subtypering van Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

Het algemene doel van deze massaspectrometrische procedure, MSPP of Mass Spectrometry-based PhyloProteomics genaamd, is om bacteriën te onderscheiden op stamniveau. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van microbiologie, epidemiologie en hygiëne. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om uitbraaksituaties te analyseren door fyloprotomicsgerelateerde verwantschappen te visualiseren.

In vergelijking met andere typeringsmethoden is MSPP goedkoop per monster en zeer snel. Nosocomiale infecties zijn een steeds belangrijker probleem, en we hopen dat ons MSPP-schema kan worden uitgebreid naar epidemiologisch typeren van andere bacteriën, of zelfs schimmels. Ons MSPP-schema geeft inzicht in de verwantschap van stammen, dus voor het voorspellen van relevante fenotypes, zoals geneesmiddelresistentie, of zelfs virulentie, is het zinvol om het toe te passen waar deze fenotypes correleren met specifieke genotypen.

Om met deze procedure te beginnen, bereid twee buisjes matrixoplossing voor door 2,5 milligram HCCA op te lossen in 250 microliter van een organisch oplosmiddelmengsel, een 50%isonitril. Voeg recombinant humaan insuline toe als interne calibratie aan een van hen, dan 47,5% gedestilleerd water en 2,5% trifluorazijnzuur. Verspreid vervolgens een speldkopgrootte hoeveelheid van een kolonie van de referentiestam rechtstreeks op een maldi-doelplaat.

Plaats voor bepaling van de exacte massa van de calibratiepiek een microliter van de teststandaard op een andere plek. Bedek elke plek van bacteriën en standaard met 1 microliter van HCCA gespikte matrixoplossing en laat ze kristalliseren bij kamertemperatuur. Herhaal voor elke te analyseren stam de bereiding van het uitstrijkje.

Bedek elke plek met 1 microliter gespikte HCCA-matrixoplossing en laat kristalliseren bij kamertemperatuur. Als alternatief kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit moeilijk te liggen cellen. Hiervoor oogst u ongeveer 5 kolonies van een Agar plaat cultuur met een inoculatiestaafje.

Suspendeer ze in 300 microliter gedestilleerd water in een 1,5 milliliter reactiebuis en meng ze grondig door herhaald pijpetten totdat de bacteriekolonies volledig gesuspendeerd zijn. Voeg vervolgens 900 microliter absoluut ethanol toe en meng. Centrifugeer het monster bij 13.000 g's gedurende 1 minuut.

Na het drogen van het pellet, resuspendeer het door op en neer te pipetten in 50 microliter 70%mierenzuur. Voeg vervolgens 50 microliter aceto-nitril toe en meng. Verwijder de puinhopen door centrifugatie bij 13.000 g's gedurende 2 minuten.

Nadat u klaar bent, breng 1 microliter van het supernatant over naar een monsterpositie op een maldi-doelplaat. Laat het monster drogen, bedek vervolgens elke plek met een microliter HCCA-matrixoplossing en laat kristalliseren bij kamertemperatuur. Voer op dit punt MALDI-TOF-analyse uit door 600 spectra te verzamelen in stappen van 100 schoten voor elke plek.

Klik eerst op het automatisch uitvoeren tabblad in de configuratiesoftware van de massaspectrometer. Open de methode door met de linkermuisknop op de methodeknop te klikken en de methode te kiezen uit het vervolgkeuzemenu. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de bewerkknop om de auto execute methode editor te openen.

Stel onder het tabblad accumulatie de voldoende schootswaarde in op 100 en de somwaarde op 600. Kies voor elk spectrum de calibratiepiek uit de lijst, klik op 'automatisch toewijzen' en druk op 'OK'. Na het verkrijgen van massaspectra van elke plek, bepaal experimenteel de exacte massa van de calibratiepiek, door een spectrum te openen met de spectrumbrowser en de piek te vinden bij de verwachte massa in vergelijking met een spectrum zonder calibratie. Controleer of de calibratiepiek niet wordt verduisterd door een andere biomarker van de geïnteresseerde organisme.

Bereken vanuit de genoomsequentiegegevens van de referentiestam het theoretische mono-isotopische molecuulgewicht van elk van de gecodeerde eiwitten door de DNA-sequentie te vertalen in de corresponderende aminozuursequentie. Upload bestand'of kopieer en plak'deze eiwitsequentie in het invoervak van het juiste bioinformaticaresourcepaneel en bereken het theoretische iso-elektrische punt en molecuulgewicht. Kopieer de resultaten in een spreadsheet met één kolom die de genidentificator bevat en een andere kolom met het molecuulgewicht.

Sorteer de rijen op berekend molecuulgewicht, om het opzoeken van massa's te vergemakkelijken. Voeg een extra kolom toe aan de spreadsheet voor het molecuulgewicht van de demethianinated vorm, door 135 dauttons af te trekken van het mono-isotopische molecuulgewicht. Wijs elke belangrijke gemeten biomarkermassa toe aan de berekende massa's van de referentiestam, door de gemeten massa op te zoeken in de genoomtabel.

In een andere spreadsheet, noteer de massa en identificatie voor elke biomarker-ion. Calibreer nu de massaspectra verkregen van de verzamelde isolaten zoals gedaan voor de referentiestam. Voor één isolaat per rij, identificeer variant biomarkers in de massaspectra, noteer de gemeten massa voor elke biomarker en de voorspelde isovorm in de respectieve kolommen.

Het MALDI-TOF massaspectrum van C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 bevat 14 enkelvoudig geladen biomarker-ionen die konden worden geïdentificeerd door vergelijking van de berekende moleculaire massa's met het referentiespectrum. Binnen de verzameling werden variabele isovorms gedetecteerd voor L32 zonder methionine, L33 en het hypotetische eiwit gecodeerd door gil152939117, S20 M en S15 M.De resterende massa's toegewezen aan biomarker-ionen waren onveranderlijk in de geteste isolaten. De aminozuursubstitutie die overeenkomt met de massaverschuiving is geïdentificeerd door PCR-amplificatie en Sanger-sequencing van het specifieke gen met behulp van de hier vermelde primers.

De aminozuursequenties van alle biomarker-ionen die in het MSPP-schema zijn opgenomen, evenals de gedetecteerde allelische isovorms, worden hier aangegeven. De MLST-gebaseerde UPGMA dendrogram geconstrueerd uit de onderzochte C jejuni subspecies doylei isolaten, toont dat elk isolaat behoort tot een verschillend MLST-sequentietype. En stam LMG7790 heeft de langste fylogenetische af