Name: subtypering van Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer hoe MSPP Campylobacter jejuni ssp. doylei isolaten subtypt voor microbiologisch en epidemiologisch onderzoek. Deze snelle, kosteneffectieve methode vervangt traditionele MLST-technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Hannah Kleinschmidt dankbaar voor uitstekende technische ondersteuning. Dit artikel werd gefinancierd door het Open Access-ondersteuningsprogramma van de Deutsche Forschungsgemeinschaft en het publicatiefonds van de Georg August Universität Göttingen.

<ol><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li>
<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+multilocus+sequence+typing-based+Campylobacter+jejuni+subgroups+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> BMC Microbiol. 13, 247(2013).</li>
<li>Reil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Clostridium+difficile+PCR-ribotypes+001%2C+027+and+126%2F078+using+an+extended+MALDI-TOF+MS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).</li>
<li>Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004(2012).</li>
<li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li>
<li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li>
<li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+biomarker+discovery+for+identification+of+methicillin-resistant+and+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+strains+by+MALDI-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF.</a> Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).</li>
<li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+%28ST131%29+and+D+%28ST69%2C+ST405%2C+ST393%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li>
<li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li>
<li>Christner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+Strain+Typing+during+a+Large+Outbreak+of+Shiga-Toxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (7), e101924(2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-based+PhyloProteomics+%28MSPP%29%3A+A+novel+microbial+typing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/">http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/</a> (2013).</li>
<li>Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+a+brief+overview+on+pathogenicity-associated+factors+and+disease-mediating+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+campylobacteriosis+and+relevant+post-infectious+sequelae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+-+The+Search+for+virulence-associated+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+Fur+Lebensmittelhygiene%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors.</a> Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+system+for+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni.</a> J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Campylobacter+jejuni+clones%3A+a+basis+for+epidemiologic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).</li>
<li>Cody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genomic+epidemiological+evaluation+of+human+Campylobacter+isolates+by+use+of+whole-genome+multilocus+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing.</a> J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).</li>
<li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA6%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).</li>
<li>Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mlstdbNet+-+distributed+multi-locus+sequence+typing+%28MLST%29+databases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases.</a> BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).</li>
<li>Verroken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nocardia+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species.</a> J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).</li>
<li>El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+Identification+of+Mycobacteria+in+Routine+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice.</a> PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).</li>
<li>Goujon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioinformatics+analysis+tools+framework+at+EMBL-EBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.</a> Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).</li>
<li>Hall, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioEdit%3A+a+user-friendly+biological+sequence+alignment+editor+and+analysis+program+for+Windows+95%2F98%2FNT%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.</a> Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).</li>
<li>Jolley, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+multilocus+sequence+typing%3A+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li>
<li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li>
<li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li>
<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stap in de oprichting van een MSPP regeling is de ondubbelzinnige genetische bepaling van biomarkers ion identiteiten. Als het niet mogelijk is om een biomarker ongetwijfeld identificeren, dan moet worden uitgesloten van de regeling 13. De C. jejuni ssp. doylei project omvat 14 verschillende biomarker ionen. Dit zijn 5 minder in vergelijking met de C. jejuni ssp. jejuni MSPP regeling 13 .De belangrijkste verschil tu...

Tijdens het laatste decennium, heeft-MALDI time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) gevorderd tot een zeer gewaardeerd standaardmethode voor microbiële geslacht en soort identificatie in klinische microbiologie 1, 2 zijn. Soortidentificatie is gebaseerd op de registratie van kleine eiwit vingerafdrukken van intacte cellen of cellysaten. De typische massabereik voor een massaspectrometer gebruikt in routine klinische microbiologie is 2-20 kDa. Bovendien kan de resulterende spectra worden gebruikt om spanningen op de hiernavolgende-species en subspecies niveau beneden-3 discrimineren. Vroege baanbrekende studies hebben specifieke biomarker ionen geïdentificeerd voor een bepaalde subgroep van stammen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9 en Escherichia coli 10-12. De combinatie van verschillende variabele biomarker massa&#39;s die overeenkomen met allele isovormen biedt de mogelijkheid voor diepere subtypering. Eerder hebben we met succes een methode om deze variaties in de massa-profielen om te zetten in betekenisvolle en reproduceerbare phyloproteomic relaties genaamd massaspectrometrie gebaseerd phyloproteomics (MSPP) op een C. geïmplementeerd jejuni ssp. jejuni isolatencollectie 13. MSPP kan worden gebruik gemaakt van een massaspectrometrische gelijk aan DNA-sequentie gebaseerd subtypering technieken zoals multilocus reeks typen (MLST). Campylobacter soorten zijn de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastroenteritis wereldwijd 14, 15. Als gevolg van Campylobacteriose post-infectueuze sequela, namelijk Guillain Barré, reactieve artritis en inflammatoire darmziekte kunnen ontstaan 16. De belangrijkste bronnen van infectiebesmet vee vlees van kip, kalkoen, varkens, runderen, schapen en eenden, melk en oppervlaktewater 15, 17. Daarom regelmatig epidemiologische surveillance studies in het kader van de voedselveiligheid zijn noodzakelijk. MLST is de &quot;gouden standaard&quot; in moleculaire typering voor Campylobacter soorten 18. Omdat de Sanger-sequencing-gebaseerde MLST werkwijze is arbeidsintensief, tijdrovend en relatief duur is MLST typen beperkt tot relatief kleine isoleren cohorten. Daarom is er behoefte aan goedkopere en snellere subtypering methoden. Deze behoefte kan worden voldaan door massaspectrometrische methoden zoals MSPP. Dit document presenteert een gedetailleerd protocol voor MSPP-typering met behulp van een verzameling van Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolaten en vergelijking van het potentieel met MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 system</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>GT02554 G201</td><td>Mass spectrometer</td></tr><tr><td>bacterial test standard BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>263564</td><td>Software Package</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>8290190</td><td>5 tubes</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia agar base&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1.10455.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Compass for FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>251419</td><td>Software Package</td></tr><tr><td>defibrinated sheep blood&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>formic acid</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA matrix</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes paper tissue</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>259935</td><td>Software Package</td></tr><tr><td>Mast Cryobank vials</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 polished steel target</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human insulin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>water, molecular biology-grade</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtypering van<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde phyloproteomics (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS biedt de mogelijkheid om sommige bacteriën niet alleen op de soorten en ondersoorten niveau, maar ook onder, De stam differentiëren. Allelische isovormen van de detecteerbare biomarker ionen resulteren in isolate-soortelijke massa verschuivingen. Massa-spectrometrische phyloproteomics (MSPP) is een nieuwe techniek die de massaspectrometrische detecteerbare biomarker massa in een regeling die aftrek phyloproteomic relaties uit isolaat specifieke massaverschuivingen vergelijking met een genoom toelaat combineert sequentie referentiestam. De afgeleide aminozuursequenties worden vervolgens gebruikt om MSPP gebaseerde dendrograms berekenen. Hier beschrijven we de workflow van MSPP door het intikken van een Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolaat collectie van zeven stammen. Alle zeven stammen waren van menselijke oorsprong en multilocus volgorde typen (MLST) toonden hun genetische diversiteit. MSPP-typen resulteerde in zeven verschillende MSPP volgorde types, voldoende als gevolg van hun PHYlogenetic relaties. De C. jejuni ssp. doylei MSPP regeling omvat 14 verschillende biomarker ionen, vooral ribosomale eiwitten in het massabereik van 2-11 kDa. MSPP kan in principe worden aangepast aan andere massaspectrometrische platforms met een uitgebreid massagebied. Daarom is deze techniek heeft de potentie om een ​​nuttig instrument voor stamniveau microbiële typering worden.

Eerder hebben we met succes een MSPP regeling voor C. jejuni ssp. jejuni 13. Hier, hebben we geprobeerd om de methode uit te breiden tot de broer of zus ondersoort C. jejuni ssp. doylei. In deze specifieke setting, zeven C. jejuni ssp. doylei isolaten werden uit de Belgische collectie van micro-organismen / Laboratorium voor Microbiologie UGent BCCM / LMG Gent, België verworven. Alle zeven isolaten gebruikt voor de analyses...

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

subtypering van<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Het algemene doel van deze massaspectrometrische procedure, genaamd MSPP of Mass Spectrometry-based PhyloProteomics, is het subtyperen van bacteriën op stamniveau. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen te beantwoorden in de velden van de microbiologie, epidemiologie en hygiëne. Zo kan het worden ingezet om uitbraaksituaties te analyseren door de fyloproteomische verwantschap te visualiseren.Vergeleken met andere typeringsmethoden is MSPP goedkoop per monster en zeer snel. Nosocomiale infecties zijn een kwestie van toenemend belang, en we hopen dat ons MSPP-schema kan worden uitgebreid naar epidemiologische typering van andere bacteriën, of zelfs schimmels. Ons MSPP-schema biedt inzicht in de verwantschap tussen stammen, dus voor de voorspelling van relevante fenotypes, zoals drugresistentie of zelfs virulentie, is het zinvol om dit toe te passen waar deze fenotypes correleren met specifieke genotypen.Om deze procedure te starten, bereidt u twee buisjes matrixoplossing door 2,5 milligram HCCA op te lossen in 250 microliters van een organisch oplosmiddelmengsel, bestaande uit 50% isonitrile, 47,5% dubbel gedestilleerd water en 2,5% trifluorazijnzuur. Voeg aan één van deze buisjes recombinant menselijk insuline toe als interne kalibrator. Verspreid vervolgens een hoeveelheid van een kolonie van de referentiestam, ter grootte van een speldenknop, direct op een MALDI-targetplaat.Voor de bepaling van de exacte massa van de kalibratiepiek wordt één microliter van de teststandaard op een andere plek aangebracht. Bedek elke plek met bacteriën en standaard met 1 microliter HCCA-gespikeerde matrixoplossing en laat deze kristalliseren bij kamertemperatuur. Herhaal de preparatie van het uitstrijkje voor elke stam die geanalyseerd moet worden.Bedek elke spot met 1 µL van de gespikede HCCA-matrixoplossing en laat dit bij kamertemperatuur kristalliseren. Als alternatief kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit cellen die moeilijk plat te leggen zijn. Oogst hiervoor ongeveer 5 kolonies van een agarplaatcultuur met een inoculatielus.Suspendeer ze in 300 µL dubbel gedestilleerd water in een reactiebuis van 1,5 mL en meng ze grondig door herhaaldelijk te pipetteren tot de bacteriële koloniën volledig zijn gesuspendeerd. Voeg vervolgens 900 µL absolute ethanol toe en meng. Centrifugeer het monster bij 13.000 g gedurende 1 minuut.Nadat het pellet is gedroogd, wordt het opnieuw gesuspendeerd door het herhaaldelijk op en neer te pipetteren in 50 µL 70% mierenzuur. Voeg vervolgens 50 µL acetonitril toe en meng dit. Verwijder het debris door centrifugatie bij 13 000 g gedurende 2 minuten.Breng na voltooiing 1 µL van het supernatant over naar een monsterpositie op een MALDI-targetplaat. Nadat het monster is opgedroogd, wordt elke spot bedekt met 1 µL HCCA-matrixoplossing en laat men dit kristalliseren bij kamertemperatuur. Voer op dit punt de MALDI-TOF-analyse uit door 600 spectra te verzamelen in stappen van 100 shots per spot.Klik eerst op het tabblad 'auto execute' in de configuratiesoftware van de massaspectrometer. Open de methode door links op de methodeknop te klikken en de gewenste methode uit het uitklapmenu te selecteren. Klik vervolgens links op de bewerkingsknop om de editor voor de auto execute-methode te openen.Stel onder het tabblad 'accumulation' de waarde voor 'satisfactory shot' in op 100 en de waarde voor 'sum up' op 600. Kies voor elk spectrum de calibrantpiek uit de lijst, klik op 'automatic assign' en druk op 'OK'. Bepaal na het verkrijgen van massaspectra van elke spot experimenteel de exacte massa van de kalibratiepiek door een spectrum met de spectrumbrowser te openen en de piek bij de verwachte massa te zoeken in vergelijking met een spectrum zonder calibrant. Controleer of de calibrantpiek niet wordt overschaduwd door een andere biomarker van het betreffende organisme.Bereken op basis van de genoomsequencinggegevens van de referentiestam het theoretische monoisotopische molecuulgewicht van elk van de gecodeerde eiwitten door de DNA-sequentie te vertalen naar de overeenkomstige aminozuursequentie. Upload het bestand of kopieer en plak deze eiwitsequentie in het invoerveld van het betreffende bioinformatica-resourcepaneel en bereken het theoretische isoelektrische punt en molecuulgewicht. Kopieer de resultaten naar een spreadsheet met één kolom voor de gen-identificatie en een andere kolom voor het molecuulgewicht.Sorteer de rijen op berekend molecuulgewicht om het opzoeken van massa's te vergemakkelijken. Voeg een extra kolom toe aan de spreadsheet voor het molecuulgewicht van de gedemathianineerde vorm, door 135 daltons van het monoisotopische molecuulgewicht af te trekken. Wijs elke belangrijke gemeten biomarkermassa toe aan de berekende massa's van de referentiestam door de gemeten massa op te zoeken in de genoomtabel.Registreer in een ander spreadsheet de massa en de identificatie voor elk biomarker-ion. Kalibreer nu de massespectra die zijn verkregen uit de verzamelde isolaten, op dezelfde wijze als voor de referentiestam. Identificeer voor één isolaat per rij de variant-biomarkers in de massespectra en registreer de gemeten massa voor elke biomarker en de voorspelde isovorm in de respectievelijke kolommen.Het MALDI-TOF-massaspectrum van C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 bevat 14 enkelvoudig geladen biomarker-ionen die konden worden geïdentificeerd door vergelijking van de berekende moleculaire massa's met het referentiespectrum. Binnen de collectie werden verschillende isovormen gedetecteerd voor L32 zonder methionine, L33, en het hypothetische eiwit gecodeerd door gil152939117, S20 M, en S15 M. De overige massa's die aan biomarker-ionen werden toegewezen, waren onveranderlijk in de geteste isolaten. De aminozuursubstitutie die overeenkomt met de massashift is geïdentificeerd via PCR-amplificatie en Sanger-sequencing van het betreffende gen met gebruik van de hier vermelde primers.De aminozuursequenties van alle biomarker-ionen die in het MSPP-schema zijn opgenomen, evenals de gedetecteerde allelische isoformen, worden hier aangegeven. Het op MLST gebaseerde UPGMA-dendrogram, opgesteld uit de onderzochte C. jejuni subspecies doylei isolaten, laat zien dat elk isolaat tot een verschillend MLST-sequentietype behoort. Stam LMG7790 vertoont de grootste fylogenetische afstand.Zoals blijkt uit de MLST-analyse, heeft isolaat LMG7790 de grootste phyloproteomische afstand in de MSPP-analyse van de onderzochte C. jejuni subspecies doylei isolaten. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze binnen één dag worden uitgevoerd mits er correct wordt gewerkt. Tijdens het volgen van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de toxiciteit van sommige stoffen die tijdens het experiment worden gebruikt.Acetonitril kan bijvoorbeeld huidirritatie veroorzaken. Daarnaast kunnen, naast MSPP, andere methoden zoals DNA-sequencing worden uitgevoerd om verdere parameters te analyseren, zoals de aanwezigheid van resistentiegenen. De ontwikkeling van deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van de microbiologie om de fotogenie te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe MSPP werkt en hoe dit kan worden toegepast op specifieke vragen. Vergeet niet dat werken met virulente pathogenen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van S2-laboratoriumapparatuur, altijd moeten worden getroffen.

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Hoewel de ontlastingscultuur voor Campylobacter onnauwkeurig is, wordt het nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor identificatie. Methoden om de grens van detectie en overleving in transportmedia van C. jejuni in menselijke ontlasting te bepalen worden beschreven en vergeleken met een nieuwe immunoassay met een betere nauwkeurigheid.

Cultuurmethoden om de limiet van detectie en overleving in transportmedia van Campylobacter Jejuni in menselijke fecale specimens te bepalen

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Campylobacter is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastro-enteritis door voedsel. Ondanks het feit dat bedrijven maatregelen nemen om de prevalentie in hun faciliteiten te verminderen, bereiken besmette producten consequent de consument. De techniek die in de afgelopen twaalf jaar is ontwikkeld, richt zich op de beperkingen van bestaande methoden voor het isoleren en detecteren van Campylobacter spp. uit rauw vlees.

Detectie en isolatie van Campylobacter spp. uit rauw vlees

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Leer hoe MSPP Campylobacter jejuni ssp. doylei isolaten subtypt voor microbiologisch en epidemiologisch onderzoek. Deze snelle, kosteneffectieve methode vervangt traditionele MLST-technieken.

subtypering van

Meer video's verkennen