming hebben de volledig uitgerekte DNA-moleculen een lengte van 16,5 micron. In tegenstelling hiermee worden de bacteriofaag T4 DNA-moleculen onder stroming uitgerekt tot een lengte van 56,4 micron. Deze elongatie is reversibel, waardoor het DNA meerdere keren kan worden uitgerekt en ontspannen.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u FP-DBP kunt gebruiken bij uitgebreide DNA-analyse, evenals het kunnen aantonen van de rek en ontspanning van een DNA-polymeer.