Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Het algemene doel van deze procedure is om een handig DNA-analysesysteem te maken voor een epifluorescente microscoop, om een enkel DNA-molecuul op gemodificeerde glazen oppervlakken te manipuleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van DNA-visualisatie. Bij het onderzoeken van DNA zelf, evenals DNA-bindende eiwitten en andere kleine moleculen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bewegend DNA gemakkelijk te observeren en analyseren. Om te beginnen, plaats glazen dekjes op een PTFE-rek en zet ze op hun plaats met behulp van een stuk PTFE draadverzegelde tape. Laat na het omwikkelen een stuk van vijf centimeter lang van de tape over om het rek te hanteren tijdens de reinigingsprocedure.

Combineer in een afzuigkap 350 milliliter zwavelzuur en 150 milliliter waterstofperoxide in een glazen beker van één liter om een piranha-etsoplossing te maken. Plaats vervolgens het rek met dekjes in de oplossing. Na twee uur, leeg de beker en spoel de dekjes grondig af met gedeïoniseerd water.

Ga door met het spoelen van de dekjes totdat de PH van het water in de beker een neutrale PH bereikt. Daarna, soniceer de rekken met dekjes in een beker met water gedurende 30 minuten om de glazen substraten te reinigen en te deriveren. Leeg het water uit de beker, net voordat je begint met aminosilanisatie. Om te beginnen, bereid je de aminosilanisatie-oplossing voor door twee milliliter alkoxysilaan en 10 milliliter ijzerazijn toe te voegen aan 200 milliliter methylalcohol in een schone, polypropyleen container.

Gevolgd door het plaatsen van de schone dekjes in de oplossing. Plaats vervolgens de gereinigde dekjes in de bereide oplossing en schud ze bij kamertemperatuur en 100 tpm gedurende 30 minuten. Soniceer vervolgens de container met de gederivatiseerde dekjes gedurende 15 minuten bij 75 watt.

Schud ze vervolgens opnieuw bij kamertemperatuur en 100 tpm gedurende minimaal 30 minuten. Zodra je klaar bent, leeg de oplossing uit de beker en spoel de dekjes drie keer voorzichtig af, één keer met methylalcohol en twee keer met ethylalcohol.

Na de laatste spoeling, bewaar de dekjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken. Maak eerst 10 milliliter van een 0,1 molare natriumbicarbonaat-oplossing en filter deze door een 0,22 micron spuitfilter. Los vervolgens twee milligram biotin PEG succinimidyl carbonaat en 80 milligram PEG succinimidyl valeraat op in 350 microliters van de gefilterde natriumbicarbonaat-oplossing.

Bescherm de oplossing tegen licht met een lichtbeschermingsbuis. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden en centrifugeer deze vervolgens gedurende één minuut bij 10.000 x g om eventuele luchtbellen te verwijderen. Spoel vervolgens een glazen plaat met aceton, gevolgd door ethylalcohol.

Laat de plaat na het spoelen volledig drogen. Plaats een druppel van 50 microliter van de PEG-oplossing op de schone, glazen plaat. Laat langzaam een amino-silanisatie dekje op een lichte hoek op de druppel zakken, zodat er geen luchtbellen onder het dekje ontstaan.

Plaats vervolgens de platen gedurende ten minste drie uur tot een nacht in een vlakke, donkere en bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Als je klaar bent, sluit je de resterende PEG-oplossing in de lichtbeschermingsbuis af en bewaar deze bij vier graden Celsius. Na incubatie, spoel je de PEGylerende dekjes grondig met gedeïoniseerd water en bewaar ze vervolgens op een donkere en droge plaats totdat ze worden gebruikt.

Om de flowkamer te maken, plaats dubbelzijdige, plakkerige tapestroken op een acryl houder, zodat deze loodrecht op de inlaat- en uitlaatgaten staat en geen van de kanaalgaten verstoort. Wrijf vervolgens over de tape met behulp van een pipettepunt om de kanalen af te sluiten. Plaats vervolgens een PEGylerende deksel, met de PEGylerende kant naar beneden, op de bovenkant van de tape om flowkamers te maken.

Om te voorkomen dat oplossing lekt, druk de bovenkant van een dekje op het gebied waar dubbelzijdige tape is geplaatst. Voeg vervolgens een sneldrogende epoxylijm toe aan de randen van de kamers om deze op hun plaats te bevestigen. Verbind vervolgens een 2,5 centimeter lang stuk slang met een gasdichte spuit en verzegel de verbinding met epoxylijm.

Verbind vervolgens een lange, flexibele buis met de slang die uit de spuit komt. En verzegel opnieuw de verbinding met epoxylijm. Vul de slang die aan de spuit is gekoppeld met gedeïoniseerd water, zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.

Plaats vervolgens de slang in het gat van de flowkamer dat is verzegeld met epoxylijm. En plaats een 200 microliter pipettepunt op het andere gat, om als reservoir te worden gebruikt. Stel de stroomsnelheid van een spuitpomp in op 50 microliter per minuut.

Stroom vervolgens 20 microliter van een avidine-eiwit oplossing in de kamer en laat het daar 10 minuten staan. Laad vervolgens 20 microliter gebiotineerde oligo deoxy nucleotiden in een spuit. Stroom het in de kamer en laat het daar 10 minuten staan.

Als een terminaal transferase wordt gebruikt, sla de lading van oligo deoxy nucleotiden over. Laad vervolgens 20 microliter van een DNA-oplossing in een spuit, stroom het in de kamer met een snelheid van 10 microliter per minuut en laat het daar 30 minuten staan. Na de 30 minuten incubatie, spoel je de flowkamer met 40 microliter van 1X TE-buffer bij 50 microliter per minuut.

Na het spoelen, laad je de kamer met 40 microliter van dezelfde FP-DBP met een concentratie van 80 nano-molar, in de 1X TE. Om het volledige rekbereik van DNA-moleculen te zien, pas je verschillende stroomsnelheden toe volgens de gebruikte DNA-lengtes. Observeer het DNA onder een 60X objectieflens, met behulp van een fluorescente microscoop. Hier is een video van een fluorescente microscoop die bacteriofaag lambda DNA-moleculen toont, verankerd aan het