Gelijktijdig opnemen van Electroretinografie en Visual evoked potentials in verdoofde ratten
July 1st, 2016
Dit protocol beschrijft gelijktijdige meting van elektroretinogram en visueel geëvokte potentialen bij geanesthetiseerde ratten.
Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig het elektroretinogram en het visueel geïnduceerde potentieel bij een rat te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen van de hersenen. Bijvoorbeeld of het effect van veroudering of ziekten bepaalde componenten in de visuele route beïnvloedt.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een uitgebreide beoordeling van de retinale functie en de daaropvolgende invloed op de visuele geïnduceerde corticale functie mogelijk maakt. Om deze procedure te starten, maak de op maat gemaakte inactieve ERG-elektroden klaar door een 70 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een lus van acht millimeter in diameter te vormen om de rattenoog te omcirkelen. Bereid een uniforme cirkel en pas de grootte van de lus aan door deze op een kop van een millimeter buis te vormen.
Dit is belangrijk omdat een te kleine ring onbedoeld een ongewenste druk kan veroorzaken, terwijl een te grote ring de variabiliteit van signalen kan verhogen. Maak vervolgens de op maat gemaakte inactieve VEP-elektrode klaar door een 70 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een ellips van acht millimeter in diameter te vormen om aan de rattenvoortanden te haken.
Vervolgens maak je de op maat gemaakte actieve ERG-elektroden klaar door een 30 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een kleine lus van ongeveer een tot twee millimeter in diameter te vormen, die wordt gebruikt om de rattenhoornvlies voorzichtig te contacteren met minimale hoornvliesbeschadigingen. Bevestig vervolgens de elektroden stevig aan de elektrodenleidingen door de zilverdraad met de blootgestelde binnendraad te vervlechten. Isoleer overtollig blootgesteld metaal met plakband om fotovoltaïsche artefacten te verminderen.
Voor de actieve ERG-elektroden kunnen meer lagen plakband worden aangebracht om een dikkere en stijvere verpakking te bereiken, zodat de elektrode gemakkelijker met een micromanipulator kan worden vastgehouden. Plak op elke ERG-inactieve elektrode een klein stukje haak- en lusbevestiging op het plakband om een stabiele bevestiging aan de halsband van het knaagdier mogelijk te maken. Bevestig vervolgens voor elke VEP-actieve elektrode een alligatorklem aan de binnendraad van de elektrodenleiding.
Vlak voor de opnames elektroplateer je de blootgestelde oppervlakken van de zilverdraden met chloride om de signaalgeleiding te verbeteren. Verbind hiervoor de kathode met de negatieve pool van de batterij en dompel het andere uiteinde in de zoutoplossing. Dompel vervolgens de zilveren punt van de anodedraad in normale zoutoplossing en verbind het andere uiteinde van deze elektrodendraad met de positieve pool van een negen voltbatterij.
Na 20 seconden ontkoppel je ze en de zilveren punt van de elektrodendraad moet gelijkmatig wit gecoat zijn. Herhaal de chloreringsprocedure voor alle zilveren ERG- en VEP-elektroden. In deze procedure desinfecteert u het geschoren gebied van een verdoofd dier driemaal met 10% povidone jodium.
Maak een sagittale insnijding langs de middellijn op de kop met een scalpel en snij een cirkel van 20 millimeter diameter uit dermale weefsel om het schedelbot bloot te leggen. Verwijder vervolgens het onderliggende periosteum door te schrapen en te drogen met gaas om de coronale en sagittale schedelnaden bloot te leggen. Boor twee gaten door de schedel in beide hemisferen.
Schroef roestvrijstalen schroeven in de twee voorbereide gaten tot een diepte van één millimeter om een stevige verankering mogelijk te maken. Bereid vervolgens het chirurgische gebied voor op tandheelkundig amalgaam door het schedelbot te drogen met gaas en de huid terug te trekken met twee hechtingen. Verspreid vervolgens het tandheelkundig amalgaam over de blootgestelde schedel om de schroefelektroden op hun plaats te bevestigen en ervoor te zorgen dat ongeveer 1,5 millimeter van de schroeven zichtbaar is voor opname.
Verwijder vervolgens de terugtrekhechtingen. Voor scopische opnames worden alle procedures uitgevoerd in een donkere kamer. Voor illustratiedoeleinden wordt de elektrodepositie hier onder normale kamerverlichting uitgevoerd.
Het dier werd 12 uur in het donker aangepast en onder narcose gebracht met ketamine en xylazine. Na verwijding van de pupil en topische anesthesie haakt u de inactieve VEP-elektrode rond de onderste snijtanden. Plaats vervolgens het dier op het ERG-platform voor de Ganzfeld-kom die zich in de Faraday-kooi bevindt.
Bevestig het dier aan het platform met een strook haak- en lusbevestiging die stevig maar niet te strak om de nek wordt geplaatst. Positioneer vervolgens de ERG-inactieve elektroden door de scleraring niet-invasief rond de evenaar van de ogen te omcirkelen. Ongeveer drie meter achter het limbus.
Stabiliseer dit door de elektrode aan de haak- en lusbevestigingsstrook om de nek te bevestigen. Herhaal de procedure voor het contralaterale oog. Bevestig nu de VEP-actieve elektroden door alligatorklemmen aan de roestvrijstalen schroeven te bevestigen, die eerder op de schedel zijn geïmplanteerd.
Voor de plaatsing van de actieve ERG-elektrode, plaats je een kleine druppel van 1% natriumcarboxymethylcellulose op de elektrode om de signaalkwaliteit te verbeteren. Positioneer de actieve ERG-elektroden om het centrale hoornvliesoppervlak licht aan te raken met behulp van een micromanipulator die is bevestigd aan de op maat gemaakte stereotaxische arm. Zorg ervoor dat natriumcarboxymethylcellulose alleen het hoornvlies raakt en niet de sclera, door overtollig vocht weg te vegen.
Breng vervolgens twee tot vijf millimeter van de roestvrijstalen grondnaaldelektrode subcutaan in de staart in. Schuif het platform dichter bij de Ganzfeld-kom en zorg ervoor dat de ogen van het dier zijn uitgelijnd met de opening van de kom om een gelijkmatige verlichting van beide netvlies te mogelijk te maken. Sluit vervolgens de Faraday-kooi om externe ruis te verminderen.
Volgens het bovenstaande protocol kan een stapel ERG-golfvormen worden opgenomen als reactie op een reeks stimuli, waarbij de zwakste flits onderaan wordt getoond en de sterkste bovenaan. Bij zeer zwakke
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft gelijktijdige meting van elektroretinogram en visueel evocerende potentialen bij geanesthetiseerde ratten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de hersenwetenschap, met name met betrekking tot de effecten van veroudering of ziekten op de visuele route.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Visuele verwerking
Achtergrond
- Elektroretinogram (ERG) meet de functie van het netvlies.
- Visueel evocerende potentialen (VEP) beoordelen de corticale visuele verwerking.
- Begrip van componenten van de visuele route is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Leeftijd en ziekte kunnen de visuele functie beïnvloeden.
Doel van het onderzoek
- Om ERG en VEP gelijktijdig bij ratten te meten.
- Om de invloed van veroudering en ziekten op visuele routes te evalueren.
- Om een uitgebreide beoordeling van retinale en corticale functies te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van aangepaste ERG-elektroden met behulp van zilverdraad.
- Plaatsing van elektroden rond het oog van de rat.
- Gelijktijdige opname van ERG- en VEP-signalen.
- Analyse van gegevens om de visuele functie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van zowel ERG als VEP bij geanesthetiseerde ratten.
- Identificatie van veranderingen in componenten van de visuele route als gevolg van veroudering of ziekte.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor een uitgebreide visuele beoordeling.
- Inzichten in retinale en corticale interacties bij visuele verwerking.
Conclusies
- Deze techniek maakt een gedetailleerde studie van visuele functie in diermodellen mogelijk.
- Het kan helpen bij het verduidelijken van de effecten van verschillende factoren op visuele routes.
- Verder onderzoek kan de kennis over visuele verwerking in gezondheid en ziekte uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous ERG and VEP recording enables comprehensive assessment of retinal-to-cortical visual pathway integrity in preclinical models. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking by linking retinal dysfunction to upstream cortical effects, informing target validation in neurodegenerative and ophthalmic disease research. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, translatable electrophysiological readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating retinal electrophysiological changes with cortical visual processing deficits.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of retinal and visual pathway responses to light stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate specific visual pathway components (e.g., rod bipolar, retinal ganglion cell function).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline retinal and cortical electrophysiological profiles.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs (e.g., P2 amplitude, pSTR peak) for reliable compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across disease models due to consistent electrode preparation and signal acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by assessing disease-relevant visual pathway alterations from retina to cortex.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through amplitude and timing analysis of ERG and VEP waveforms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether retinal changes drive cortical dysfunction or occur independently, reducing false positives in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing electrophysiological biomarkers of visual pathway integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect retinal neuronal and glial cell class responses.
- Screening: Enables assay readiness via stable, low-noise signal acquisition after electrode chloridation and proper dark adaptation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ERG A/B waves, VEP peak-to-peak amplitude) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling retinal ganglion and cone bipolar cell function using established intensity-response paradigms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for chronic studies due to stable electrode implantation and standardized recording parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing retinal versus cortical contributions to visual deficits.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed electrode preparation (silver wire chloridation, loop sizing) and placement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional visual pathway outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on dose-responsive changes in scotopic threshold responses and VEP amplitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and electrode fabrication for stable signal acquisition.
- Depends on instrumentation including Ganzfeld stimulator, Faraday cage, micro-manipulator, and differential amplifiers.
- Necessitates cross-team standardization of dark adaptation protocols and stimulus intensity ranges for reproducible data.
- Involves adaptation considerations across rodent strains and anesthesia regimens affecting pupil dilation and corneal sensitivity.
- Practical limitations include signal variability from improper electrode sizing or inadequate chloridation, as noted in the protocol.
