Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Het algemene doel van dit protocol is om de algemene toepasbaarheid van de FRET-analyzer onder optimale omstandigheden aan te tonen door het suikergehalte van commercieel verkrijgbare dranken te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de detectie en monitoring van kleine moleculen, zoals suiker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt een vers signaal kan monitoren dat reageert op kleine moleculen zonder dat hiervoor dure, high-end fluorometers nodig zijn.

Dr. Han uit ons laboratorium zal de procedure demonstreren. Bereid eerst het maltose- of sucrose-specifieke cyaan- en geel fluorescerende biosensorplasmid voor. Inoculeer vervolgens vijf milliliter Luria-bouillon met een enkele kolonie DE3 E.Coli en incubeer de cultuur 16 uur lang bij 37 °C in een schudincubator.

Plaats vervolgens één milliliter van de cultuur in een kolf met 100 milliliters LB. Incubeer de kolf bij 37 degrees Celsius in een schudincubator tot de optische dichtheid bij 600 nanometers ongeveer 0,5 is. Centrifugeer de cultuur gedurende 20 minuten bij vier degrees Celsius. Resuspendeer de pellet snel in 50 milliliters ijskoud gedestilleerd water en centrifugeer opnieuw gedurende 20 minuten.

Resuspendeer de pellet in 50 µL van een oplossing van 10 volume procent glycerol en ijskoude gedestilleerde water. Zwenk het mengsel voorzichtig totdat de optische dichtheid bij 600 nm een waarde van 100 bereikt. Combineer het mengsel in een ijskoude electroporatiecuvet met 10 ng CMY-plasmide.

Elektroporeer het mengsel. Resuspendeer de cellen in de cuvet in 1 milliliter SOC-medium en breng ze vervolgens over naar een ronde bodembuis van 15 milliliter. Laat de cellen herstellen door ze gedurende één uur voorzichtig te schudden bij 37 °C.

Uitplaten de cellen op een LB-agarplaat met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de cellen 12 uur lang bij 37 °C. Draag met een entlus een enkele kolonie over naar 10 mL LB bevattend 100 µg/mL ampicilline.

Incubeer het mengsel 12 uur lang bij 37 °C onder schudding om de startcultuur aan te maken. Draag vijf milliliter van de startcultuur over naar 500 milliliter LB met ampicilline en incubeer de cellen bij 37 °C in een schudincubator. Zodra de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,5 bereikt, voegt u IPTG toe om een eindconcentratie van 0,5 millimolair te verkrijgen.

Na het incuberen van de cultuur gedurende 24 uur, worden de cellen 20 minuten gecentrifugeerd. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in vijf milliliter bindingsbuffer. Sonicate de cellen op ijs gedurende 10 seconden en koel de cellen vervolgens 10 seconden af.

Herhaal de sonicatie en het koelen nog vijf keer. Centrifugeer het lysaat gedurende 30 minuten. Breng het supernatant over naar een andere opvangbuis.

Zuiver het supernatant op een nikkel-NTA-affiniteitskolom. Vul een 10.000 milliwatt concentrator met 20 milliliters van het gezuiverde monster. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten en vul de concentrator vervolgens opnieuw met 0,8% fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Herhaal dit proces op deze manier met de rest van het monster, 20 milliliters per keer, totdat alle proteïne is geconcentreerd en ontzout. Bewaar de gezuiverde FRET-biosensor bij 80 graden Celsius. Bereid een 0,2 micromolair oplossing van CMY-biosensorproteïne en 0,8% PBS als detectieoplossing.

Zet een handzame FRET-analyser aan. Stel de analysetemperatuur in op 53 °C. Zet het instrument vervolgens in de kalibratiemodus.

Vul een cuvet met 0,8% PBS als achtergrond. Verwarm het monster voor tot 53 graden Celsius in de analyzer en stel vervolgens de achtergrond in. Vul daarna een cuvet met detectie-oplossing.

Plaats de cuvet in de analyzer en stel de nullijn in. Vervang de cuvet door een cuvet met detectieoplossing en één millimol suiker. Stel de intensiteit bij verzadiging in om de kalibratie te voltooien.

Om te beginnen met de voorbereiding van een drankmonster voor de analyse van het suikergehalte, centrifugeert u één milliliter van de drank in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Verwijder het supernatant met een injectiespuit van één milliliter en filtreer het supernatant door een spuitfilter van 0,2 micrometer. Meng 0,1 milliliter filtraat en 0,9 milliliter 0,8% PBS in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Vortex het mengsel voorzichtig om volledige verdunning te garanderen. Breng vijf µL van het verdunde drankmonster en 495 µL detectie-oplossing aan in een cuvet. Plaats de cuvet in de analyzer en verwarm het monster voor tot 53 °C.

Druk op de set-knop om het suikergehalte van het monster te meten. Bij deze methode wordt de FRET-efficiëntie gemeten aan de hand van de verhouding tussen de emissie-intensiteit van het geel fluorescerende eiwit en het cyaan fluorescerende eiwit in de biosensor. De optimale meettemperatuur voor deze CMY-biosensoren ligt tussen 50 en 55 °C, aangezien het verschil in de emissie-intensiteitsverhouding tussen een controleoplossing en een verzadigde maltoseoplossing dan het grootst is.

De CMY-BII biosensor werd gebruikt om het maltosegehalte van drie dranken bij 53 °C te evalueren. Een dosis-responscurve wordt gegenereerd door deze ratio te bepalen bij verschillende maltoseconcentraties bij een gegeven temperatuur. De emissieratio wordt gerelateerd aan de maltoseconcentratie met behulp van de waarden die tijdens de kalibratie zijn verkregen.

De gemeten maltosegehaltes worden weergegeven samen met de totale suikergehaltes zoals gerapporteerd door de drankfabrikanten. Drank A bevatte maltosebronnen zoals rijst en gerst. Overeenkomstig hiermee vertegenwoordigt de waargenomen hoeveelheid maltose ongeveer de helft van het totale gerapporteerde suikergehalte.

Drank C, een sportdrank, had een zeer laag maltosegehalte. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het apparaat en de FRET-sensoren tussen 50 en 55 °C moeten worden bediend. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dergelijke kleine moleculen gekwantificeerd kunnen worden met een op maat gemaakte handbediende FRET-analyzer.