Name: Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Leer intracerebroventriculaire en intravasculaire injectietechnieken voor neurovirologisch onderzoek bij neonatale muizen. Deze methode maakt directe observatie van virale verspreiding mogelijk tijdens de acute infectiefase in het centrale zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de heer Masaaki Kaneta, mevrouw Hiromi Suzuki en mevrouw Mitsue Kawashima (Afdeling Regeneratieve en Infectieuze Pathologie, Hamamatsu University School of Medicine) voor hun uitstekende technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI-subsidienummer 23590445.

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van Hamamatsu Universiteit van de School of Medicine. 1. Bereiding van MCMV (Smith-stam) en recombinant M32-versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) -MCMV <ol><li> Genereren van recombinant M32-EGFP-MCMV volgens de werkwijze als volgt (1,2-1,9) en zoals eerder beschreven 8. </li><li> Gebruik recombinante virussen afgeleid van de Smith stam van wild-type MCMV (toegangsnummer: U68299). Steek EGFP (4361 basenparen, bp) tussen de 37.089 en 41.450 bp (M32 - M31 locus) in de MCMV genoom door homologe recombinatie. </li><li> Amplificeren door polymeraseketenreactie de MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, linker flankerende sequentie en M31 (37.089 - 39.246 bp, rechter flankerende sequentie genloci met de volgende primers: M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(voorwaartse primer), 5 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Omgekeerde primer), M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (voorwaartse primer) 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(omgekeerde primer). </li><li> Plaats de M32 locus in de EGFP-expressie vector gebruikt NheI en BamHI restrictieplaatsen. Steek de M31 locus in de M32-EGFP -recombinant plasmide met behulp van AflII en Xbal sites. Klieven de M32 - EGFP - M31-sequentie met Nhel en AflII van de M32 - EGFP - M31 recombinatie plasmide en los op in H 2 O. </li><li> Transfecteren de gesplitste construct in de kernen van MCMV (Smith-stam) geïnfecteerde NIH3T3-cellen 24 uur na infectie (hpi) door een elektroporatie systeem induceren van homologe recombinatie. </li><li> Op 3 dagen na infectie, co-cultuur van de cellen met niet-geïnfecteerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in een verhouding van 1/1000 in zes-well platen en scherm-EGFP expressie foci van geïnfecteerde cellen. </li><li> Harvest het virus bevattende supernatanten uit de putjes die groen fluorescerend brandpunten en verdunnen vertienvoudigd. Voor zuivering, kiest putten die ene groen fluorescerend brandpunten weer te geven. </li><li> Wanneer alle foci als gevolg van de beperkende-verdunning infectie weergave EGFP expressie, het viruspreparaat zuiver, wat aangeeft dat er geen wild-type virus blijft. Kwantificeren virus door plaque-assay methode zoals eerder beschreven 17. </li><li> Behandel MCMV in gecertificeerde bioveiligheid kasten op bioveiligheidsniveau 2 het dragen van handschoenen en een masker. </li><li> Passage MCMV (Smith-stam) en recombinant MCMV in MEFs bereid uit 12-dagen oude ICR muizenembryo&#39;s zoals eerder beschreven 17. </li><li> Verwijder cellen uit de supernatanten van geïnfecteerde MEF kweken door centrifugatie bij 3000 xg gedurende 20 minuten bij 16 ° C. </li><li> Ultracentrifuge de supernatanten gedurende 40 min bij 70.000 x g. Resuspendeer de pellets die virions in 1 ml Tris-gebufferde zoutoplossing kopiëring op een voorgevormde lineaire sorbitol gradiënt (25% - 70%). Ultracentrifuge opnieuw bij 70.000 x g gedurende 60 minuten 18. </li><li> Oogst de virion-bevattende band met een spuit. Pellet de geoogste virusdeeltjes met een extra stap ultracentrifugatie bij 70.000 xg gedurende 40 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij -80 ° C tot de infectie experimenten. </li><li> Kwantificeren virustiter door de plaque-assay werkwijze zoals eerder beschreven 19. </li><li> Visualiseer de EGFP expressie van het recombinante MCMV deeltjes (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm) van fluorescentie microscopie (figuur 1A) en de deeltjesstructuur van transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 8 (figuur 1B). </li></ol> 2. Voorbereiding van Nile Red Fluorescent Microkralen <ol><li> Aankoop carboxyl Nile rood fluorescerende microbolletjes en plaats 500 pl microkorrels in buizen volgens diameter (0,04- 0,06 urn, ongeveer 3,63 x 10 12 deeltjes; 0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 10 deeltjes; en 1,7-2,2 urn, ongeveer 6,85 x 10 7 deeltjes). </li><li> Behandel korrels met 500 ul van 0,1 M NaOH gedurende ongeveer 1 dag één endotoxines te verwijderen en resuspendeer de kralen in steriel water bij kamertemperatuur. </li><li> Adsorbeer de kralen O / N met 10% muizenserum verkregen uit C57BL / 6 muizen bij kamertemperatuur vóór gebruik. </li><li> Aggregaten, vortex de kralen scheiden en ultrasone trillingen grondig voor gebruik. </li></ol> 3. ICV Injectie van MCMV en Fluorescent Microkralen in pasgeboren muizen <ol><li> Handhaaf normale zwangere ICR muizen in een temperatuur-gecontroleerde faciliteit onder een 12 uur licht / donker-cyclus. De pasgeborenen worden aangeduid als P 0,5 op de geboortedatum. </li><li> Steriliseren van een 10-ul spuit en een 27 G naald met 70% alcohol. </li><li> Laad de injectieoplossing (5 pl) bevattende MCMV of fluorescente micro-kralen in de naald door voorzichtig te trekken van de zuiger van de spuit. </li><li> Restrain neonatale muis (P 0,5) door er met de muis op het ijs voor 3-4 min. Zodra het dier onder narcose is, gebruikt de toe-pinch respons methode om de diepte van de anesthesie te bepalen. </li><li> Markeer de injectieplaats met een niet-toxisch laboratorium pen op een locatie ongeveer 0,7-1,0 mm lateraal van de pijlnaad en 0,7-1,0 mm caudaal van de neonatale bregma (Figuur 2A). </li><li> Steek de naald 2 mm diepte, loodrecht op de schedel oppervlak op de gemarkeerde injectieplaats. Ter referentie, mark 2 mm van het uiteinde van de naald met een niet-toxisch maker. </li><li> Injecteer langzaam 5 pl MCMV (ongeveer 5 x 10 5 PFU) in het laterale ventrikel zonder de hoofdhuid (figuur 2B). </li><li> Bij een andere groep muizen, Injecteer 5 ul oplossing die fluorescerende microbolletjes (0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 8 deeltjes) vandezelfde methode. </li><li> Verwijder langzaam de naald 10 - 20 seconden na het stopzetten van de zuiger beweging om terugstroom te voorkomen. </li><li> Om te herstellen, houden de muizen voor 5-10 minuten in een warme container tot beweging en algemene responsiviteit worden hersteld. </li><li> Oogst de hersenen zoals beschreven in hoofdstuk 5 op verschillende tijdstippen (3, 12, 24, 48 en 72 uur) na injectie. </li></ol> 4. IV Injectie van MCMV of Fluorescent Microkralen in pasgeboren muizen <ol><li> Restrain neonatale muis (P 0,5) door er met de muis op het ijs voor 3-4 min. </li><li> Gebruik een 1 ml spuit met een 35 G naald op de intraveneuze injectie van MCMV uitvoeren P 0,5 pasgeborenen. </li><li> Gebruik een transilluminator (ader finder) naar de oppervlakkige temporale (gezichts) ader te visualiseren. Vóór injectie, veilig de pasgeborene op de transilluminator met behulp van chirurgische tape (figuur 2C). </li><li> Terwijl het dragen van vergrootglazen (1.5x), langzaam trekken 50 pi MCMV (ongeveer 5,45 ×; 10 9 deeltjes) of fluorescerende microbolletjes (0,04-0,06 micrometer, ongeveer 3,63 x 10 11 deeltjes, 0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 9 deeltjes en 1,7-2,2 urn, ongeveer 6,85 x 10 6 deeltjes) in de oppervlakkige temporale ader (Figuur 2D). </li><li> Na verwijdering van de naald, gebruikt gaas met 70% alcohol druk uit op de injectieplaats totdat het bloeden stopt. </li><li> Geef het pasgeboren kind ongeveer 5 minuten in een warme container om te herstellen alvorens terug te keren naar de kooi. </li><li> Oogst de hersenen zoals beschreven in hoofdstuk 5 op verschillende tijdstippen (3, 12, 24 en 72 uur) na injectie. </li></ol> 5. Brain Tissue Monstervoorbereiding voor Paraffinecoupes <ol><li> Plaats de geïnjecteerde pasgeborenen in een kleine plastic schaaltje op crushed ijs. </li><li> Zodra het dier onder narcose is, gebruikt de toe-pinch respons methode om de diepte te bepalen verdoIA. </li><li> Maak een centrale of twee end horizontale einde snijdt door de ribbenkast het openstellen van de borstholte. </li><li> Maak een snee in het atrium met een scherpe schaar. Infuseren 4% paraformaldehyde oplossing (PFA) in het atrium. Stop perfusie als spontane beweging (PFA dans) en lichter kleuren van de lever worden waargenomen. Niet exsanguinate. </li><li> Ontleden de pasgeborene (zoals eerder beschreven 20) door eerst de kop met een schaar verwijderd. </li><li> Maak een middellijn incisie langs het omhulsel van de hals aan de neus aan de schedel bloot te leggen. </li><li> Plaats de punt van een paar irisschaar in het foramen magnum enerzijds goed glijden langs het binnenoppervlak van de schedel. </li><li> Maak een snee te breiden tot de verste rand van het achterste schedel oppervlak, en maak een identieke bezuinigen op de contralaterale zijde. Ruim de schedel rond het cerebellum. </li><li> Schuif nu voorzichtig de schedel enerzijds om schade aan de hersenen te voorkomen. Herhaal dezeaan de tegengestelde kant van de hersenen. </li><li> Met behulp van een spatel, scheiden de reukkwabben en nerveus verbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen. </li><li> Voorzichtig scheiden de hersenen uit het hoofd, trimmen elke dura die nog steeds de hersenen aan te sluiten op de schedel met een schaar en verwijder de hersenen. </li><li> Plaats de hersenen in een flacon fixeermiddel met 4% PFA ten minste 10 maal het volume van de hersenen gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Dehydrateer het weefsel door een reeks van gegradeerde ethanol baden het water verplaatsen en vervolgens infiltreren met paraffine, vormen een blok. Snijd de paraffine blok met een microtoom in plakjes 4 micrometer dik 21. </li><li> Deparaffinize en hydrateren de slides van de besmette hersenen 22. Overgaan tot in situ hybridisatie paraffine ingebedde secties. </li></ol> 6. Brain Tissue Monstervoorbereiding voor vriescoupes <ol><li> Verwijder de hersenen na het stappen in 5,1-5,11. </li><li> Om de fluorescente microkralen en M32-EGFP-MCMV observeren, plaatst u de gereseceerd hersenen op vlakke bodem cryomolds. Voeg inbedding medium volledig te bedekken de hersenen monster. Snap bevriezen cryomolds in voorgekoelde n-hexaan (-80 ° C), middels een tang om de rand van de cryomolds houden vóór bevestiging aan de boorkop. </li><li> Voor het snijden, hechten de bevroren weefsel blok op de voorgekoelde cryostaat boorkop. Breng het ingevroren weefsel met de klem in een cryostaatkamer en laat de temperatuur tussen -10 en -20 ° C, en snijd de plakjes ongeveer 8-10 urn dik 23. </li><li> Bevestig de secties met cytofixative (mengsel van isopropylalcohol en polyethyleenglycol) door sproeien. Lucht drogen de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onmiddellijk na het sproeien en opgeslagen bij - 80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Evenwicht de secties terug naar RT en was drie keer met PBS. </li><li> Vlekken op de secties met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd Griffonia simplicifolia isolectin B4 in een concentratie van 1: 100 gedurende 10 min in PBS bij kamertemperatuur (Figuur 5) of PE-geconjugeerde CD31 antilichaam bij een concentratie van 1: 100 gedurende 30 min in PBS bij kamertemperatuur (figuur 6). </li><li> Was de secties met PBS driemaal. </li><li> Na het wassen, vlekken op de secties met 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om celkernen zichtbaar. Monteer de secties in anti-fade reagens en het DAPI (excitatie bij 345 nm, emissie bij 455 nm), EGFP (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm), en de Nile rood (excitatie bij 553 nm, emissie bij 637 nm) met een fluorescentiemicroscoop (figuren 3, 5, 6). </li></ol> 7. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) voor paraffine ingebedde secties <ol><li> Bereid de FISH probe direct gemerkt met fluorofoor voor DNA in situ hybridisatie door nick translatie met behulp van een bacterieel kunstmatig chromosoom met het hele MCMV DNA-genome (pSM3fr) 19. De concentratie van de FISH probe 0,1 ug / ul. </li><li> Deparaffinize en hydrateren de slides van de besmette hersenen 22. </li><li> Behandel de weefselsecties met RNase (100 ug / ml in PBS) om viraal DNA te detecteren. </li><li> Voeren naar antigenen met een 0,05% NP40, 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) bij 95-98 ° C gedurende 20 min. Koel de objectglaasjes naar kamertemperatuur 20 min. </li><li> In een glazen Coplin kleuring pot, was de dia&#39;s in zuiver water drie keer gedurende 2 minuten per keer. Voer een extra antigen retrieval stap met een 0,06% pepsine, 0,01 N HCl-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Spoel de objectglaasjes drie keer in zuiver water gedurende 2 minuten telkens in een glazen Coplin jar kleuring. </li><li> Dehydrateer de weefselcoupes opnieuw in door de dia&#39;s uit 70% ethanol, 85% ethanol, en vervolgens tot 100% ethanol. </li><li> Voor het bereiden 10 ml hybridisatiebuffer, meng 1,25 ml in situ hybridisatie zouten (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8,0, 100 mM natriumfosfaat pH 6,8, 50 mM EDTA) met 5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 50% dextraansulfaat, 250 gl 50x Denhardt&#39;s oplossing, 125 ul 100 mg / ml tRNA en 875 ul H2O </li><li> Verdun het DNA probe direct gelabeld met fluoroforen die de hele MCMV genoom willekeurig in de hybridisatiebuffer herkennen. Het eindvolume moet 10 pl (7 pl hybridisatie buffer, 1 pl probe (0,1 ug / ul) en 2 ui gedestilleerd water). </li><li> Voeg de sonde mix (10 pi) aan elke dia en dek af met een dekglaasje (15 × 15 mm). Seal het dekglaasje met rubber cement. Denatureren de probe-mengsel gedurende 5 minuten bij 85 ° C en vul het hybridisatiestap O / N bij 42 ° C. </li><li> Was de dia&#39;s met 0,3% NP40, 0,4x SSC bij 73 ° C gedurende 2 min; met 0,1% NP40, 0,4x SSC bij 73 ° C gedurende 1 min; en met 2x SSC tweemaal. </li><li> Tegenkleuring de kernen met DAPI (10 ng / ml) en hebben betrekking op de dia met een dekglaasje. </li><li> bergde secties in anti-fade reagens en het DAPI (excitatie bij 345 nm, emissie bij 455 nm) en EGFP (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm) met een fluorescentiemicroscoop (figuur 4). </li></ol>

<ol><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li>
<li>McLean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+neuron-specific+transgene+expression+in+brain+and+spinal+cord+following+synapsin+promoter-driven+AAV9+neonatal+intracerebroventricular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection.</a> Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).</li>
<li>Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cytomegalovirus+displays+selective+infection+of+cells+within+hours+after+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol.+90%22%5BJournal%5D)">Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration.</a> J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).</li>
<li>Sakao-Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+fetal+macrophage%2Fmicroglial+reactions+to+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neruology%22%5BJournal%5D)">Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection.</a> Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).</li>
<li>Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J Vis Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+initiates+infection+selectively+from+high-level+beta1+integrin-expressing+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).</li>
<li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+AAV2%2F9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).</li>
<li>Cannon, M. J., Davis, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Washing+our+hands+of+the+congenital+cytomegalovirus+disease+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic.</a> Bmc Public Health. 5, (2005).</li>
<li>Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+eye+abnormalities+associated+with+congenital+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).</li>
<li>Becroft, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+cytomegalovirus+infection%3A+epidemiology%2C+pathology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Pediatr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis.</a> Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).</li>
<li>Conboy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intellectual+development+in+school-aged+children+with+asymptomatic+congenital+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).</li>
<li>Fowler, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+congenital+cytomegalovirus+infection+in+relation+to+maternal+antibody+status%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status.</a> N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).</li>
<li>Cannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+cytomegalovirus+%28CMV%29+epidemiology+and+awareness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness.</a> J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).</li>
<li>Grassi, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+nodular+encephalitis+and+ventriculoencephalitis+due+to+cytomegalovirus+infection+in+patients+with+AIDS%3A+two+distinct+clinical+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).</li>
<li>Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+inhibits+mouse+cytomegalovirus+infection+via+a+cyclophilin-dependent+pathway+specifically+in+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells.</a> J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).</li>
<li>Britt, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13(2010).</li>
<li>Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+stem+cells+inhibit+murine+cytomegalovirus+infection+through+a+multi-step+process%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process.</a> PLoS One. 6 (3), e17492(2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. (8), e308(2007).</li>
<li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863(2014).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In diermodellen, ICV, intraperitoneale, directe placenta en IV infecties zijn gebruikt om de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. Gefocusseerd op het ICV en IV injectie modellen van neonatale muizen voor de eenvoud van de procedure en het voordeel van directe injectie van deeltjes in het doelgebied. Hoewel intraperitoneale infectie is een eenvoudige methode, virusdeeltjes verspreid systemisch via een indirect proces 5,24. Direct placenta infectie is een goede methode embryonale systemische infectie ...

Bij het bestuderen virale encefalitis, de initiële verdeling van virale deeltjes is zeer belangrijk om ziekte pathogenese begrijpen en virale targets te identificeren in de hersenen. De meeste virussen variëren in grootte van 20 tot 300 nm, hoewel de Pandoravirus meer dan 700 nm in grootte 1. De verdeling van de virale deeltjes in de acute fase van de infectie kan afhangen van de grootte van de deeltjes, de verdeling van cellulaire receptoren, of de affiniteit van de cellulaire receptoren voor virussen. In diermodellen, intracerebroventriculair (ICV), intraperitoneale, directe placenta en intraveneuze (IV) zijn infecties gebruikt voor de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. ICV inoculatie met virus wordt vaak gebruikt om het centrale zenuwstelsel (CNS) infecties bij muizen vastgesteld. Studies met deze techniek melden wijdverspreide infectie, met name cellen in de periventriculaire gebieden en in gebieden van de hersenen in direct contact met de cerebrospinale vloeistof (CSF), similar de effecten van virale ventriculoencephalitis. De geringe omvang van adeno-geassocieerd virus (AAV) deeltjes (20 - 25 nm in diameter) vergemakkelijkt de verspreiding gehele hersenen ICV infecties 2-4. Intraperitoneale 5, directe placenta 6, en IV injecties 7 vertegenwoordigen hematogenic systemische toediening. De penetratie van virale deeltjes door de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kunnen zij het ​​parenchym van de hersenen neonatale bereikt, die diffuus microgliacellen knobbeltjes 8,9. Cytomegalovirus (CMV) is een veel voorkomende virus dat behoort tot de herpes virus familie. In de Verenigde Staten, 50% - heeft 80% van de mensen CMV-infectie hadden door de leeftijd 40. CMV-infecties zijn zelden schadelijk, maar kan ziekten bij immuungecompromitteerde patiënten en foetussen veroorzaken. Van alle leveringen, 0,2% - 2% worden geboren met een CMV-10, wat resulteert in ernstige symptomen zoals microcefalie, periventriculaire verkalking, cerebellaire hypoplasie, microogontsteking, en de oogzenuw atrofie 11,12. Bovendien, mentale retardatie, perceptief gehoorverlies, visuele gebreken, beslaglegging, en epilepsie komen voor in ongeveer 10% van de niet-dodelijk-CMV-geïnfecteerde zuigelingen 13,14. CNS dysfunctie is de meest voorkomende kenmerkende symptoom van CMV aangeboren afwijking. Meer kinderen worden permanent elk jaar uitgeschakeld door congenitale CMV dan door het syndroom van Down, foetaal alcohol syndroom, of spina bifida 15. Er zijn geen vaccins tegen CMV beschikbaar op dit opgeroepen tot een behoefte aan een veilig en effectief vaccin. Het bestuderen van de interactie van CMV deeltjes met hun receptoren in de eerste fase van de infectie is belangrijk om het effect van vaccinatie begrijpen. Ventriculoencephalitis en diffuse microglia knobbeltjes zijn de twee belangrijkste pathologische kenmerken van CMV encefalitis 16. Het is onzeker hoe de CMV deeltjes (150-300 nm) verspreid door de hersenen in de acute fase van de infectie eennd hoe de verdeling van cellulaire receptoren en hun affiniteit voor virussen dragen tot de virale verspreiding. Kawasaki et al. Geëvalueerd ICV en IV infecties vanuit de verdeling van deeltjes en hun receptoren (β1 integrine) in de eerste fase van de infectie. We hebben gevonden dat de verspreiding van CMV deeltjes en de expressie van β1 integrine goed gecorreleerd in de vroegste fase van de infectie in zowel ICV en IV infecties 8. ICV-infectie is een model van ventriculoencephalitis en IV-infectie is een model van diffuse microglia knobbeltjes. Het bestuderen van de dynamica van virale of fluorescerende deeltjes nuttige informatie opleveren over het effect van deeltjesgrootte, virale interacties met cellulaire receptoren, en het mechanisme van BBB penetratie in de hersenen geven. Het volgende protocol kan worden gebruikt om een ​​virale infectie en virale vector in het CZS te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescerende Polystyreen Nile Red 0,04 - 0,06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescerende Polystyreen Nile Red 0,1 - 0,3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescerende Polystyreen Nile Red 1,7 - 2,2</td><td>Spherotech, inc.&nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% muis serum</td><td>DAKO&nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muis</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR muis</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gemodificeerde Microliterspuit (7000 Serie)</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35-gauge naald</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>citraat buffer (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Dextraansulfaat natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's Solution (50x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Gist tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muis CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&nbsp; Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virusdeeltjes en tl microkralen in de neonatale brain

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In het onderzoek naar de pathogenese van virale encefalitis, de infectie werkwijze kritisch. De eerste van de twee besmettelijke routes naar de hersenen de hematogene route, die infectie van de endotheelcellen en pericyten van de hersenen betreft. De tweede is de intracerebroventriculaire (ICV) route. Eenmaal binnen het centrale zenuwstelsel (CNS), kunnen virussen verspreiden naar de subarachnoïdale ruimte, meninges, choroidea plexus en via de cerebrospinale vloeistof. In experimentele modellen, zijn de vroegste stadia van CNS virale verspreiding niet goed gekarakteriseerd, en het is onduidelijk of alleen bepaalde cellen eerst geïnfecteerd. Hier hebben we de verdeling van cytomegalovirus (CMV) deeltjes geanalyseerd tijdens de acute fase van de infectie, genaamd primaire viremie na ICV of een intraveneuze (IV) injectie in de neonatale muizenhersenen. In de ICV injectie model, 5 pl van muizen CMV (MCMV) of fluorescente microbolletjes werden geïnjecteerd in het laterale ventrikel op de midpoint tussen het oor en oog met behulp van een 10-ul spuit met een 27 G naald. In de IV injectie model, een 1-ml spuit met een 35 G naald werd gebruikt. Een transilluminator werd gebruikt om de oppervlakkige temporale (gezichts) ader van de neonatale muis visualiseren. We toegediend 50 pl MCMV of fluorescerende microbolletjes in de oppervlakkige temporale ader. De hersenen werden geoogst op verschillende tijdstippen na de injectie. MCMV genomen werden gedetecteerd met de in situ hybridisatie methode. Fluorescente microbolletjes of groen fluorescent eiwit recombinant MCMV deeltjes werden waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Deze technieken kunnen worden toegepast op vele andere pathogenen aan de pathogenese van encefalitis onderzoeken.

Bij onderzoek naar de pathogenese van virale encefalitis, de infectie werkwijze belangrijk. De hematogene route vertegenwoordigt een acute infectie van de endotheelcellen en pericyten van de hersenen, terwijl de ICV route vertegenwoordigt een acute infectie zich via het CB door de subarachnoïdale ruimte, tot aan de hersenvliezen en choroid plexus. De eerste verdeling van deeltjes in acute encefalitis, in situ hybridisatie detectie van de MCMV genomen en directe observatie van M3...

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virale deeltjes of fluorescente microbeads in de neonatale muizenhersenen. Het lokalisatiepatroon van het virus en de nanodeeltjes kan worden gedetecteerd door microscopische evaluatie of door in situ hybridisatie.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de distributie van virale deeltjes tijdens de acute fase van de infectie in het centrale zenuwstelsel te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neurovirologie, zoals de manier waarop virusdeeltjes zich verspreiden in het onrijpe centrale zenuwstelsel tijdens de acute infectiefase.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de initiële distributie van virale deeltjes direct met een microscoop kan worden waargenomen met behulp van twee eenvoudige methoden, zoals intercerebroventriculaire en intravasculaire injectie. Begin met het steriliseren van een spuit van 10 µL en een naald met maat 27 met 70% alcohol.Laad vervolgens vijf µL van de murine cytomegalovirus-injectieoplossing of fluorescerende microbeads in de naald door de zuiger van de spuit voorzichtig naar achteren te trekken. Nadat een PO.5 neonatale muis is geanestheseerd en geïmmobiliseerd door deze drie tot vier minuten op ijs te plaatsen, wordt de diepte van de anesthesie bepaald met de methode van de teenknijprespons. Markeer de injectieplaats op de geanestheseerde muis met een niet-toxische laboratoriumstift op een l

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Dit artikel legt uit twee zeer verschillende methoden voor injectie: 1) in de hersenen (intracerebroventriculaire) en 2) systemische (intraveneus) op de therapeutische middelen te introduceren in het centrale zenuwstelsel van neonatale muizen.

Levering van therapeutische middelen door intracerebroventriculaire (ICV) en intraveneuze (IV) injectie in Muizen

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Source: Smit, R. D., et al. Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the targeted delivery of viral vectors to corticospinal neurons in a neonatal rat. The protocol enables precise gene expression using anterograde and retrograde viral injections, facilitating research on neural regeneration and plasticity following spinal cord injury.

Targeted Viral Delivery to Corticospinal Neurons in a Neonatal Rat to Study Spinal Cord Injury

This video demonstrates the intracerebroventricular injection process for studying murine cytomegalovirus (MCMV) distribution in the neonatal mouse brain. MCMV, engineered to express an enhanced green fluorescent protein (EGFP) for visibility, is injected into the lateral ventricle of a mouse pup's brain. The injected virus circulates through the cerebrospinal fluid, infecting cells in the periventricular region, including the marginal zone, choroid plexus, and subventricular zone.

An Intracerebroventricular Injection to Analyze Murine Cytomegalovirus Distribution in a Neonatal Mouse Brain

Human cytomegalovirus (HCMV) infectie van pasgeborenen is een belangrijke oorzaak van mentale retardatie, maar de moleculaire gebeurtenissen die tot virus-geïnduceerde pathogenese zijn nog steeds slecht begrepen. Om de dynamiek van de hersenen infectie te onderzoeken, hebben we aangepast...

Gebruik van<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging aan de progressie van de Experimentele Mouse Cytomegalovirusinfectie in Pasgeborenen Monitor

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Diermodellen van pediatrische ziekte vroeg begin en agressieve ziekteprogressie ervaren. Klinisch relevante afgifte van therapie aan jonge muismodellen kan zijn technisch moeilijk. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve werkwijze voor intraveneuze injectie pasgeboren muizen binnen de eerste twee dagen postnatale leven.

Intraveneuze injecties in pasgeboren muizen

Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Leer intracerebroventriculaire en intravasculaire injectietechnieken voor neurovirologisch onderzoek bij neonatale muizen. Deze methode maakt directe observatie van virale verspreiding mogelijk tijdens de acute infectiefase in het centrale zenuwstelsel.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

Meer video's verkennen