Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

Het algemene doel van dit stapsgewijze protocol is om de abundantie van cortexfragmenten of reducerende suikers te kwantificeren tijdens de kieming van bacteriesporen. Deze methode zal de stappen beschrijven die nodig zijn om de aanwezigheid van cortexfragmenten of reducerende suikers tijdens de sporekieming te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de meeste laboratoria over de reagentia en apparatuur beschikken die nodig zijn om het protocol met succes te voltooien.

Begin deze procedure door een buis met Clostridium difficile-sporen in een verwarmingsblok te plaatsen en deze gedurende 30 minuten op 65 graden Celsius te incuberen. Na de incubatie, plaats de buis op ijs. De kiemoplossing is specifiek voor de soort bacteriespore die wordt bestudeerd.

Voor het testen van C.difficile sporekieming, gebruiken we een oplossing van 10 millimolair Tris bij pH 7,5 met 150 millimolair natriumchloride, 100 millimolair glycine en 10 millimolair taurocholzuur in gedeïoniseerd water. Bereid een milliliter kiemoplossing per monster plus een extra milliliter. Voordat u met de test begint, breng u een milliliter van de kiemoplossing over naar een microcentrifugebuis en zet deze opzij.

Dit zal dienen als een blanco voor cortexfragmentdetectie. Voeg vervolgens aan de kiemoplossing sporen toe tot een OD600 van ongeveer 3,0 en schud kort. Deze hoeveelheid sporen werkt goed voor het modereren van de afgifte van cortexfragmenten tijdens C.difficile sporekieming.

Onmiddellijk na het toevoegen van de sporen, verwijdert u een monster van 1,2 milliliter naar een nieuwe microcentrifugebuis en plaatst u het in de centrifuge. Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 14.000 keer G op kamertemperatuur. Dit is het nultijdstip. Na het centrifugeren, brengt u een milliliter van de supernatant over naar een verse schroefdopples van twee milliliter en bevriest u deze bij min 80 graden Celsius.

Herhaal het proces van het nemen van aliquots, centrifugeren en bevriezen met regelmatige intervallen totdat het monster voor elk tijdstip is verzameld. Vanwege de tijd die nodig is voor centrifugatie en bemonstering, zijn tijdstippen van minder dan twee minuten niet mogelijk tijdens deze procedure, dus deze monsters worden om de twee minuten gedurende 14 minuten genomen. Terwijl u de cortexmonsters bereidt, moet dipicolinezuur worden gecontroleerd, neemt u een apart monster van 100 microliter en verdeelt u het in een microcentrifugebuis op ijs.

Bereid ook monsters voor om een standaardcurve te genereren met de volgende hoeveelheden N-acetylglucosamine. Nul, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 en 5.000 nanomolen in kiemoplossing. Nadat er een monster is verzameld voor elk tijdstip, verwijdert u de monsters uit de vriezer en lyofiliseert u ze samen met de blanco en de standaardcurvemonsters.

Bewaar vervolgens alle monsters bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Op de dag van de test, resuspendeer de lyofilisaat monsters, inclusief de controles en standaardcurve monsters, in 120 microliter zoutzuur met fenol en beta-mercaptoethanol. Breng vervolgens alle gesuspendeerde monsters over naar verse schroefdopples van twee milliliter.

Vervolgens incuberen ze in een recirculerend waterbad op 95 graden Celsius gedurende vier uur. Na de incubatie, plaats de monsters op ijs totdat ze zijn afgekoeld. Voeg vervolgens 120 microliter van drie molaire natriumhydroxide toe om ze te neutraliseren.

Voeg vervolgens 80 microliter van een verzadigde natriumbicarbonaat-oplossing en 80 microliter van een 5% azijnzuuranhydride-oplossing toe aan elk monster en schud het. Incubeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, brengt u de monsters terug naar het waterbad van 95 graden Celsius gedurende precies drie minuten.

Let op dat deze stap tijdsgevoelig is en langere tijden kunnen het signaalontwikkeling in het vervolg beïnvloeden. Verwijder de monsters uit het waterbad en koel ze af op ijs. Voeg 400 microliter van 6,54% kaliumtetraboraattetrahydraat toe aan elke buis en schud.

Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad op 95 graden Celsius gedurende precies zeven minuten. Deze stap is ook tijdsgevoelig. Verwijder de monsters en plaats ze gedurende vijf minuten op ijs.

Terwijl de monsters op ijs staan, bereidt u het kleurreagens voor. Los 0,320 gram DMAB op in 1,9 milliliter ijsafzijn. Merk op dat dit reagens gevoelig is voor tijd, temperatuur en licht en niet van tevoren mag worden gemaakt.

Nadat de DMAB volledig is opgelost, voegt u 100 microliter van 10 normale zoutzuur toe en schudt u het monster. Voeg vervolgens vijf milliliter ijsafzijn toe en schud opnieuw. Voor de colorimetrische reactie, brengt u 100 microliter van elk afgekoeld cortex- of controlemonster over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg 700 microliter van de vers bereide kleuroplossing toe aan elk monster. Breng de monsters onmiddellijk over naar een waterbad van 37 graden Celsius en incubeer de monsters gedurende precies 20 minuten. Na de incubatie, brengt u 200 microliter van elk monster over naar een heldere 96-wellplaat.

De monsters moeten aanvankelijk geel zijn, maar zullen naar paars verschuiven als reducerende suikers, wat duidt op de aanwezigheid van cortex, aanwezig zijn. Hier laten veel van de monsters geen zichtbare paarse kleur zien. De 250, 500 en 5.000 nanomolen monsters zien er echter visueel anders uit dan de negatieve controle nul nanomolen.

Gebruik een platelezer om de absorptie bij 585 nanometer te bepalen. Wanneer gemeten in een OD van 585 nanometer, past het signaal dat wordt gegenereerd door de standaardmonsters het beste bij een lineaire regressie. Deze tabel toont typische resultaten met behulp van N-acetylglucosamine-standaarden.

Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om de standaardcurve te genereren die hier wordt getoond. Een kiemingstest werd uitgevoerd onder kie