Name: Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een colorimetrische assay om cortexfragmenten en reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen van Clostridium difficile. Deze methode kwantificeert de afbraak van de sporencortex.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het project beschreven wordt ondersteund door Award Nummer 5R01AI116895 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en de National Institutes of Health.

1. Het genereren van Monsters <ol><li> Heat activeren C. difficile sporen bij 65 ° C gedurende 30 min en op te slaan op ijs. Opmerking: C. difficile sporen kunnen worden geproduceerd en gezuiverd zoals eerder beschreven 7,9,10. </li><li> Bereid de kieming oplossing X + 1 ml waarbij X het aantal te nemen monsters tijdens de test. Opmerking: De kieming oplossing is specifiek voor de soort bacteriën Spore bestudeerd. Voor het bepalen van C. difficile sporevorming, gebruikten we een oplossing van 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycine en 10 mM taurocholinezuur in gedeïoniseerd water. </li><li> Voor aanvang van de test opneming van een 1,0 ml monster van de kieming oplossing zonder sporen om te dienen als een blanco voor cortex fragment detectie. </li><li> Sporen toevoegen aan een OD 600 van 3,0 ~ de kieming oplossing en vortex snel. Opmerking: Voor onze kieming studies in B. subtilis, gebruikten we dezelfde OD 600 sporen als voor C. difficile. Let op: Deze hoeveelheid sporen werkte goed voor het toezicht op cortex fragment vrijkomen tijdens C. difficile spore kieming. De hoeveelheid sporen die in deze test moet proefondervindelijk worden bepaald voor elke bacterie of stam. </li><li> Verwijderen van een 1,2 ml monster onmiddellijk na toevoeging van de sporen en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min bij 14.000 x g. Dit is het tijdstip nul. </li><li> Transfer 1,0 ml van de supernatant van het gecentrifugeerde monster naar een nieuwe buis voor daaropvolgende cortex fragmentanalyse. Opmerking: Als DPA moeten worden gecontroleerd, verwijdert een aparte 100 gl monster voor de detectie van DPA in de oplossing gebruik van een test gebaseerd op terbium fluorescentie 9,18,19. </li><li> Bevries de verzamelde monster bij -80 ° C. </li><li> Herhaal de stappen 1,4 en 1,5 op regelmatige afstanden totdat alle tijdstippen voltooid. Let op: Als gevolg van de tijd die nodig is voor centrifugeren en bemonstering, tijdstippen minder theen 2 min uit elkaar waren niet mogelijk tijdens onze procedure, zodat onze sampling intervallen waren eenmaal per 2 min gedurende 14 min. </li><li> Als een positieve controle op reducerende suikers detectie en kwantificering, de volgende hoeveelheden N-acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 en 5000. Bereid deze monsters tegelijk als cortex monsters en langs de cortex monsters zodat de standaardcurve gegenereerd door de kiemende sporen gegevens relevant is. </li><li> Immers tijdstip monsters worden verzameld, lyofiliseren de monsters. Let op: We gevriesdroogd onze monsters in 2 ml schroefdop buizen. </li></ol> 2. Het meten van Cortex Fragments <ol><li> Resuspendeer gevriesdroogde monsters in 120 gl 3 N HCl gesupplementeerd met 1% fenol en 0,5% β-mercaptoethanol. </li><li> Breng de geresuspendeerde monsters tot 2 ml schroefdop buizen. Opmerking: Voor reproduceerbaarheid, zorgen voor al het gevriesdroogde monster wordt gesuspendeerd en overgebracht. </li> &lt;li&gt; Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Na incubatie, plaatst de monsters op ijs totdat ze zijn cool. </li><li> Neutraliseer de monsters met 120 ui 3 M NaOH. </li><li> Voeg 80 pl van een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing en 80 pi van een 5% oplossing van azijnzuuranhydride aan elk monster en vortex. </li><li> Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Breng de monsters terug naar de 95 ° C waterbad gedurende precies 3 minuten. Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden. </li><li> Verwijder monsters uit het waterbad en koelen op ijs. </li><li> Voeg 400 ul van 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O aan elke buis en vortex. </li><li> Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende precies 7 min. Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden. </li><li> Verwijderende monsters en plaats op ijs gedurende 5 minuten. </li></ol> 3. Kleur reagens <ol><li> Terwijl de monsters op ijs (stap 2.12), de voorbereiding van de kleur reagens. Los op 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich&#39;s reagens) in 1,9 ml ijsazijn. Opmerking: Het reagens, temperatuur en lichtgevoelig en moet niet van tevoren. </li><li> Na het DMAB volledig oplost, voeg 100 ul van 10 N HCl en vortex. </li><li> Voeg 5 ml ijsazijn en vortex. </li></ol> 4. colorimetrische reactie <ol><li> Breng 100 pi van elk monster gekoeld cortex een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 700 ul van vers bereide kleurenoplossing aan elk monster. </li><li> Geeft de monsters over te brengen naar een 37 ° C waterbad en incubeer gedurende precies 20 min. </li><li> Transfer 200 ul van elk monster een duidelijke 96-well plaat. </li><li> Kwantificeren van de monsters bij 585 nm op een bordlezer. De monsters moeten beginnen bij een gele kleur en een positieve reactie zal verschuiven naar paars. Hoe meer cortex aanwezig, hoe dieper de paarse kleur. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij stimulatie, sporen het kiemproces ondergaan verliezen hun resistentie eigenschappen zonder de noodzaak voor macromoleculaire synthese. Wanneer spore kieming wordt geactiveerd, de spore kern releases DPA in ruil voor water 2. Door de hoge DPA gehalte van de slapende spore, de spore kern onder hoge osmotische druk en de gespecialiseerde peptidoglycaan, cortex, helpt voorkomen dat de kern van zwelling door zich vermoedelijk als een belemmering voor uitbreiding 2. De hi...

Endospores metabolisch sluimerende vormen van bacteriën die het mogelijk maken bacteriën te volharden in ongunstige omgevingen. In veel sporenvormende bacteriën wordt spore vorming geïnduceerd door ontbering nutriënten maar dit proces kan worden geregeld door veranderingen in pH, blootstelling aan zuurstof of andere belastingen 1. Terwijl in hun metabolisch slapende spore vorm, bacteriën verzetten tegen UV-straling, uitdroging, hogere temperaturen en bevriezing 2. Het grootste deel van de kennis over de sporulatie proces komt uit studies in het model organisme, Bacillus subtilis. De sporulatie begint met DNA replicatie en de vorming van een axiaal filament 3,4. Een asymmetrisch septum verdeelt vervolgens de cel in twee ongelijke grootte compartimenten. Hoe groter compartiment, de moeder cel, overspoelt de kleinere compartiment, de forespore. Zowel de moeder cel en forespore coördineren genexpressie aan de spore en de moeder cel uiteindelijk lyseert rijpen, het loslaten van de dormant spore deze in het milieu 1. De spore structuur en samenstelling is geconserveerd in vele soorten bacteriën. De spore kern heeft een lager watergehalte dan de vegetatieve cel en is rijk aan dipicolinezuur (DPA) 1,2. Tijdens spore vorming, is DPA gepompt in de spore kern in ruil voor water. Rondom de kern is een innerlijke spore membraan, waar in de meeste sporenvormende bacteriën, de receptoren die de kleine moleculen die de kieming (germinants) te stimuleren te herkennen zijn gelegen op 2. Gelegen net buiten binnenste membraan van de spore is een laag van celwand peptidoglycan. Een gespecialiseerde peptidoglycaanlaag (cortex) omgeeft de celwand peptidoglycan en bestaat uit veel van dezelfde componenten als celwand peptidoglycan [alternerende N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM)]. Echter, circa 50% van de NAM residuen in de cortex omgezet naar muramic-δ-lactam 5,6 </sup&gt;. Tijdens sporevorming worden deze muramic-δ-lactam residuen die door de spore cortex lytische enzymen (SCLEs), waardoor de cortex worden afgebroken (een proces dat cruciaal is kieming voltooid), maar niet de celwand. Rondom de cortex is een buitenste membraan en verschillende lagen van manteleiwitten 2. Beheersing van het proces van kieming is van cruciaal belang voor de sporenvormende bacteriën. Kieming wordt gestart wanneer ontkiemende receptoren interageren met hun respectievelijke germinants 2. In veel sporenvormende bacteriën die germinants zijn aminozuren, suikers, nucleotiden, ionen of combinaties daarvan 2. C. difficile sporevorming wordt geïnitieerd door combinaties van bepaalde galzuren [bv taurocholinezuur (TA)] en aminozuren (bijvoorbeeld glycine) 7-10. Hoewel er verschillen tussen de C. difficile kieming route en de paden bestudeerd in andere sporenvormendebacteriën, zoals B. subtilis, voor alle is de absolute vereiste om de spore cortex degraderen om een vegetatieve cel te groeien van de gekiemde spore 2,8. Cortex afbraak kan door de SCLEs CwlJ / SleB (zoals in B. subtilis) of SLEC (zoals in veel Clostridia). Cortex hydrolyse reduceert de beperking op de celwand en spore. Dit maakt volledige kern rehydratatie, een noodzakelijke stap reactiveren veel van de eiwitten die nodig zijn voor cellulaire metabolisme 2. Wanneer sporen ontkiemen kan de slapende spore verandert van een fase-heldere toestand naar een geleidelijk donkere toestand en dit proces worden gemeten door een verandering van de optische dichtheid (OD) bij 600 11 nm. Een eerdere rapport suggereert dat veel van deze verandering in OD door het vrijkomen van DPA uit de spore 12. Tijdens onze recente studie hebben we getracht de timing van C. vergelijken difficile spore kieming en bewaakt derelease van DPA en cortex fragmenten 9. Voor deze studie was het kritisch om de vrijlating van cortex fragmenten controleren zij begon te worden vrijgegeven door sporen ontkiemen. De colorimetrische bepaling hier was gebaseerd op een werkwijze voor het detecteren van suikers met reducerende uiteinden ontwikkeld Ghuysen et al. 13. Omdat andere protocollen zijn beschreven voor de detectie van reducerende suikers of 14 hebben die protocollen 15 gewijzigd, kan de literatuur over dit onderwerp verwarrend. Hier hebben we detail een stap-voor-stap werkwijze voor de colorimetrische detectie van reducerende suikers vrijgemaakt ontkiemt C. difficile sporen. Hoewel deze studie maakt gebruik van C. difficile sporen, de reducerende suikers vrijkomt bij de kieming van sporen van andere sporenvormende bacteriën kunnen worden gedetecteerd met dit protocol 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml screw cap tube</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &#956;l pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956;ll pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturated Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Heated, Circulating Water Bath</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 well clear tissue culture plates</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecteren cortex fragmenten tijdens bacteriële spore kiemkracht

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Het proces van endosporekieming in Clostridium difficile, en andere Clostridia, blijkt steeds meer af te wijken van het model van sporenvormende bacteriën, Bacillus subtilis. Keiming wordt geactiveerd door kleine molecuulkiemstoffen en vindt plaats zonder de noodzaak van macromoleculaire synthese. Hoewel er verschillen bestaan tussen de mechanismen van sporekieming in soorten van Bacillus en Clostridium, is een gemeenschappelijke vereiste de hydrolyse van de peptidoglycaan-achtige cortex die het sporekern laat zwellen en rehydrateren. Na rehydratatie kan het metabolisme beginnen en dit leidt uiteindelijk tot de uitgroei van een vegetatieve cel. De detectie van gehydrolyseerde cortexfragmenten tijdens sporekieming kan moeilijk zijn en de aanpassingen aan de eerder beschreven assays kunnen verwarrend of moeilijk te reproduceren zijn. Dus, gebaseerd op ons recente rapport met behulp van deze assay, beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de colorimetrische detectie van cortexfragmenten tijdens bacteriële sporekieming.

Tabel 1 toont typische resultaten met behulp NAG normen. De gegevens worden gebruikt om een standaardcurve te genereren. Tabel 2 toont typische resultaten van een assay kieming kieming buffer gesupplementeerd met 100 mM glycine en 10 mM TA (-kiemen bevorderen omstandigheden) of 100 mM glycine alleen (niet-kiemende omstandigheden). Aangezien TA, C. difficile sporen niet ontkiemen en er weinig verandering in de aanwezigheid van fragmenten cortex i...

Hier beschrijven we een colorimetrische test om de aanwezigheid van reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen.

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Het algemene doel van dit stapsgewijze protocol is het kwantificeren van de overvloed aan cortexfragmenten of reducerende suikers tijdens de kieming van bacteriële sporen. Deze methode beschrijft in detail de stappen die nodig zijn om de aanwezigheid van cortexfragmenten of reducerende suikers tijdens de sporekieming aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de meeste laboratoria over de reagentia en apparatuur beschikken die nodig zijn om het protocol succesvol uit te voeren.Begin deze procedure door een buis met Clostridium difficile-sporen in een warmteblok te plaatsen en deze 30 minuten lang te incuberen bij 65 graden Celsius. Plaats de buis na de incubatie op ijs. De kiemoplossing is specifiek voor de bestudeerde soort bacteriële spore.Voor het analyseren van de sporengerminatie van C.difficile gebruiken we een oplossing van 10 millimolair Tris bij pH 7,5 met 150 millimolair natriumchloride, 100 millimolair glycine en 10 millimolair taurocholaanzuur in gedeïoniseerd water. Bereid één milliliter germinatie-oplossing per monster plus één milliliter extra. Draag vóór aanvang van de analyse één milliliter van de germinatie-oplossing over naar een microcentrifugebuisje en zet deze apart.Dit dient als blanco voor de detectie van cortexfragmenten. Voeg vervolgens sporen toe aan de kiemoplossing tot een OD600 van ongeveer 3,0 en vortex kort. Deze hoeveelheid sporen werkt goed om de afgifte van cortexfragmenten tijdens de kieming van C.difficile-sporen te reguleren.Neem onmiddellijk na het toevoegen van de sporen een monster van 1,2 milliliter over naar een nieuwe microcentrifugebuis en plaats deze in de centrifuge. Centrifugeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende één minuut bij 14.000 ×g. Dit is het nulpunt. Breng na het centrifugeren één milliliter van het supernatant over naar een schone schroefdoppenbuis van twee milliliter en vries deze in bij -80 °C.Herhaal het proces van het nemen van aliquoten, centrifugeren en invriezen met regelmatige tussenpozen totdat de monsters voor elk tijdstip zijn verzameld. Vanwege de tijd die nodig is voor centrifugatie en bemonstering zijn tijdstippen van minder dan twee minuten bij deze procedure niet mogelijk; daarom worden deze monsters elke twee minuten genomen gedurende 14 minuten. Indien dipicolinezuur moet worden gemonitord tijdens het voorbereiden van de cortexmonsters, neem dan een aparte monstername van 100 µL en breng dit over in een microcentrifugebuis op ijs.Bereid daarnaast monsters voor voor het genereren van een standaardcurve met de volgende hoeveelheden N-acetylglucosamine. Nul, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 en 5.000 nanomoles in kiemoplossing. Nadat er voor elk tijdstip een monster is verzameld, worden de monsters uit de vriezer gehaald en samen met de blanco en de monsters voor de standaardcurve gelyofiliseerd.Bewaar vervolgens alle monsters bij -80 °C tot gebruik. Resuspendeer op de dag van de assay de geliofyfiliseerde monsters, inclusief de controles en de monsters voor de standaardcurve, in 120 µL zoutzuur met fenol en bèta-mercaptoethanol. Breng daarna alle geresuspendeerde monsters over naar nieuwe schroefnaaldbuisjes van 2 mL.Incubeer ze vervolgens in een circulerend waterbad bij 95 °C gedurende vier uur. Plaats de monsters na de incubatie op ijs tot ze afgekoeld zijn. Voeg vervolgens 120 µL drie molaire natriumhydroxide toe om ze te neutraliseren.Voeg vervolgens 80 µL van een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing en 80 µL van een 5% azijnzuümhydride-oplossing toe aan elk monster en vortex deze. Incubeer de monsters daarna 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsters na de incubatie exact drie minuten terug in het waterbad van 95 °C.Houd er rekening mee dat deze stap tijdgevoelig is en dat langere tijden de daaropvolgende signaalontwikkeling kunnen beïnvloeden. Haal de monsters uit het waterbad en koel ze op ijs af. Voeg 400 µL 6,54% kaliumtetraboraat-tetrahydraat toe aan elke buis en vortex.Incubeer de monsters in een circulerend waterbad bij 95 °C gedurende precies zeven minuten. Deze stap is eveneens tijdsgevoelig. Neem de monsters uit het bad en plaats ze vijf minuten op ijs.Terwijl de monsters op ijs staan, bereidt u het kleurreagens voor. Los 0,320 gram DMAB op in 1,9 milliliter glaciaal azijnzuur. Let op dat dit reagens gevoelig is voor tijd, temperatuur en licht en daarom niet vooraf bereid mag worden.Nadat het DMAB volledig is opgelost, voegt u 100 µL van 10 N zoutzuur toe en vortex de monster. Voeg vervolgens vijf milliliter glaciaal azijnzuur toe en vortex opnieuw. Voor de colorimetrische reactie brengt u 100 µL van elk gekoeld cortex- of controlemonster over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Voeg 700 µL van de vers bereide kleuringsoplossing toe aan elk monster. Plaats de monsters onmiddellijk in een waterbad van 37 °C en incubeer deze gedurende precies 20 minuten. Breng na de incubatie 200 µL van elk monster over naar een transparante 96-wellplaat.De monsters moeten aanvankelijk geel van kleur zijn, maar zullen paars kleuren als er reducerende suikers aanwezig zijn, wat duidt op de aanwezigheid van cortex. In dit geval vertonen veel van de monsters geen zichtbare paarse kleur. De monsters van 250, 500 en 5 000 nanomole lijken echter visueel anders dan de negatieve controle van nul nanomole.Bepaal de absorptie bij 585 nanometer met een platenlezer. Wanneer gemeten bij een OD van 585 nanometer, past het signaal gegenereerd door de standaardmonsters het beste bij een lineaire regressie. Deze tabel toont typische resultaten met N-acetylglucosamine-standaarden.Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om de hier getoonde standaardcurve te genereren. Een kiemassay werd uitgevoerd onder kiembevorderende condities met kiemingsbuffer aangevuld met 100 millimolar glycine en 10 millimolar taurocholzuur. Onder niet-kiemende condities werd enkel 100 millimolar glycine gebruikt.In afwezigheid van taurocholzuur kiemen C.Difficile-sporen niet en is er nauwelijks verandering in de aanwezigheid van cortexfragmenten in de oplossing. Echter, in de aanwezigheid van zowel taurocholzuur als glycine kiemen C.difficile-sporen en laten ze cortexfragmenten in de oplossing vrij. Dit wordt gemeten als een toename van de OD585 over tijd in de gereageerde monsters.De hoeveelheid vrijgekomen cortexfragmenten tijdens deze assay werd berekend met behulp van een standaardcurve. Zoals hier in deze assay te zien is, werd het grootste deel van de cortex gehydrolyseerd of vrijgegeven binnen 15 minuten na blootstelling aan het kiemmiddel. Dit suggereert dat de meeste sporen binnen dit tijdsbestek zijn ontkiemd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cortexfragmenten of reducerende suikers in een kiemoplossing kunnen worden gedetecteerd tijdens de kieming van bacteriële sporen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om nauwgezet op de reactietijden te letten, zodat de assay correct verloopt.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Francis, M. B., et al. Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a colorimetric method to detect cortex degradation during bacterial spore germination by measuring the release of reducing sugars over time. Using N-acetylglucosamine standards and time-point samples, the assay quantifies sugar concentration through a purple chromogenic reaction, indicating the extent of cortex hydrolysis.

Colorimetric Detection of Cortex Degradation During Bacterial Spore Germination

Source: Wen, J., Pasman, et. al., Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of structured illumination microscopy to acquire three-dimensional fluorescence images that reveal the organization of germination proteins within the bacterial spore.

Visualization of Germination Proteins in the Inner Membrane of Bacterial Spores

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Er werd een methode ontwikkeld om bacteriële endosporen uit complexe microbiële gemeenschappen te isoleren om op maat gemaakte kweek- of moleculaire studies van deze groep bacteriën uit te voeren.

Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Dit protocol illustreert de belangrijke opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de relevantie van het toezicht op de parameter van de vitaliteit en DNA-herstelsynthese in de heropleving van sporen van Bacillus subtilis na behandeling met lage druk plasma door tracking fluorescentie-gelabelde DNA repair eiwitten via time-resolved confocale microscopie en elektronenmicroscopie scannen.

Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.

Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.

Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie

Leer een colorimetrische assay om cortexfragmenten en reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen van Clostridium difficile. Deze methode kwantificeert de afbraak van de sporencortex.

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

Meer video's verkennen