Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses

Het algemene doel van deze techniek is om lange secties van muizenintestinaal weefsel efficiënt te verwerken voor uniforme histologische kleuring over de hele lengte. Om de darmsecties te verkrijgen, kunnen er variaties in kleuring zijn over de gehele lengte van de darm. Ik probeerde de standaard Swiss rolling-techniek te gebruiken, maar ontdekte dat deze darmweefsels oplevert die erg stijf zijn en niet gemakkelijk te openen zijn.

Na enige experimenten kwam ik met een snelle fixatiemethode die minder toxische chemicaliën gebruikt en die veel betere Swiss rolling van het darmweefsel mogelijk maakt. Het aangepaste fixeermiddel kan worden gebruikt om andere dikke weefsels snel te fixeren. In voorbereiding, euthaniseer het proefdier volgens het tekstprotocol en maak de chirurgische omgeving klaar.

Begin door dissectiepincetten en schaar te gebruiken om een laterale incisie te maken in het midden van de buik, ongeveer een tot twee centimeter onder de ribbenkast, afhankelijk van de grootte van de muis. Trek dan voorzichtig uit elkaar en snijd de huid weg om de buikspieren bloot te leggen. Grijp vervolgens de spieren en trek omhoog zonder de darmen vast te houden of eraan te trekken.

Maak vervolgens voorzichtig een initiële incisie in de buikspieren en snijd voorzichtig door ze heen om de darmen bloot te leggen. Identificeer nu de dikke darm en volg het tot aan het distale uiteinde waar het aansluit op het rectum. Snijd vervolgens de dikke darm zo dicht mogelijk bij de anusopening door met een schaar.

Zoek vervolgens waar de maag aansluit op de dunne darm en snijd de darmen los van de maag, ongeveer een centimeter, met een schaar. Breng nu de volledige lengte van de vrije dunne darm en dikke darm over naar een schone petrischaal met PBS. Zet vervolgens het distale uiteinde van de dikke darm vast en wikkel voorzichtig de hele lengte van de dikke darm af en verwijder eventueel aangehecht mesenterisch weefsel.

Identificeer vervolgens het blindedarm, en snijd de darm door waar het blindedarm zich aansluit op de dikke darm, waardoor de dikke darm wordt geïsoleerd. Wikkel vervolgens de rest van de dunne darm los van het aangehecht mesenterisch bind- en vetweefsel. Snijd vervolgens de dunne darm door waar het aansluit op het blindedarm.

Het blindedarm kan vervolgens worden verwijderd en weggegooid. Vul nu een 10 milliliter spuit met gemodificeerd Bouin's fixeermiddel en bevestig een gavage-naald. Steek de naald ongeveer een halve centimeter in de voorste opening van een darmsegment.

Terwijl je de gavage-naald stevig in het segment vastzet, spoel je langzaam de inhoud van het weefsel met fixeermiddel. Wees voorzichtig, want te veel druk zal het segment doen barsten. Als de dunne darm er te lang uitziet om te hanteren, kun je hem eerst in drie gelijke segmenten snijden en elk segment afzonderlijk spoelen.

De fixatie zorgt ervoor dat de kleur van het darmsegment ondoorzichtig wordt. Snijd vervolgens het segment met schaar langs de mesenteriale lijn en spoel het segment kort in een schaal met PBS terwijl je het openhoudt met pincetten. Snijd nu de dunne darm in drie gelijke segmenten, proximaal, midden en distaal, die ongeveer overeenkomen met de duodenum, de jejunum en de ileum.

Macroscopisch zijn er geen onderscheidende kenmerken voor elk segment. Zorg ervoor dat je een markering maakt om het proximaal uiteinde van het distale uiteinde op elk segment te identificeren. Plaats vervolgens een segment met de lumenale zijde omhoog op de deksel van een petrischaal.

Op het dikke darmsegment identificeer je de lumenale zijde aan de richels die over de breedte lopen aan het proximale uiteinde. De middelste en distale gebieden hebben enkele variegaties die longitudinaal lopen. Op de dunne darm identificeer je de lumenale zijde aan de ruwere oppervlakte die de villi markeert.

Microscopisch onderzoek toont aan dat de villi het langst zijn in de proximale gebieden van elk segment, terwijl de colonische crypten het kortst zijn in de proximale gebieden en op hun langst zijn in het middelste gedeelte. Ga verder met Swiss rolling van de dikke darm. Met de dikke darm plat open en de lumenale zijde omhoog, trek hem met pincetten van het proximaal uiteinde naar de rand van de petrischaal.

Houd de lumenale zijde omhoog, grijp het proximaal uiteinde met de pincetten en wikkel het uiteinde rond een tandenstoker en knijp het gewikkelde uiteinde stevig tegen de tandenstoker. Rol vervolgens voorzichtig en langzaam de dikke darm rond de tandenstoker om een Swiss roll te vormen. Zodra de hele lengte van de dikke darm is opgerold, gebruik je een ander paar pincetten om de rol voorzichtig in een weefselverwerkingscassette te schuiven.

Breng vervolgens de cassette over in 10 procent gebufferde formaline en laat hem overnacht bij kamertemperatuur incuberen. Om een segment van de dunne darm te Swiss roll, open je het met de lumenale zijde omhoog en trek het met pincetten van het proximale uiteinde naar de rand van een schaal. Gebruik vervolgens dezelfde techniek als met de dikke darm om de Swiss roll te maken en fixeer deze in formaline.

Met behulp van de beschreven methoden, onthulde HND-kleuring voor de dikke darm van een C57 zwarte 6 muis alle delen van de dikke darm voor een uitgebreide histologische beoordeling. Vervolgens werd de bereiding gebruikt voor muizen die EGFP tot expressie brengen, aangedreven door de LGR5-promotor die alleen actief is in periphererende intestinale crypten. Dit EGFP-transgeen heeft slechts ongeveer 5 tot 10 procent penetrantie, maar gebieden van belang konden gemakkelijk worden gevonden.

Met behulp van dezelfde muizen met EGFP LGR5-expressie, werden KLF5 en KI67 gekleurd. Eerst werden controlemuizen met normale LGR5-expressie bestudeerd. EGFP-positieve cellen zijn gemarkeerd met blauwe pijlen en EGFP-negatieve cellen zijn gemarkeerd met witte pijlen.

Vervolgens werden dezelfde transgenen tot expressie gebracht in een KLF5 knockout-muis. Co-kleuring van KLF5 en KI67 ontbreekt in EGFP