Gelijktijdig opnemen van Electroretinografie en Visual evoked potentials in verdoofde ratten
1 juli 2016
Dit protocol beschrijft gelijktijdige meting van elektroretinogram en visueel geëvokte potentialen bij geanesthetiseerde ratten.
Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig het elektroretinogram en het visueel geïnduceerde potentieel bij een rat te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen van de hersenen. Bijvoorbeeld of het effect van veroudering of ziekten bepaalde componenten in de visuele route beïnvloedt.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een uitgebreide beoordeling van de retinale functie en de daaropvolgende invloed op de visuele geïnduceerde corticale functie mogelijk maakt. Om deze procedure te starten, maak de op maat gemaakte inactieve ERG-elektroden klaar door een 70 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een lus van acht millimeter in diameter te vormen om de rattenoog te omcirkelen. Bereid een uniforme cirkel en pas de grootte van de lus aan door deze op een kop van een millimeter buis te vormen.
Dit is belangrijk omdat een te kleine ring onbedoeld een ongewenste druk kan veroorzaken, terwijl een te grote ring de variabiliteit van signalen kan verhogen. Maak vervolgens de op maat gemaakte inactieve VEP-elektrode klaar door een 70 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een ellips van acht millimeter in diameter te vormen om aan de rattenvoortanden te haken.
Vervolgens maak je de op maat gemaakte actieve ERG-elektroden klaar door een 30 millimeter lange zilverdraad af te snijden en een kleine lus van ongeveer een tot twee millimeter in diameter te vormen, die wordt gebruikt om de rattenhoornvlies voorzichtig te contacteren met minimale hoornvliesbeschadigingen. Bevestig vervolgens de elektroden stevig aan de elektrodenleidingen door de zilverdraad met de blootgestelde binnendraad te vervlechten. Isoleer overtollig blootgesteld metaal met plakband om fotovoltaïsche artefacten te verminderen.
Voor de actieve ERG-elektroden kunnen meer lagen plakband worden aangebracht om een dikkere en stijvere verpakking te bereiken, zodat de elektrode gemakkelijker met een micromanipulator kan worden vastgehouden. Plak op elke ERG-inactieve elektrode een klein stukje haak- en lusbevestiging op het plakband om een stabiele bevestiging aan de halsband van het knaagdier mogelijk te maken. Bevestig vervolgens voor elke VEP-actieve elektrode een alligatorklem aan de binnendraad van de elektrodenleiding.
Vlak voor de opnames elektroplateer je de blootgestelde oppervlakken van de zilverdraden met chloride om de signaalgeleiding te verbeteren. Verbind hiervoor de kathode met de negatieve pool van de batterij en dompel het andere uiteinde in de zoutoplossing. Dompel vervolgens de zilveren punt van de anodedraad in normale zoutoplossing en verbind het andere uiteinde van deze elektrodendraad met de positieve pool van een negen voltbatterij.
Na 20 seconden ontkoppel je ze en de zilveren punt van de elektrodendraad moet gelijkmatig wit gecoat zijn. Herhaal de chloreringsprocedure voor alle zilveren ERG- en VEP-elektroden. In deze procedure desinfecteert u het geschoren gebied van een verdoofd dier driemaal met 10% povidone jodium.
Maak een sagittale insnijding langs de middellijn op de kop met een scalpel en snij een cirkel van 20 millimeter diameter uit dermale weefsel om het schedelbot bloot te leggen. Verwijder vervolgens het onderliggende periosteum door te schrapen en te drogen met gaas om de coronale en sagittale schedelnaden bloot te leggen. Boor twee gaten door de schedel in beide hemisferen.
Schroef roestvrijstalen schroeven in de twee voorbereide gaten tot een diepte van één millimeter om een stevige verankering mogelijk te maken. Bereid vervolgens het chirurgische gebied voor op tandheelkundig amalgaam door het schedelbot te drogen met gaas en de huid terug te trekken met twee hechtingen. Verspreid vervolgens het tandheelkundig amalgaam over de blootgestelde schedel om de schroefelektroden op hun plaats te bevestigen en ervoor te zorgen dat ongeveer 1,5 millimeter van de schroeven zichtbaar is voor opname.
Verwijder vervolgens de terugtrekhechtingen. Voor scopische opnames worden alle procedures uitgevoerd in een donkere kamer. Voor illustratiedoeleinden wordt de elektrodepositie hier onder normale kamerverlichting uitgevoerd.
Het dier werd 12 uur in het donker aangepast en onder narcose gebracht met ketamine en xylazine. Na verwijding van de pupil en topische anesthesie haakt u de inactieve VEP-elektrode rond de onderste snijtanden. Plaats vervolgens het dier op het ERG-platform voor de Ganzfeld-kom die zich in de Faraday-kooi bevindt.
Bevestig het dier aan het platform met een strook haak- en lusbevestiging die stevig maar niet te strak om de nek wordt geplaatst. Positioneer vervolgens de ERG-inactieve elektroden door de scleraring niet-invasief rond de evenaar van de ogen te omcirkelen. Ongeveer drie meter achter het limbus.
Stabiliseer dit door de elektrode aan de haak- en lusbevestigingsstrook om de nek te bevestigen. Herhaal de procedure voor het contralaterale oog. Bevestig nu de VEP-actieve elektroden door alligatorklemmen aan de roestvrijstalen schroeven te bevestigen, die eerder op de schedel zijn geïmplanteerd.
Voor de plaatsing van de actieve ERG-elektrode, plaats je een kleine druppel van 1% natriumcarboxymethylcellulose op de elektrode om de signaalkwaliteit te verbeteren. Positioneer de actieve ERG-elektroden om het centrale hoornvliesoppervlak licht aan te raken met behulp van een micromanipulator die is bevestigd aan de op maat gemaakte stereotaxische arm. Zorg ervoor dat natriumcarboxymethylcellulose alleen het hoornvlies raakt en niet de sclera, door overtollig vocht weg te vegen.
Breng vervolgens twee tot vijf millimeter van de roestvrijstalen grondnaaldelektrode subcutaan in de staart in. Schuif het platform dichter bij de Ganzfeld-kom en zorg ervoor dat de ogen van het dier zijn uitgelijnd met de opening van de kom om een gelijkmatige verlichting van beide netvlies te mogelijk te maken. Sluit vervolgens de Faraday-kooi om externe ruis te verminderen.
Volgens het bovenstaande protocol kan een stapel ERG-golfvormen worden opgenomen als reactie op een reeks stimuli, waarbij de zwakste flits onderaan wordt getoond en de sterkste bovenaan. Bij zeer zwakke
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de gelijktijdige meting van het elektroretinogram en visueel opgeroepen potentialen bij geanestheseerde ratten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen van de visuele banen, in het bijzonder met betrekking tot de effecten van veroudering of ziekten op het visuele pad.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Visuele verwerking
Achtergrond
- Het elektroretinogram (ERG) meet de retinale functie.
- Visuele geëvoceerde potentialen (VEP) beoordelen de corticale visuele verwerking.
- Kennis van de componenten van de visuele baan is essentieel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Leeftijd en ziekte kunnen invloed hebben op de visuele functie.
Doel van de studie
- Om ERG en VEP gelijktijdig bij ratten te meten.
- Om de impact van veroudering en ziekten op de visuele banen te evalueren.
- Om een uitgebreide beoordeling van de retinale en corticale functies te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van op maat gemaakte ERG-elektroden met behulp van zilverdraad.
- Plaatsing van de elektroden rond het oog van de rat.
- Gelijktijdige registratie van ERG- en VEP-signalen.
- Analyse van de gegevens om de visuele functie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van zowel ERG als VEP bij geanestheseerde ratten.
- Identificatie van veranderingen in componenten van de visuele baan als gevolg van veroudering of ziekte.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor een uitgebreide visuele beoordeling.
- Inzichten in retinale en corticale interacties bij visuele verwerking.
Conclusies
- Deze techniek maakt gedetailleerde studie van de visuele functie in diermodellen mogelijk.
- Het kan helpen bij het verduidelijken van de effecten van diverse factoren op de visuele banen.
- Verder onderzoek kan het begrip van de visuele verwerking bij gezondheid en ziekte uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Gelijktijdige ERG- en VEP-registratie maakt een uitgebreide beoordeling van de integriteit van het visuele pad van het netvlies naar de cortex mogelijk in preklinische modellen. Deze duale modaliteitsbenadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door retinale dysfunctie te koppelen aan stroomopwaartse corticale effecten, wat bijdraagt aan targetvalidatie in onderzoek naar neurodegeneratieve en oftalmologische ziekten. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, vertaalbare elektrofysiologische read-outs te bieden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door retinale elektrofysiologische veranderingen te correleren met tekortkomingen in de corticale visuele verwerking.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk door gelijktijdige meting van retinale responsen en responsen van de visuele route op lichtstimulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die specifieke componenten van de visuele route moduleren (bijv. staafbipolaire cellen, functie van retinale ganglioncellen).
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door baseline elektrofyziologische profielen van het netvlies en de cortex vast te stellen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve output (bijv. P2-amplitude, pSTR-piek) voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende ziektemodellen vanwege consistente protocollen voor elektrodevoorbereiding en signaalacquisitie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft translationele continuïteit door ziekterelateerde veranderingen in de visuele banen te beoordelen van het netvlies tot de cortex.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via amplitude- en timinganalyse van ERG- en VEP-golfvormen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of retinaveranderingen de corticale dysfunctie aansturen of onafhankelijk optreden, waardoor fout-positieven bij target engagement worden verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische efficiëntietesten, en biedt elektrofysiologische biomarkers voor de integriteit van de visuele baan.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door te meten hoe genetische of farmacologische manipulaties de responsen van klassen retinaire neuronen en gliacellen beïnvloeden.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via stabiele signaalacquisitie met een lage ruis na chloridering van de elektroden en een correcte donkeradaptatie.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (ERG A/B-golven, VEP piek-tot-piek amplitude) voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische validatie door de functie van retinaire ganglioncellen en cone bipolaire cellen te modelleren met behulp van gevestigde intensiteits-respons-paradigma's.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vertegenwoordigt een herbruikbare capaciteit voor chronische studies dankzij stabiele elektrodenimplantatie en gestandaardiseerde registratieparameters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door onderscheid te maken tussen retinale en corticale bijdragen aan visuele tekorten.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie via gedetailleerde elektrodevoorbereiding (chloridering van zilverdraad, loopmaat) en plaatsingsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door doelgerichte modulatie te koppelen aan functionele resultaten van de visuele baan.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van dosisresponsieve veranderingen in scotopische drempelresponsen en VEP-amplitude.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, microchirurgie en de fabricage van elektroden voor een stabiele signaalacquisitie.
- Is afhankelijk van instrumentatie, waaronder een Ganzfeld-stimulator, een kooi van Faraday, een micromanipulator en differentiële versterkers.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams van dark-adaptatieprotocollen en stimulusintensiteitsbereiken voor reproduceerbare gegevens.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie tussen verschillende knaagdierstammen en anesthesieregimes die de pupilverwijding en hoornvliesgevoeligheid beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten signaalvariabiliteit door onjuiste electrodegrootte of inadequate chloridering, zoals vermeld in het protocol.
